組織細胞學(xué)觀察研究方法課件

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第一章生物制片第一節(jié)前期準(zhǔn)備一、玻璃器皿的清洗：（一）生物學(xué)實驗使用的玻璃器皿及玻片均要清洗干凈,應(yīng)以壁面被水均勻潤濕而無水珠為標(biāo)準(zhǔn)。表1-1一般器皿的洗滌方法玻璃器皿可選用洗滌液及洗滌方法新購置未用過的器皿一般使用過的器皿沾有不溶物或刷洗不易達到的器皿沾有較多凡士林或其他油污的器皿沾有油脂物質(zhì)的器皿洗衣粉、洗滌劑煮洗，或重鉻酸鉀洗液浸洗30分鐘洗衣粉、洗滌劑刷洗重鉻酸鉀洗液浸泡先用二甲苯或汽油擦洗，再用濃堿或熱洗滌劑刷洗熱洗滌劑，或30~40%的堿液玻璃器皿經(jīng)洗滌液清洗后→自來水沖洗→蒸餾水沖洗→倒放于大張濾紙上晾干或玻璃儀器烘干器烘干。（二）洗液配法：重鉻酸鉀20g濃硫酸100ml清水100ml先將重鉻酸鉀溶于水中，在一滴滴加入濃硫酸，邊加邊攪拌，顏色為紅褐色放于玻璃容器內(nèi)可反復(fù)使用，一直到顏色變?yōu)樗{黑色為止。（三）新舊載玻片及蓋玻片的清洗：1．新的：2%鹽酸酒精（95%酒精100份加濃鹽酸2份）浸泡幾個小時→流水沖洗干凈→95%酒精中待用。2.舊的：沒用樹膠封片的：洗衣粉煮沸5-10分鐘→清水沖洗→洗液30分鐘→流水沖洗→蒸餾水洗凈→95%酒精中待用。3.樹膠封片的玻片：二甲苯浸泡、洗凈→95%酒精中待用。二、溶液的配制：（一）百分比濃度:質(zhì)量百分比濃度。即100g溶液中所含溶質(zhì)的克數(shù)。1.稀溶液的配置：例1：1%的番紅水溶液—即將番紅1克溶解于100ml的蒸餾水中。例2：0.1%固綠酒精溶液—即將固綠0.1克溶解于100ml的95%酒精中。2.濃溶液的配置：配置高濃度的溶液，應(yīng)在100ml的水中減去溶質(zhì)重量的水。例：15%NaCL稱取15gNaCL,溶于85ml水中。（二）摩爾濃度：1升溶液中所含溶質(zhì)的mol數(shù)。用M表示。例：配制500ml2MNaCO3溶液稱取2×106×0.5=106gNaCO3溶于500ml水中。（三）當(dāng)量濃度：1升溶液中所含溶質(zhì)的克當(dāng)量數(shù)。用N表示。當(dāng)量（E）與分子量（MW）的關(guān)系：E=MW/n其中酸的n為酸分子中可被金屬取代的氫原子數(shù)堿的n為堿分子中金屬的原子價鹽類的n為鹽分子中金屬的原子數(shù)乘金屬的原子價如：HNO3的當(dāng)量=63/1=63 H2SO4的當(dāng)量=98/2=49Ca(OH)2的當(dāng)量=74/2=37Al2(SO4)3的當(dāng)量=342/2*3=57一般溶液的配制用燒杯、量筒；準(zhǔn)確溶液的配制用容量瓶。(四)酒精稀釋法（交叉稀釋法）：95%酒精→83%酒精先在量筒中加入83ml95%酒精,再加水至95ml即得。95%酒精→70%酒精先在量筒中加入70ml95%酒精,再加水至95ml即得。95%酒精→50%酒精先在量筒中加入50ml95%酒精,再加水至95ml即得。95%酒精→35%酒精先在量筒中加入35ml95%酒精,再加水至95ml即得。（五）常用液態(tài)酸的配置：

表1-2常用液態(tài)酸的配制酸名分子量比重酸濃度（%）摩爾濃度(mol/L)配制1M所需溶質(zhì)的量（ml）鹽酸硝酸硫酸磷酸高氯酸冰醋酸36.4663.0298.0898.0100.5060.031.191.421.841.691.671.0636.069.596.085.070.099.511.715.617.9514.711.6517.685.564.155.768.085.856.8三、制定實驗計劃：制定計劃時首先要考慮到制片的目的，其次是選擇制片的標(biāo)本，最后才是確定具體的制作方法。例如制玉米莖的橫切面，其目的在于觀察維管束的結(jié)構(gòu)，那么就應(yīng)選擇老的莖作標(biāo)本。又如作某一種葉子的生態(tài)解剖，所選擇的標(biāo)本就不應(yīng)該再同一地點，應(yīng)在不同環(huán)境條件下多采集幾份，才好做比較。由此可見制片的目的與標(biāo)本選擇有密切聯(lián)系，有時甚至二者是需要同時決定的。最后可根據(jù)目的要求及所選擇的標(biāo)本確定具體制片的方法。一般講，制片技術(shù)的方法雖然很多，但對某一材料來說可能多不是十全十美的。因此我們在制定計劃時，不妨多采用幾種方法，以便比較。同時也要注意經(jīng)濟原則。方法確定后，在計劃中還需將所用的藥品、用具等名稱及數(shù)量逐一列出，然后在定出具體的工作日程。制訂試驗計劃需要比較豐富的知識和經(jīng)驗，所以在訂計劃之前，必須要閱讀參考文獻，深入鉆研。初學(xué)者可在有經(jīng)驗的老師指導(dǎo)下制訂出比較完善和精密的實驗計劃。（四）日程與記錄：制片是一個連續(xù)的過程，從標(biāo)本的采集、固定、切片、染色到封藏為止，往往要連續(xù)幾天，如果事前沒有工作日程、就會造成混亂。除編排日程表外，還必須將工作過程中的實際情況連同日程表都詳細的記載在記錄本上。這樣可根據(jù)結(jié)果檢查實際工作中的問題所在，總結(jié)失敗原因，也可以總結(jié)成功的經(jīng)驗。所以日程表和詳實地記錄對制片工作來說，是一件非常重要而且必須長期堅持的工作。這些記錄不僅要詳實，而且還要作為檔案保存起來。

表1-3制片記錄表材料固定液、固定時間沖洗脫水酒精時間透明1/2純酒精+1/2二甲苯時間浸蠟包埋切片厚度染色封藏結(jié)果備注

第二節(jié)生物制片分類生物制片的分類:切片法:1.徒手切片:盡量切薄,切一層細胞,此法多用于植物切片的臨時觀察。2.石蠟切片：4-12μm厚，用石蠟浸透到組織中，并包埋組織，用旋轉(zhuǎn)切片機把蠟塊切成薄片。3.半薄切片：0.5-1μm厚，用樹脂包埋。用途:在光鏡下觀察盡量薄；為超薄切片定位，因為其制片技術(shù)和超薄切片一致。4.冰凍切片：使組織內(nèi)部及周圍的水份結(jié)冰，組織變硬，然后用切片機切成薄片，制成切片，此法制作步驟少，用時短，不經(jīng)脫水和透明，故對脂類無影響。常用于臨床快速病理分析。5.木材切片：10-20μm厚，很硬，需軟化，用50%酒精：甘油=1：1軟化幾天，滑行切片機切。6.火棉膠切片：用火棉膠包埋組織，滑行切片機切成薄片，主要用于大塊組織切片。（二）非切片法:1.整體裝片法：對于小的動植物體或較大動植物體的一部分，不經(jīng)切片而直接制成玻片的方法。如昆蟲口器、水螅、藻類、植物葉、莖表皮細胞。2.涂片法：對于流動和半流動的材料，不能切片，而直接將材料涂成玻片標(biāo)本，干燥后進行固定、染色及封固。如血液、細菌、骨髓。如圖1-1。3.壓片法：將一些柔軟的材料置于載玻片上，蓋上蓋玻片，用一定的壓力將標(biāo)本壓碎或壓開，制成玻片的方法。如洋蔥根尖染色體觀察，果蠅唾腺染色體觀察。4.伸展法：一些成膜狀結(jié)構(gòu)的標(biāo)本，使它展平放在載玻片上，撕開、展平制成鋪片標(biāo)本，待干燥后經(jīng)固定、染色后制成玻片標(biāo)本的方法。常用于疏松結(jié)締組織、神經(jīng)等柔軟組織或腸系膜等薄層組織。如圖1-2。5.磨片法：主要用于含有鈣鹽等礦物質(zhì)，成份堅硬的材料，如脊椎動物的牙齒、骨等用磨石磨成薄片，再封固成玻片。如圖1-3。6.分離法：為了觀察研究組織或器官里的單個細胞或纖維的形狀，必須設(shè)法使細胞與細胞間質(zhì)分離，細胞便各自分離開來，再經(jīng)染色制成玻片標(biāo)本的方法叫分離法。一般分為化學(xué)分離法和撕碎法兩種。如神經(jīng)細胞分離裝片，平滑肌細胞分離裝片。圖1-1涂片法圖1-2展片法圖1-3磨片法

第三節(jié)石蠟切片石蠟切片過程：取材→固定→沖洗→脫水→透明→浸蠟→包埋→切片→貼片→脫蠟→染色→脫水→透明→封藏一、取材：（一）生物組織取材的注意事項：1.取材應(yīng)遵循準(zhǔn)確、典型、完整、適時的原則。2.研究正常結(jié)構(gòu)應(yīng)選取健全而又有代表性的部分取材，采取病理材料時，除取病理部位外，還應(yīng)選取正常部位，以利于對照觀察。3.取材前，要根據(jù)要求選擇并配制好固定液，取材后，立即投入固定液中，以防組織自溶和腐敗。4.切取材料時，刀必須銳利，動作要快且仔細，切割時切勿拉鋸式的來回切取，鑷取也應(yīng)輕拿輕放，避免材料的損壞。5.取材要詳細記錄日期、采集地點、標(biāo)本名稱、取材部位、斷面和所用固定液等。（二）植物材料的取材：1.固定前對材料要進行切割：原因：（1）為了固定更容易為保證下一步固定材料能迅速的殺生和固定，務(wù)必使各細胞立刻停止生命活動，而不使原生質(zhì)有崩解的現(xiàn)象。普通應(yīng)用的固定液對于植物體外表面的角質(zhì)、木栓質(zhì)等的穿透很慢，但對于被切割的表面，則穿透速度快很多。所以，我們在固定材料的時候，應(yīng)將所需要的部分分割到最小塊、段或片、以達到立刻殺生與固定的目的。（2）石蠟塊也有一定限制，一般（5-6mm）。2.切割面一般分為兩類：（1）橫切面：使用刀橫越根、莖的橫斷面的切面，橫切片可觀察材料自外向內(nèi)的各種組織。（2）縱切面：刀的切向與根、莖的長軸方向平行的切面，這種切面又分為兩種：①半徑切面：以刀穿過中心點與其半徑吻合的切面，這種切面可觀察到莖中各種組織縱走的情形及髓的排列、厚度等。②切線切面：以刀沿植物體的表面與其半徑成直角所切的切面。3.不同材料的切割方法（1）葉片：葉片寬小于1cm,可沿主脈橫切3-5mm葉片寬大于1cm,可分割成許多片，選其中含主脈和側(cè)脈的固定，一般5-7mm2方塊。（2）圓柱形材料：直徑小于2mm，有角質(zhì)層的，切2mm厚。無角質(zhì)層的，固定液穿透容易，切5-10mm厚。直徑大于等于5mm，切5mm厚。直徑大于10mm,切2-5mm（3）木質(zhì)小枝：直徑小于5mm，切成木條和大枝：直徑較大的,切成2-3c（三）動物取材：活體直接取材、麻醉后取材、處死后取材。無論采取那種處死方法，多應(yīng)避免由于痛苦引起掙扎，而造成組織結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，同時取樣必須迅速，越快越好。因為動物一旦死亡，細胞便開始自溶。二、固定（fixation）:細胞生命現(xiàn)象的突然終結(jié)，并保持生活狀態(tài)的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。（一）固定的目的和作用：1.可以防止細胞自溶和腐敗，在整個制片過程中保存細胞內(nèi)的各種內(nèi)含物。2.增強細胞對各種濃度滲透壓的抵抗能力。3.可使細胞成份沉淀和凝固，因而產(chǎn)生不同的折射率，造成光學(xué)上的差異，使得原來看不清楚的一些結(jié)構(gòu)清晰起來。4.有些固定劑可使細胞各部分容易染色。（二）作為固定液的條件：1.對組織細胞滲透能力強，立即將細胞殺死。2.細胞內(nèi)含物不能發(fā)生變化。（不能是細胞內(nèi)某些成份的溶劑。）（酒精是脂類物質(zhì)的溶劑，所以單獨使用時收到一定的限制。酒精不適宜作膜結(jié)構(gòu)觀察的固定劑）3.盡可能避免組織或細胞膨脹或收縮。4.有利于增加細胞內(nèi)含物的折光程度，增加媒染作用或染色能力。5.使材料適當(dāng)變硬，并具有一定的堅硬性便于切片。（三）按固定的方式將固定液分為兩類：凝結(jié)型固定液：使蛋白質(zhì)凝固，形成懸浮顆粒網(wǎng)狀混合液。非凝結(jié)型固定液：不使蛋白質(zhì)凝固，形成透明的凝膠。苦味酸、升汞、鉻酸、碘均能使胞質(zhì)蛋白和核蛋白凝固；酒精能沉淀胞質(zhì)蛋白，而核蛋白沉淀后溶于水；醋酸不能凝固胞質(zhì)蛋白但能凝固核蛋白;福爾馬林、鋨酸、重鉻酸鉀對兩種蛋白都不凝固。1.凝結(jié)型固定液：（1）酒精:(alcohol)70%-75%酒精滲透力最強。特點：①穿透速度快。②可沉淀白蛋白、球蛋白和核蛋白，前兩者所生成的沉淀不溶于水，核蛋白所生成的沉淀溶于水；所以經(jīng)乙醇固定的標(biāo)本對核的染色不良，不適于對染色體的固定。③濃度50%以上的酒精可溶解脂肪和類脂體。不能用于膜結(jié)構(gòu)的研究，溶解血色素，破壞其他多種色素，所以不能用于脂肪、類脂類和色素的固定。一般用于組織學(xué)觀察。④使糖原沉淀，但能溶于水。⑤是還原劑，在混合固定液中，酒精不能與氧化固定液混用。如鉻酸、鋨酸、重鉻酸鉀等。⑥使材料硬化、組織收縮明顯。⑦固定材料適宜濃度為70%-100%。固定后不需沖洗，70%的酒精可較長時間保存，若長期保存材料與甘油等量混合后使用。70%酒精：甘油=1：1（2）醋酸（aceticacid）特點：①穿透力速度極快。②能固定核蛋白，對胞質(zhì)也存在固定作用。對核蛋白是凝結(jié)型固定液，對胞質(zhì)是非凝結(jié)型固定液。使染色質(zhì)和染色體的固定和染色均很好，因此所有固定染色體的固定液中幾乎都有醋酸。③對脂類和糖類無固定作用。④酸性⑤對材料不但不硬化還有軟化作用。對細胞無收縮作用，稍有膨脹作用?？煞乐蛊渌巹┤缫掖肌⒓兹?、鉻酸等引起組織收縮。⑥固定后不需沖洗，可直接投入70%的酒精中保存。⑦固定材料適宜濃度為0.3%-5%。（3）鉻酸（chromicacid）特點：①穿透速度緩慢。②能沉淀所有蛋白質(zhì)，凝固核酸，增強核的著色能力，可作為核蛋白核核酸的固定液。能固定高爾基體及線粒體。常用于細胞學(xué)觀察。③只有鉻酸能真正固定肝糖原，使之不溶于水。對脂類無影響；④氧化劑，不能與酒精混用。固定后投入酒精前必須用流水沖洗，直至組織中不含鉻酸為止，如沖洗不干凈或直接投入酒精中，被還原成綠色的氧化鉻并發(fā)生沉淀，使染色困難。⑤使組織硬化，細胞收縮。⑥鉻酸常配成2%或10%的水溶液作為儲備液，固定適宜濃度為0.5%-1%。（4）苦味酸（picricacid）三硝基苯酚，不能結(jié)晶保存，要以飽和溶液存放。干燥時易爆炸。特點：①穿透速度中等。②可沉淀一切蛋白質(zhì)。對脂類無影響，對糖類無固定作用。③細胞收縮明顯，材料硬化程度很小。④固定后不需沖洗，可直接投入70%酒精中洗去黃色。⑤固定材料適宜濃度為飽和溶液，即0.9%-1.2%。2.非凝結(jié)型固定液：（質(zhì)量較好）（1）鋨酸（OsO4）特點：①穿透速度很慢。材料要切的小一些，約1mm3。②不沉淀蛋白質(zhì)，能使蛋白質(zhì)被均勻固定，所以用鋨酸固定的蛋白質(zhì)能保持生活時的均勻性。③是脂肪和類脂類的很好的固定劑。④強氧化劑，易揮發(fā)，毒性大，對視網(wǎng)膜固定效果好，要保護好眼睛。價格貴。⑤不使細胞收縮，對細胞質(zhì)固定好，固定物組織柔軟。⑥固定后流水沖洗12～24小時。使其完全洗凈，否則遇乙醇就發(fā)生沉淀。⑦固定材料適宜濃度為0.5-2%。鋨酸的配制：用重蒸水配成母液2%，使用時，用PH7.0、0.2M磷酸緩沖液稀釋一倍到1%。（2）戊二醛：特點：①穿透速度很快。②固定微管蛋白，是微管的很好的固定液。③用PH6.8-7.0、0.2M（3）丙烯酸：特點：①固定蛋白、核酸和聚多糖。②固定材料適宜濃度為10%，用PH6.5的磷酸緩沖液配。（4）甲醛：（不用于電鏡制片）特點：①穿透速度快。②可與蛋白質(zhì)化合形成不溶性的化合物而固定，固定脂肪和類脂類化合物。③還原劑，不能與氧化劑混用。④組織硬化程度顯著，收縮小，但僅僅經(jīng)酒精脫水后，收縮顯著。⑤固定后不需水洗，可直接投入70%的酒精。但經(jīng)長期固定的材料，需經(jīng)流水沖洗1-2天，否則影響染色。⑥市售的為37-40%甲醛，稱為福爾馬林，固定和保存材料的適宜濃度是10%福爾馬林。（四）混合固定液：1.卡諾(Carnoy)氏固定液：配方：純酒精：冰醋酸=3：1此液適于固定一般動物組織和肝糖原以及植物組織。（多用于細胞學(xué)研究。）穿透速度快，為防止組織硬化，固定時間不要超過24小時。時間以材料的不同而有所區(qū)別，根尖15min,花藥1小時。糖原在3-5℃2.福爾馬林-醋酸-酒精混合液：（FAA）配方：50%或70%酒精90ml、冰醋酸5ml、福爾馬林5ml配方中福爾馬林及冰醋酸的含量，經(jīng)常根據(jù)材料而略加改變。一般容易引起收縮的材料應(yīng)多加冰醋酸而減少福爾馬林的含量；堅硬的材料可略減少冰醋酸而增加福爾馬林。至于酒精的濃度應(yīng)用的原則是：柔弱幼嫩的材料用低濃度，老年或堅硬材料用70%酒精。如用作植物胚胎材料則其配方可改為：50%酒精89ml、冰醋酸6ml、福爾馬林5mlFAA是一種良好的固定液和保存液，差不多一般植物組織和器官都適用。（適用于組織學(xué)觀察，不適于細胞學(xué)觀察。）固定時間一般24小時，也可在此液中長期保存。也可通過木質(zhì)小枝枝枝必須固定1周。固定后木質(zhì)材料應(yīng)在流水中沖48小時，并在50%酒精和甘油溶液（1：1）中浸2-3天，使其軟化。3.鉻酸-醋酸中液：配方∶10%鉻酸水溶液7ml、10%醋酸水溶液10ml、蒸餾水加至100ml。此液用于固定根尖、小的子房及分離出來的胚珠等植物組織。固定時間一般12-24小時，不能長期保存材料。固定后流水沖洗12-24小時。4.納瓦興氏液：（適用于組織學(xué)和細胞學(xué)研究）甲乙液分開配，臨用時再混合。配法為：表1-4納瓦興氏液的配方常備液納瓦興氏液ⅠⅡⅢⅣⅤ桑弗利斯甲液1%鉻酸10%鉻酸10%醋酸冰醋酸蒸餾水15107540154540204060408603210702013879乙液福爾馬林蒸餾水4060109010902080208030706436

納瓦興氏液，固定時間為24-48小時，如固定液呈暗綠色時，表示固定能力已經(jīng)消失，其中鉻酸被還原的緣故，僅有保存作用，固定后用70%酒精沖洗，再脫水。納瓦興氏液ⅠⅡⅢⅣⅤ，固定時間為12-48小時，ⅠⅡ固定后用水沖洗，ⅢⅣ可用35%酒精沖洗，Ⅴ可用70%酒精沖洗。桑弗利斯液，固定時間為4-6小時，流水沖洗6-12小時。（五）固定時應(yīng)注意的問題：1.固定的材料越新鮮越好，立即固定。2.材料與固定液比例一般為1：20。3.根據(jù)材料的性質(zhì)和制片的目的選擇固定液。4.有時要用蔗糖、氯化鈉來調(diào)節(jié)滲透壓。5.材料外表有毛或其他不易穿透的物質(zhì)存在，可先在含酒精的固定液中固定幾分鐘，再換用含水的固定液。6.含有氣體的材料投入固定液后，不下沉，須將氣體抽出。方法可采用真空泵，或用注射器的簡易方法（將材料和固定液倒入10ml注射器中，插入活塞，用手封住出口，用手來回抽拉幾次即可）。7.材料固定后一定要做標(biāo)記。三、沖洗：（一）目的：所謂洗滌，即用洗滌劑滲透到材料中，把固定劑洗掉，洗滌必須徹底，才能進行下一步操作。否則留在組織中的固定液有的防礙染色，有的會發(fā)生沉淀物或結(jié)晶而影響觀察，有的可以繼續(xù)發(fā)生作用，破壞材料或影響以后的處理。（二）洗滌的原則與方法：常用的洗滌劑是水和低濃度的乙醇。1.固定液用水配的，就用水或流水來沖洗；不需流水沖洗的材料，放在小瓶內(nèi)，換數(shù)次水，每次1-2小時。2.用各種濃度的酒精配的，就要用與固定液相近濃度的酒精沖洗；材料：酒精=1：10。3.用福爾馬林固定的不用水洗，但長期固定的，應(yīng)充分水洗，否則影響染色。4.用鉻酸、重鉻酸鉀等固定的材料就用流水沖洗。將材料放在廣口瓶內(nèi)，瓶口用紗布扎起，橡皮管一端接在水龍頭上，一端插入瓶底，調(diào)節(jié)水的流量，是瓶內(nèi)的水不斷更新。水流不要太猛，以免損壞材料。沖洗時間應(yīng)和固定時間相同或再長。5.沖洗時間要根據(jù)固定液及材料的性質(zhì)、大小而定，一般1-6小時。四、脫水：就是用一種藥劑把材料中的水份全部代替干凈。（一）脫水原因：在制作永久制片時，組織沖洗完畢后必須進行脫水，因組織固定和水洗后含大量水分，而水不能和石蠟包埋劑混合，組織內(nèi)只要有極少量水份，就會防礙包埋劑的滲入。第一步脫水：是為了引入包埋劑作準(zhǔn)備。第二步脫水：是為了引入封藏劑作準(zhǔn)備。（二）脫水的結(jié)果：使材料變硬，形狀更加穩(wěn)定，利于組織永久保存。除盡材料的水份，才能使透明劑、包埋劑、封藏劑滲透到組織中，有利于組織的透明和透蠟。（三）脫水的方法：脫水應(yīng)逐步進行，而不能驟然進行，否則會引起組織的強烈收縮，或使材料變形。一般把脫水劑配成各種濃度，材料自低濃度到高濃度依次經(jīng)各級脫水劑，其中所含水份逐漸被脫水劑取代。（四）脫水劑應(yīng)具備的兩個特性：1.必須是親水性，能與水以任何比例混合，代替細胞中的水份。2.必須能和其他有機溶劑混溶取代。（五）脫水劑分為兩類：1.非石蠟溶劑的脫水劑：如乙醇、丙酮等，組織脫水后必須經(jīng)二甲苯透明才可浸蠟。2.石蠟溶劑的脫水劑：如正丁醇、二氧六圜等，組織脫水后即可直接透蠟，不需經(jīng)過中間溶劑二甲苯之類的藥品。（六）常用的脫水劑：1.乙醇：（1）按濃度梯度依次進行15%→35%→50%→70%→83%→95%→100%→100%；（2）脫水時的注意事項：①脫水必須要在有瓶蓋內(nèi)進行，尤其是高濃度乙醇很容易吸收空氣中的水份。②組織由低濃度向高濃度的乙醇轉(zhuǎn)移時，要用吸水紙吸干余液，以免將水份帶入。③純乙醇中如有水，可加無水硫酸銅以吸去水份。（3）在各級停留的時間：第一步脫水，須看材料的性質(zhì)大小而定，體積為2mm3的一般每級為1-4小時；第二步切片脫水，每級只需3-10min；在低濃度酒精中，每級停留的時間不易過長，否則易使組織變軟，助長材料解體。從95%到100%乙醇后，時間不能太長，否則材料變硬變脆，影響切片。為使乙醇脫水徹底，應(yīng)更換兩次100%乙醇。如需過夜應(yīng)停留在70%酒精中。注：在每級中停留的時間，依照材料的大小、性質(zhì)以及留在固定液中的時間長短和固定液的溶解性而定。①如洋蔥、蠶豆等根尖和小片葉子一樣大小的材料，每級停留約30min-1h。若用苦味酸固定則可延長為1h。②由FAA固定的草本莖，每級停留2小時，木本莖停留4小時，較大的木材每級延長為8-12小時。③一般動物組織如小白鼠的腎臟2-4mm厚，每級停留1-2h。④脫水至純酒精時，需更換兩次，每次30min-1h；材料大者，可多換一次。由95%-100%時，瓶子上的塞子也應(yīng)換干燥的，以免水份滲入。2.丙酮：為很好的脫水劑，可以代替乙醇，其作用和用法和乙醇相似，不過其脫水力和收縮力都比乙醇強。能使蛋白沉淀，組織硬化，不能溶解石蠟，所以仍需經(jīng)過二甲苯或其他透明劑，然后才能進行浸蠟和包埋。3.正丁醇：此劑易揮發(fā)，可與水和乙醇混合，亦是石蠟溶劑，可不經(jīng)透明劑直接浸蠟。但一般在應(yīng)用上還未能完全替代乙醇。多與乙醇按一定比例混合作脫水之用，但最后需經(jīng)純正定醇方可浸蠟。很少引起組織塊的收縮，變脆。表1-5各級濃度的正丁醇：級別Ⅰ（ml）Ⅱ（ml）Ⅲ（ml）Ⅳ（ml）Ⅴ（ml）Ⅵ（ml）蒸餾水503015500乙醇40505040250正丁醇1020355575100

Ⅰ-Ⅳ中的乙醇可用95%，僅Ⅴ級的用純乙醇配。Ⅱ中可過夜。材料經(jīng)兩次正丁醇后，進入1/2正丁醇1/2石蠟，經(jīng)1-3小時后，轉(zhuǎn)入純石蠟。4.叔丁醇:可與水，乙醇及二甲苯等劑混合，(可套用上表)也可單獨使用，是一種應(yīng)用很廣的脫水劑。此液不會使組織收縮或變硬，不必經(jīng)過透明，可直接浸蠟。應(yīng)用此劑可以簡化脫水、透明等步驟。因此已逐漸代替乙醇，但價格較貴。表1-6各級濃度的叔丁醇：級別Ⅰ（ml）Ⅱ（ml）Ⅲ（ml）Ⅳ（ml）Ⅴ（ml）Ⅵ（ml）蒸餾水403015000乙醇50505050250正丁醇1020355075100Ⅰ-Ⅳ中的乙醇可用95%，僅Ⅴ級的用純乙醇配。材料經(jīng)兩次叔丁醇后，進入1/2叔丁醇1/2石蠟，經(jīng)1-3小時后，轉(zhuǎn)入純石蠟。舉例：植物骨架光鏡觀察的實驗中，若遇到效果好的片子，可通過以下步驟做成永久切片：50%乙醇→70%→95%→1/295%：1/2叔丁醇→叔丁醇→中性樹膠（每級5-10min）。5.甘油，也是一種良好的脫水劑，尤其對細小柔軟的材料更適合。用甘油脫水可以避免原生質(zhì)收縮，但脫水前必須洗凈固定劑，以免影響包埋和染色。利用甘油脫水，可以從50%濃度開始至純甘油，再換純乙醇。6.二氧六環(huán)：為無色液體，易揮發(fā)燃燒，且有毒，應(yīng)盡力避免吸入它的蒸氣。能與水和乙醇在任何比例下混合，為石蠟溶劑，脫水至純二氧六環(huán)后，即可進行包埋。濃度梯度設(shè)計為：30%→50%→70%→90%→100%→100%→100%每級時間為1-6小時。五、透明：材料經(jīng)脫水劑去水分后，還要經(jīng)過一種既能與脫水劑，又能與包埋劑相混合的溶劑—透明劑來處理，以便于包埋劑的深入或封藏。在制片過程中有兩次透明：第一次是組織塊的透明，為了引入包埋劑。第二次是染色以后切片的透明。為了引入封藏劑。（一）常用透明劑：透明劑都是石蠟的溶劑，絕大多數(shù)不能與水混合，最常用的透明劑有二甲苯，苯，甲苯，氯仿，冬青油等。1.二甲苯：目前應(yīng)用最廣。易溶于乙醇，又能夠溶解石蠟，加拿大樹膠，透明力強，作用較快。其最大缺點是容易變硬變脆.材料必須脫盡水分再透明，否則發(fā)生乳狀渾濁。在玻片進入二甲苯前，為了減少材料收縮，材料先經(jīng)過1/2二甲苯+1/2無水乙醇→二甲苯（I）→二甲苯（II）→1/2二甲苯+1/2石蠟材料在二甲苯中時間不宜過長，否則材料收縮變硬，變脆。一般組織塊透明總時間1-3小時，（每級30分鐘左右）染色后的切片透明每級5-10分鐘。2.甲苯：性質(zhì)同二甲苯，可作為二甲苯的替代品，但甲苯的透明較慢，一般需12-24小時，材料不變脆，故此點優(yōu)于二甲苯。3.苯：性質(zhì)近似二甲苯，揮發(fā)較快，且易爆炸，人吸入苯能引起中毒。使組織收縮較小，久浸也不像二甲苯使組織產(chǎn)生脆硬現(xiàn)象。4.氯仿：也是一種很好的透明劑，組織透明時收縮不太厲害，不變脆，易揮發(fā)，浸透力比二甲苯，苯慢，透明時間比二甲苯應(yīng)延長2-3倍。氯仿適用透明大塊組織，火棉膠切片和植物石蠟切片。六、浸蠟與包埋：組織經(jīng)過透明后要讓石蠟支持劑透入內(nèi)部使它變硬，并將組織包埋進去，把軟組織變?yōu)檫m當(dāng)硬度的蠟塊，以便切成薄片。以利于切片和觀察，這個過程將為“浸蠟”和“包埋”。（一）常用包埋劑1.石蠟的熔點多為50-60℃（1）石蠟硬度與組織硬度相近似，組織較硬時，用硬的石蠟，反之用軟的石蠟。一般動物材料石蠟的熔點為52-56℃，植物材料石蠟的熔點為54-58（2）切片較薄時（4um以下），石蠟的熔點為58-60℃（3）最重要的要看室內(nèi)溫度，通常在夏天用熔點高的石蠟-硬蠟，冬天用熔點低的石蠟-軟蠟。石蠟太硬，切片時容易破碎，不易切成臘帶，太軟時，蠟帶容易皺縮。2.火棉膠為固體膠片，市售的有的是膠片，有的是已配成6%或4%的溶液，即取6g或4g火棉膠片溶于100ml乙醚和乙醇的等量混合液中。配制時，先將火棉膠浸于乙醇中，12-24小時后在加入等量乙醚，這樣溶解較快。）（二）浸蠟：材料經(jīng)透明后，倒入二甲苯，再在上面倒入60℃的石蠟，使石蠟：二甲苯=3：2；放在35-37℃的恒溫箱中浸蠟1-2天。將溫箱升至（三）包埋：準(zhǔn)備燙板、紙盒、成冰水的盆、酒精燈和解剖針。步驟：紙盒放于燙板上，將石蠟和材料一起倒出，用加溫后的解剖針將材料調(diào)到合適的位置，標(biāo)簽有文字的一面向下。再補足石蠟。輕輕提起紙盒的兩側(cè)的把手，慢慢平放于盆的水面上，待紙盒內(nèi)石蠟表面已凝固，即可將紙盒向一側(cè)傾斜，使其立即進入冷水中，迅速凝固，經(jīng)30min-1h后，取出晾干。七、切片：石蠟切片，用旋轉(zhuǎn)切片機。如圖1-4所示。一個旋轉(zhuǎn)切片機，可分三個部分，一個是安裝切片刀的部分，有調(diào)節(jié)刀片斜度和固著刀片的螺旋。一個是安裝材料的部分，也有螺旋可以調(diào)節(jié)材料的位置。另一個是操縱在旋轉(zhuǎn)中向前推進的部分，控制著切片的厚薄，是比較重要而復(fù)雜的部分。圖1-4旋轉(zhuǎn)切片機（一）修塊、粘塊、整修的步驟：1.選取所要切片的材料，從包埋的石蠟塊上用單面刀片切割下來，注意不可損傷包埋的組織。2.確定切面的方位，用刀片將石蠟塊的四面作初步的整修。保證材料四周都有石蠟包圍。但不可太多。切面的上、下邊平行。3.點燃酒精燈，并準(zhǔn)備一把舊的解剖刀。4.左手大拇指與食指間持整修好的石蠟塊，材料向上用其余三指夾住臺木。此時將解剖刀在酒精燈上加溫后，即放在臺木與石蠟塊之間，因解剖刀已加溫，遇上兩面的石蠟都會融化，可立即將解剖刀抽出，石蠟塊迅速壓在臺木上。5.再將解剖刀蘸取少許石蠟碎屑，放在剛才固定的石蠟四周。此時，解剖刀再加溫，并迅速將石蠟塊四周的碎屑燙平。使石蠟塊牢固地粘在臺木上。6.修石蠟塊上下面平行，是切成的蠟帶呈一直線，不彎曲。每個切片中組織的距離接近。（二）切片的方法：1.準(zhǔn)備下列用具：毛筆、黑色亮光紙2.將已固著和整修好的石蠟塊和臺木裝在切片機的夾物部分.3.安裝切片刀，將刀片夾在刀夾上，并調(diào)整好刀的角度。刀的斜度，非常重要，最好先切除的蠟塊試刀，以確定刀的斜度，一經(jīng)調(diào)度適合后，就不要隨便變動，以免每次試刀的麻煩。4.移動刀片固定器，使夾刀部與夾物部之間的距離調(diào)整好，以石蠟塊的表面剛貼近刀口為度，在旋緊切片固定器的螺旋。5.調(diào)整石蠟塊與刀口之間的角度與位置。修整蠟塊，將刀片移近蠟塊，使小蠟塊的下邊與刀鋒平行，如不平行，可調(diào)夾物部上的螺旋。然后把它固定，再轉(zhuǎn)下蠟塊．呈矩形才行。只有平整的蠟塊，才能切出平整的蠟帶。6.最后根據(jù)需要，調(diào)整控制切片厚度的機制。調(diào)度后，把它固定下來。上述四步驟完成后，就可進行切片，7.開始切片。右手握旋轉(zhuǎn)輪的手柄，搖動一轉(zhuǎn)就可切下一片，切下的蠟片粘在刀口上，待第二片切下時粘在一起，所以連續(xù)搖動就可將切下的蠟片連成一條蠟帶。這時左手就可持毛筆將蠟帶提起，邊搖邊移動蠟帶。轉(zhuǎn)速為每分鐘40-50為宜。8.切成的蠟帶到20-30厘米時，即以右手用另一只毛筆輕輕將蠟帶挑起，平放在黑電光紙上?？康兜囊幻孑^光滑，應(yīng)向下，較皺的一面向上。9.切下的蠟片是否良好，此時應(yīng)先行檢查。10.切片工作結(jié)束后，仍將刀片用具擦拭干凈。八、貼片：貼附牢固，在染色時不易脫落；是皺褶的蠟片伸展平整。（一）用具：載玻片、粘片劑、解剖刀、蒸餾水、展片機及銬片機。 （二）貼片的方法1.將展片機溫度調(diào)整到35℃2.在載玻片上涂蛋白甘油粘片劑。其法是用細玻璃棒蘸取一小滴粘片劑，加在載玻片的中央，然后用洗凈的手指（無名指）加以涂抹，范圍不要太廣，也不要太多，以能貼足夠的蠟片為度。蛋白甘油粘片劑的配方：（不適宜用作蛋白觀察）3.將涂粘片劑的載玻片放在展片機上，滴加蒸餾水?dāng)?shù)滴，此時若發(fā)現(xiàn)水不均勻分散而聚成滴狀，即表示玻片不清潔，有殘留油脂等物在上面。4.用解剖刀將蠟帶切成小段，每段的長度應(yīng)以蓋玻片的長度為準(zhǔn)，一般應(yīng)比蓋玻片短約1/5-2/5。分片應(yīng)從蠟帶交界處分。5.將蠟帶輕輕移到涂有水的載玻片上，蠟片光面應(yīng)向下貼在載玻片上，依次排列整齊。留出右端貼標(biāo)簽處。6.材料展平后，從展片機上取下，稍稍傾斜留出多余的水分，用吸水紙吸干背面及周圍多余水分，放于烤片機（35℃九、染料與染色：（一）染料：在組織切片染色中使用的最廣的染色劑是有機染色劑。1.染色劑的性質(zhì)：具備兩個性質(zhì)，一要具有顏色，二要與被染組織間有親和力。這兩個性質(zhì)都是由分子結(jié)構(gòu)決定的，主要有兩種特殊的基團所產(chǎn)生，即產(chǎn)生顏色的發(fā)色團和產(chǎn)生親和力的助色團。發(fā)色團：能使染色劑分子產(chǎn)生顏色的原子團稱發(fā)色團，也就是能吸收一定波長的光線，并因之而呈現(xiàn)顏色的化學(xué)結(jié)構(gòu)。助色團：能使染色劑對組織產(chǎn)生親和力的原子團。它的作用是使化合物具有鹽類的性質(zhì)，即它是不能染色的有色物質(zhì)變?yōu)橐环N電解質(zhì)，使它能和酸或堿生成鹽類。2.染色劑的分類（1）根據(jù)染色劑的來源分：天然染色劑：是從動植物體中提取出來的，為天然產(chǎn)物，產(chǎn)量少。目前常用的是洋紅、地衣紅、靛青、蘇木精，其中最常用的是洋紅、胭脂紅，地衣紅，番紅花和蘇木精。人工合成染色劑：使用化學(xué)方法合成的芳香環(huán)或具有芳香環(huán)的雜環(huán)化合物。（2）按主要用途分為胞核染色劑：蘇木素，胭脂紅，甲苯胺藍，美藍，孔雀綠等。胞漿染色劑：伊紅，淡綠，橘黃G,酸性品紅,苦味酸等。脂質(zhì)染色劑：蘇丹Ⅲ，蘇丹Ⅳ，蘇丹黑，硫酸尼羅藍及油紅等。（3）根據(jù)染色劑的化學(xué)反應(yīng)分：染色劑的干粉是穩(wěn)定的鹽類，它們在溶液中則電離成酸性或堿性染色劑。如酸性染色劑，能夠產(chǎn)生氫離子（H+)或其它陽離子(Na+),而其本身成為帶負電荷的陰離子者。這類染色劑一般用于染細胞漿，如伊紅Y，苦味酸，橘黃G等。堿性染色劑，能產(chǎn)生氫氧根離子（OH-)或其它負離子(如Cl-),而本身成為帶正電荷的陽離子者。這類染色劑常用于染細胞核,如堿性品紅等。①酸性染色劑：色原——助色團——Na→[色原-助色團]+Na+。酸性染色劑在水中電離后，其發(fā)色團帶負電荷。一般溶于乙醇和水，常用高濃度的乙醇和丁香油作溶劑。一般用于細胞質(zhì)染色。常用的如伊紅，酸性品紅，苦味酸，橘黃G，剛果紅，水溶性苯胺藍，淡綠等酸性染料常用以染細胞漿等堿性成份。②堿性染色劑：色原——助色團——Cl→[色原-助色團]++Cl。堿性染色劑在水中電離后，其發(fā)色團帶正電荷。一般能溶于水和乙醇，常用水和低濃度的乙醇作溶劑。一般用于胞核染色。著色能力差，染色時間長。常用的如蘇木素,卡紅,次甲基藍,甲苯胺藍,硫堇,美藍等堿性染料常用以染細胞核等酸性成份。木質(zhì)化細胞壁：堿性染色劑細胞壁：纖維素細胞壁：酸性染色劑著色部位細胞質(zhì)：酸性染色劑細胞核：堿性染色劑嚴(yán)格地說，酸性染色劑的溶液并不一定呈酸性。同樣，堿性染色劑的溶液也未必呈堿性。所謂酸性和堿性染色劑僅指它們電離后其分子的主要染色部分是陽離子還是陰離子。因此稱為陽離子型染色劑或陰離子型染色劑更為適當(dāng)。常規(guī)H.E染色中蘇木素染液的PH值約為7，此時胞核的化學(xué)成份電離產(chǎn)生H+，而其本身成為帶電荷的陰離子，所以被陽離子型的堿性染料劑所著色。伊紅染液為弱酸性。細胞的化學(xué)成份從溶液中獲取H+而成為帶正電荷的陽離子，因此與陰離子型的酸性染色劑（伊紅）相結(jié)合，染作紅色，這就是H.E染色分別顯示核和胞漿的機制。③中性染色劑：這是酸性染色劑和堿性染色劑的復(fù)合物，又可稱為復(fù)合染料。是由堿性染料（色堿的鹽）和酸性染料（色酸的鹽）配制而成。其中染色劑的分子很大，所以往往水中溶解度較低，需用酒精做溶劑。血液學(xué)中的血液涂片經(jīng)常使用的瑞氏染色劑及姬姆薩染色劑就是這種混合染色劑。其中的各種不同成分可分剔使核、胞漿和顆粒著色。(3)按染色劑分子中的發(fā)色團可分為九類①亞硝基類：發(fā)色團為亞硝基（-NO)如萘酚緣-B。②硝基染料：發(fā)色團是硝基（-NO2）如苦味酸。③偶氮類：發(fā)色團為偶氮基（-N=N-）屬于這一類的染色劑的橘黃G,剛果紅,俾士麥棕和許多蘇丹類的脂質(zhì)染色劑。④醌亞胺類：這類染料含有兩個發(fā)色團，一個是印胺基（-N=），一個是醌型苯環(huán)，如硫堇，美藍，甲苯胺藍O,硫酸尼羅藍,中性紅,堿性藏紅花O，焦油紫等。⑤苯甲烷染料：發(fā)色團是醌型苯環(huán)，如孔雀緣，淺綠，堿性品紅，酸性品紅，結(jié)晶紫，甲基緣等。⑥山叮染料：發(fā)色團是醌型苯環(huán)，如派羅寧，伊紅Y等。⑦蒽醌染料：此類染色劑含有色原蒽醌，如茜素和胭脂蟲酸。⑧噻唑類。⑨喹啉類。⑧，⑨類染色劑使用極少。3.媒染劑與促染劑（1）媒染劑：某些染色劑若不用媒染劑則染色能力弱，經(jīng)過媒染劑的作用后，染色劑便易與組織染色，因為染色劑既能與染色劑相結(jié)合，又能與組織相結(jié)合，所以凡是本身能與染色劑和組織發(fā)生結(jié)合，促進染色和生成色淀的含金屬離子的鹽稱為媒染劑；凡是能與金屬離子作用生成色淀的染色劑稱為媒染染色劑。天然染料往往需用媒染劑。常見的媒染染色劑有氧化蘇木精、茜素、卡紅等。媒染劑的種類很多，一般是一種二價或三價金屬鹽或氫氧化物，常用的是鋁鹽、鐵鹽及明礬。（2）促染劑：它能使染料對組織著色容易，而本身不參與染色反應(yīng)。常用的有硼砂、石炭酸。（二）染色的方法：1.整體染色法：一般微小的生物體經(jīng)固定，沖洗后，其整體直接入染液染色。2.組織塊染色法：是將固定的組織塊沖洗后直接投入到染液內(nèi)染色。3.蠟帶染色法：組織經(jīng)石蠟切片后，進一步染色時多用此法。此法又可分為三種：（1）單染色法:用一種染色劑染色的方法。（2）復(fù)染色法(對比染色法)：是用兩種不同性質(zhì)的染色劑進行染色的方法。如蘇木精伊紅染色（HE染色）、番紅固綠染色。復(fù)染時注意事項：酸堿對染、先堿后酸、堿性染料的分色。（3）多重染色法：選用兩種以上染色劑染色的方法。如Mallory氏三色染色法染結(jié)締組織。4.根據(jù)所用染料的濃淡程度和是否用媒染劑，染色方法有可分為：（1）漸進法與后退法：漸進法是將組織放入稀染色液中，使組織某部分由淺入深，漸漸著色，其它組織并不著色，染至所需程度即行停止染色。后退法是將組織先行濃染后再褪色，而嗜強染性的某一構(gòu)造不受影響，其它部分則褪至近無色。一般染色都采用后退法。（2）直接法與間接法：不需媒染劑的作用稱為直接法，某些染料染色能力弱。不能與組織直接作用，必須經(jīng)過媒染劑的作用，是染色劑固著于媒染劑，媒染劑又能固著于組織，既能染色，此為間接法。（三）常用染色劑：生物制片應(yīng)用的染色劑約200種，下面分別介紹一些常用的染色劑的性能、配方和染色方法。1.天然染料（1）蘇木精:蘇木精是從南美的蘇木（熱帶豆科植物）干枝中用乙醚浸制出來的一種色素，是最常用的染料之一。蘇木精：（hematoxylin）生物制片中最重要的染色劑。它它是一種淡黃色和淺褐色粉末狀結(jié)晶，易溶于乙醇，微溶于水和甘油。蘇木精不能直接染色，必須經(jīng)過氧化，成為氧化蘇木精或蘇木素后（hematein）才能應(yīng)用。這個氧化過程叫成熟。氧化方法有兩種：一種是暴露于空氣中自然氧化（需時間較長）但此液時間越久染色能力越強，另一種是栽配制時加入氧化劑，使其急速氧化，但此也不宜久置。蘇木精為弱酸性，對組織親和力小，不能單獨使用，必須經(jīng)媒染劑一起使用才能達到染色目的。常用的媒染劑有硫酸鋁按、鉀明礬和鐵明礬等蘇木精不僅是很好的核染劑，還有明顯的多色性，統(tǒng)一標(biāo)本只要經(jīng)過適宜的分色作用就能得到集中又藍到紅的色調(diào)。若經(jīng)酸性溶液（如用鹽酸酒精）分色后則呈現(xiàn)紅色，但經(jīng)水洗后，仍可恢復(fù)青藍色；堿性溶液（如氨水）分色后為藍色，水洗后成藍黑色。常用的埃利希氏蘇木精配方如下：蘇木精：1克；95%乙醇：50毫升；冰乙酸：5毫升；甘油：50毫升；鉀礬（硫酸鋁鉀）：1.5克；蒸餾水：50毫升配法：將蘇木精放入乙醇中溶解后，再加蒸餾水、甘油、鉀礬和冰醋酸，攪拌均勻，倒入廣口瓶中，混合呈淡紅色。瓶口覆蓋四層紗布放置兩個月，使其氧化，顏色變?yōu)樯钭丶t色時即為成熟就可使用?？砷L期使用。此染料需氧化過程，氧化越徹底，染色效果越好。若想快速使用，加0.2克磺酸鈉可立即成熟，但使用時間不長。此染料可用于整體染色，使用前需稀釋10倍后使用—即埃利希氏蘇木精稀釋液。用埃利希氏蘇木精染色后，水沖洗或用按水沖洗，直至變藍。（2）洋紅:洋紅又叫胭脂紅或卡紅。一種熱帶產(chǎn)的雌性胭脂蟲干燥后，磨成粉末，提取出蟲紅，再用明礬處理，除去其中雜質(zhì)，就制成洋紅。單純的洋紅不能染色，要經(jīng)酸性或堿性溶液溶解后才能染色。常用的酸性溶液有冰醋酸或苦味酸，堿性溶液有氨水、硼砂等。洋紅使細胞核的優(yōu)良染料，染色的標(biāo)本不易褪色。用作切片或組織塊染都適宜，尤其適宜于小型材料的整體染色。用洋紅配成的溶液染色后能保持幾年。洋紅溶液出現(xiàn)渾濁時要過濾后再用。2.人工染料人工染料，即苯胺染料或煤焦油染料，種類很多，應(yīng)用極廣。它的缺點是經(jīng)日光照射容易褪色，苯胺藍、亮綠、甲基綠等更易褪色。在制片中注意掌握酸堿度，并避免日光直射，也能經(jīng)幾年不褪色。（1）酸性品紅:酸性品紅是酸性染料，呈紅色粉末狀，能容于水，略溶于酒精（0.3%）。他是良好的細胞制染色劑，在動物制片上應(yīng)用很廣，在植物制片上用來染皮層、髓部等薄壁細胞和纖維素壁。他跟甲基綠同染，能顯示線粒體。組織切片在染色前先浸在帶酸性的水中，可增強它的染色力。酸性品紅容易跟堿起作用，所以染色過度，易在自來水中褪色。（2）剛果紅:剛果紅是酸性染料，呈棗紅色粉末狀，能溶于水喝酒精，遇酸呈藍色。他能作染料，也用作指示劑。他在植物制片中常作為蘇木精或其他細胞染料的襯墊劑。他用來染細胞質(zhì)時，能把膠制或纖維素染成紅色。在動物組織制片中用來染神經(jīng)軸、彈性纖維、胚胎材料等。剛果紅可以跟蘇木靜作二重染色，也可用作類淀粉染色，由于他能溶于水和酒精，所以洗滌和脫水處理要迅速。（3）甲基藍:甲基藍是弱酸性染料，能溶于水和酒精。甲基藍在動植物的制片技術(shù)方面應(yīng)用極廣。他跟伊紅合用能染神經(jīng)細胞，也是細菌制片中不可缺少的染料。它的水溶液是原生動物的活體染色劑。甲基藍極易氧化，因此用他染色后不能長久保存。（4）固綠:固綠是酸性染料，能溶于水（溶解度為4%）和酒精（溶解度為9%）。固綠是一種染含有漿質(zhì)的纖維素細胞組織的染色劑，在染細胞和植物組織上應(yīng)用極廣。他和蘇木精、番紅并列為植物組織學(xué)上三中最常用的染料。（5）蘇丹Ⅲ:蘇丹Ⅲ是弱酸性染料，呈紅色粉末狀，易溶于脂肪和酒精（溶解度為0.15%）。蘇丹Ⅲ是脂肪染色劑。（6）伊紅:這類染料種類很多。常用的伊紅Y，是酸性染料，呈紅色帶藍的小結(jié)晶或棕色粉末狀，溶于水（15攝氏度是溶解度達44%）和酒精（溶于無水酒精的溶解度為2%）。伊紅在動物制片中廣泛應(yīng)用，是很好的細胞質(zhì)染料，常用作蘇木精的襯染劑。（7）堿性品（復(fù)）紅:堿性品紅是堿性染料，呈暗紅色粉末或結(jié)晶狀，能溶于水（溶解度1%）和酒精（溶解度8%）。堿性品紅在生物學(xué)制片中用途很廣，可用來染色膠原纖維、彈性纖維、嗜復(fù)紅性顆粒和中樞神經(jīng)組織的核質(zhì)。在生物學(xué)制片中用來染維管束植物的木質(zhì)化壁，又作為原球藻、輪藻的整體染色。在細菌學(xué)制片中，長用來鑒別結(jié)核桿菌。在爾根氏反應(yīng)中用作組織化學(xué)試劑，已核查脫氧核糖核酸。（8）結(jié)晶紫:結(jié)晶紫是堿性染料，能溶于水（溶解度9%）和酒精（溶解度8.75%）。結(jié)晶紫在細胞學(xué)、組織學(xué)和細菌學(xué)等方面應(yīng)用極廣，是一種優(yōu)良的染色劑。他是細胞核染色常用的，用來顯示染色體的中心體，并可染淀粉、纖維蛋白、神經(jīng)膠質(zhì)等。凡是用番紅和蘇木精或其他染料染細胞核不能成功時，用它能得到良好的結(jié)果。用番紅和結(jié)晶紫作染色體的二重染色，染色體染成紅色，紡錘絲染成紫色，所以也是一種顯示細胞分裂的優(yōu)良染色劑。用結(jié)晶紫染纖毛，效果也很好。用結(jié)晶紫染色的切片，缺點是不易長久保存。（9）龍膽紫:龍膽紫是混合的堿性染料，主要是結(jié)晶紫和甲基紫的混合物。在必要是，龍膽紫能跟結(jié)晶紫互相替用。醫(yī)藥上用的紫藥水，主要成分是甲基紫，需要時能代替龍膽紫和結(jié)晶紫。（10）中性紅:中性紅是弱堿性染料，呈紅色粉末狀，能溶于水（溶解度4%）和酒精（溶解度1.8%）。它的堿性溶液中呈現(xiàn)黃色，在強堿性溶液中呈藍色，而在弱酸性溶液中呈紅色，所以能用作指示劑。中性紅無毒，常做活體染色的染料，用來染原生動物和顯示動植物組織中活細胞的內(nèi)含物等。陳久的中性紅水溶液，用作顯示尼爾體的常用染料。（11）番紅:番紅是堿性染料，能溶于水和酒精。番紅是細胞學(xué)和動植物組織學(xué)生常用的染料，能染細胞核、染色體和植物蛋白質(zhì)，示維管束植物木質(zhì)化、木栓化和角質(zhì)化的組織，還能染孢子囊。（12）亞甲藍或美藍:亞甲藍或美藍是堿性染料，呈藍色粉末狀，能溶于水（溶解度9.5%）和酒精（溶解度6%）。亞甲藍是動物學(xué)和細胞學(xué)染色上十分重要的細胞核染料，其優(yōu)點是染色不會過深。（13）甲基綠:甲基綠是堿性染料。它是綠色粉末狀，能溶于水（溶解度8%）和酒精（溶解度3%）。甲基綠是最有價值的細胞和染色劑，細胞學(xué)上常用來染染色質(zhì)，跟酸性品紅一起可作植物木質(zhì)部的染色。（14）苯胺藍：是一種混合性的酸性染料，為深藍色粉末，是一類染色劑的混合物，而不是一個簡單的染色劑，有水溶性和醇溶性兩種。水溶性苯胺藍用于動物組織的對比染色，能顯示細胞質(zhì)，對神經(jīng)細胞和軟骨染色特別好。水溶性苯胺藍常配成1%的溶液。醇溶性苯胺藍在植物制片技術(shù)上，常與番紅做對比染色?？扇局参锛毎冢部娠@示鞭毛及非木質(zhì)化組織，常用95%乙醇配成1%的酒精溶液使用。（四）組織化學(xué)染色法：由于顯微鏡的改進，生物制片技術(shù)和染料化學(xué)的迅速發(fā)展，使細胞構(gòu)造的研究日趨細致和深入。使用優(yōu)良的固定劑、切片機和由煤焦油提取出的多種生物染料能在普通顯微鏡下顯示組織、細胞的結(jié)構(gòu)細節(jié)，組織學(xué)研究技術(shù)的發(fā)展和完善，提供了辨認組織和細胞微細結(jié)構(gòu)的多種標(biāo)準(zhǔn)方法。1.組織化學(xué)和細胞化學(xué)組織化學(xué)（histochemistry)和胞化學(xué)（cytochemistry）技術(shù)的基本原理是在組織切片上或被檢材料上，加一定試劑，使它與組織或細胞中待檢物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)成為有色沉淀物，以用光鏡觀察，若為重金屬沉淀，可以用電鏡觀察，稱電鏡組織化學(xué)（electronmicroscopehistochemistry)。這種方法可用于檢測細胞內(nèi)的酶類、糖類、脂類、核酸與某些多屬元素等。如進一步應(yīng)用顯微分光光度計等測定標(biāo)本中沉淀物的強度，則能較精確地進行定量研究。(1)顯示多糖（淀粉粒及細胞壁纖維素等）的高碘酸-希夫反應(yīng)最常用于顯示細胞、組織內(nèi)的多糖和蛋白多糖的方法是高碘酸-希夫反應(yīng)（periodicacidSchiff，PAS反應(yīng))。①基本原理是：糖被強氧化劑高碘酸（HIO4)氧化后，使多糖分子中的C-C鍵形成2-醛基；后者與Schiff試劑中的無色品紅亞硫酸復(fù)合物結(jié)合，形成紫紅色反應(yīng)產(chǎn)物,PAS反應(yīng)陽性部位即表示多糖的存在。②試劑的配制：高碘酸溶液:高碘酸2g蒸餾水200mlSchiff試劑（配制20m1）：稱取堿性品紅0.1g，燒杯內(nèi)放入20ml蒸餾水，煮沸，將0.lg堿性品紅慢慢到人沸水中，邊放邊攪，至完全溶解。待溫度降至60～70℃時過濾至錐形瓶中，加2ml1NHCl于瓶中，搖勻。加入NaHSO30.2g于瓶中，塞緊瓶口，搖蕩至完全溶解，用黑紙將瓶包嚴(yán)置陰暗處過夜。次日加100mg活性炭于瓶中，搖勻后迅速過濾于棕色瓶內(nèi)。保存于4℃1NHCl配制（按1000ml用量）：HCl（比重1.8）89ml蒸餾水911ml注意將酸加入水內(nèi)!偏重亞硫酸鹽溶液：10％偏重亞硫酸鉀（鈉）5ml（現(xiàn)用現(xiàn)配）1NHCl5ml蒸餾水90ml亞硫酸氫鹽溶液10％偏重亞硫酸鈉(鉀)5ml1mol／L鹽酸5ml蒸餾水90ml③步驟A切片脫蠟到水B流水沖洗15-30minC0.5-0.8%高碘酸溶液處理10minD流水洗滌5-10min蒸餾水漂洗E希夫試劑，室溫，20-30minF亞硫酸氫鹽溶液或偏重亞硫酸鉀（鈉）溶液洗三次，每次2minG流水沖10-15min，蒸餾水漂洗5minH按常規(guī)各級乙醇脫水，二甲苯透明，樹膠封片④結(jié)果：淀粉粒、纖維素細胞壁及細胞內(nèi)的糖原、糖蛋白呈紫紅色(PAS陽性反應(yīng))。圖1-5PAS染色結(jié)果⑤注意事項ASchiff液的配制是本方法的關(guān)鍵。BSO2充分時，能使堿性品紅變成無色品紅，此時配出來的溶液呈淡黃色清亮液體，可以省去少于性炭吸色這一步驟，在使用中染液逐漸變無色。C反應(yīng)的強弱與氧化的時間及氧化強度有關(guān)。過碘酸的濃度不宜過高，氧化時間不能太短，也不能太長，要適當(dāng)掌握。D一定要做好對照。（2）顯示總蛋白質(zhì)的汞-溴酚蘭法①試劑的配制汞-溴酚蘭染色液：2%的醋酸水溶液100毫升，溶解氯化汞1克，溴酚蘭50毫克。②試驗程序A材料用卡諾、乙醇、甲醛、FAA等固定液進行固定B石蠟切片，脫蠟到蒸餾水C放入汞-溴酚蘭染色液中，室溫2小時D用0.5%的醋酸水溶液漂洗5分鐘F切片直接入叔丁醇，或?qū)⒁讶厩衅湃胫行跃彌_液中呈現(xiàn)鮮藍色G按常規(guī)各級乙醇脫水，二甲苯透明，樹膠封片③結(jié)果蛋白質(zhì)被染成深藍色。圖1-6汞-溴酚蘭法染色結(jié)果3.顯示DNA的孚爾根反應(yīng)①Feulgen反應(yīng)原理自Feulgen等發(fā)明該顯示DNA的Feulgen反應(yīng)法以來，其作用機制也久經(jīng)研究和討論，現(xiàn)已取得一致意見。其具體反應(yīng)原理是，標(biāo)本經(jīng)稀鹽酸水解后，DNA分子中的嘌呤堿基被解離，從而在核糖的一端出現(xiàn)了醛基。Schiff試劑中的無色品紅可與醛基反應(yīng)，形成含有醌基的化合物分子,因醌基為發(fā)色團，故可呈現(xiàn)出紫紅色。也就是說,DNA經(jīng)稀酸水解后產(chǎn)生的醛基，具有還原作用，可與無色品紅結(jié)合形成紫紅色化合物，從而顯示出DNA的分布。其反應(yīng)機制如下所示。2HCl+Na2S2O5→2NaCl+SO2+H2SO3②試劑配制ASchiff氏試劑的配制同PAS染色中的配方B亞硫酸水(洗滌劑)配制同PAS染色中的配方C1mol/LHCl(水解用)取82.5ml比重為1.19的鹽酸加蒸餾水1000ml即成(應(yīng)將鹽酸緩緩加入水中)。③染色程序A常規(guī)切片脫蠟到水。B蒸餾水稍洗C冷1mol/LHCl中1-2minD溫浴至60℃的1mol/LHCl溶液中水解15E取出標(biāo)本，放入室溫1mol/LHCl溶液（注意:這個步驟非常重要，必須用1mol/L稀鹽酸沖洗，因為它可以洗去貼在切片上的試劑的痕跡。如用蒸餾水沖洗，則試劑本身也可以水解，所釋放出的堿性品紅，可以使切片內(nèi)一切嗜堿性物質(zhì)皆染色從而引起嚴(yán)重的錯誤。若切片較厚，可延長其水解時間，而且每次均需更換洗滌劑）F蒸餾水沖洗3次（使水解停止）GSchiff試劑中染色1-2小時（暗處）H用亞硫酸水洗3~5次(以洗去多余的非特異性色素及擴散的染料)I流水沖洗15-30minJ蒸餾水洗片刻K按常規(guī)各級乙醇脫水，二甲苯透明，樹膠封片④實驗結(jié)果細胞核中的DNA呈鮮亮的紫紅色反應(yīng)，它不但反應(yīng)出DNA存在的部位及其分布情況，而且還可從顏色反應(yīng)的深淺，來判斷DNA的相對含量。細胞質(zhì)被亮綠復(fù)染成綠色，核仁通常為負反應(yīng)；但在有些材料的細胞質(zhì)中，DNA也會出現(xiàn)陽性反應(yīng)。圖1-7孚爾根染色結(jié)果⑤注意事項A對照切片的制做

進行Feulgen反應(yīng)時,一般要做一對照切片以便驗證反應(yīng)結(jié)果。對照切片應(yīng)不經(jīng)水解直接放在schiff劑內(nèi)，且應(yīng)為負反應(yīng)。但需要注意的是，對照切片在schiff試劑中最多不要超過1h(0.5h即可)，時間過長，試劑本身的酸性也會使DNA水解，從而出現(xiàn)假的正反應(yīng)。B固定劑的選擇

以前很多人認為，選用的固定劑不應(yīng)含有醛基或含有氧化劑。后來發(fā)現(xiàn)含醛基或氧化劑的固定劑對反應(yīng)的專一性并沒有影響。實踐證明，一切好的組織學(xué)固定劑均適用于Feulgen反應(yīng)。如Bhampy固定劑、Helly固定劑、Flemming固定劑、OsO4固定劑、Carnoy固定劑、zenker固定劑和Bouin-Aller固定劑。但在上述固定劑中，以O(shè)sO4和Carnoy效果較好，OsO4(1%或0.5%)是Feulgen反應(yīng)的理想固定劑，只是因OsO4價錢較貴，故一般多采用Carnoy固定液。在Feulgen反應(yīng)中，不能單獨使用Bouin定液，因為它是Feulgen反應(yīng)的最壞固定劑。C水解時間

Feulgen反應(yīng)通常用稀酸進行水解，但水解的時間一定要適當(dāng)。如水解時間不夠,反應(yīng)就會變?nèi)酰蝗缢鈺r間過長。或水解地過于劇烈，則脫氧核糖也易掉下來，反應(yīng)也會減弱。適當(dāng)?shù)乃鈺r間一般為8~12min。但是水解時間長短也要視標(biāo)本的類型(如厚薄等)、固定劑的性質(zhì)以及酸的濃度而定。DSchiff試劑的作用

Feulgen反應(yīng)成功與否的一個非常關(guān)鍵的因素，就是schiff試劑的質(zhì)量。有一大類試劑均稱為堿性品紅，它們實際上是由幾種產(chǎn)品分別組成的。因此只能選用注明“DNA染色反應(yīng)用”的堿性品紅才行。此外，Schiff試劑的配制方法也可影響DNA的染色反應(yīng)。（4）酶類顯示細胞內(nèi)含有多種酶,每一種酶可催化一定的化學(xué)反應(yīng)。酶的顯示法是通過顯示酶的活性來表明酶的存在，而不是酶的本身。將具有酶活性的組織放人含有一定底物的溶液中孵育，底物經(jīng)酶的作用形成初級反應(yīng)產(chǎn)物，它再與某種捕捉劑相反應(yīng),形成顯微鏡下可視性沉淀,即最終反應(yīng)產(chǎn)物。如欲顯示細胞內(nèi)酸性磷酸酶,先將切片放入含有酶底物(常用β-甘油磷酸鈉)的溶液（PH5.0)中孵育，底物經(jīng)酶的作用，水解并釋放出磷酸；用捕捉劑硝酸鉛與磷酸反應(yīng)，形成微細的磷酸鉛沉淀，此時，可在電鏡下檢出；如再用硫化銨處理時，磷酸鉛被置換成硫化鋁沉淀，可在光鏡下見到。

圖1-8酶類顯示圖1-9脂類顯示（5）脂類顯示脂類物質(zhì)包括脂肪與類脂。標(biāo)本可用甲醛固定、冷凍切片、用油紅、蘇丹Ⅲ、蘇內(nèi)Ⅵ、蘇丹黑B、尼羅藍等脂溶性染料染色；亦可用餓酸固定兼染色，脂類呈黑色。十、封藏：（一）封藏的目的：是切片能永久保存，同時使材料的結(jié)構(gòu)能在顯微鏡下清晰顯示出來。作為封藏劑的物質(zhì)必須是能與透明及相互混合，對染色劑無影響，折光率與玻片相似，且具有非常粘性的物質(zhì)。（二）常用封藏劑：樹膠：是使用最廣泛的封藏劑，種類很多，可溶于二甲苯、苯、氯仿中。溶于二甲苯后折光率為1.52接近于玻璃。用以封片幾乎無色，干后堅硬牢固，可長期保存。（三）封片的技術(shù)：1.準(zhǔn)備好蓋玻片、載玻片、鑷子、樹膠、酒精燈。2.將有標(biāo)本的波片自二甲苯中取出。3.用紗布擦去標(biāo)本周圍的二甲苯。4.如果封藏劑帶有氣泡，可將載玻片置酒精燈火焰上來回烤2-3次，以除去氣泡。5.將蓋玻片一端先與樹膠接觸，然后然蓋玻片緩緩下降，最后抽取鑷子。

第二章顯微攝影技術(shù)顯微攝影技術(shù)是生物學(xué)攝影中的一種常用技術(shù)，在生物科學(xué)領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用它可以獲得將微觀生物或組織放大數(shù)百倍乃至數(shù)千倍的照片。人們可以記錄在顯微鏡下觀察到的生物切片標(biāo)本顯微結(jié)構(gòu)的真實影像。生物顯微攝影的操作步驟較多，包括顯微鏡的調(diào)試與攝影裝置的裝配；被攝生物顯微制片的制備與鏡檢；膠卷的選擇和曝光決定；底片和照片的沖洗、制作、后加工等等。圖2-1顯微攝影裝置一、顯微攝影的裝置（一）顯微鏡1.適合顯微攝影的顯微鏡的要求：（1）照相目鏡筒要能承受住顯微攝影裝置的重量。（2）通過雙目鏡筒，能對圖象進行對焦。（3）使用光路選擇移動桿（OpticalPathSelector），能將光亮調(diào)到適合標(biāo)本需要的強度。（4）物鏡要有高分辨率和良好的平場性（整個圓形視場圖象都在一個平面上）。適合顯微鏡攝影用的物鏡與照相目鏡顯微攝影需要有高分辨率、廣視野平場的物鏡。不論哪個廠家的顯微鏡，在選擇顯微攝影用物鏡時都要注意此點。消色差物鏡不適合顯微攝影，它本身會引起視場圖象的邊緣焦點不實，而呈現(xiàn)模糊的現(xiàn)象。這是由其本身的性能引起的。如果改用平場消色差物鏡就可得到全視場清晰而平坦的圖象。所以在顯微攝影時必須選用平場消色差物鏡和平場復(fù)消色差物鏡。不僅如此，顯微照片的細微結(jié)構(gòu)和層次的優(yōu)劣，也取決于物鏡的分辨率。在進行高倍（40X）干燥系物鏡的顯微攝影時，最好采用帶校正環(huán)物鏡，因高倍干燥系物鏡的成象質(zhì)量與蓋玻片的標(biāo)準(zhǔn)厚度有關(guān)，蓋玻片的厚度不符合標(biāo)準(zhǔn)，將造成覆蓋差而影響顯微攝影的質(zhì)量。在暗場、投射式熒光及油顯微照相時，應(yīng)選用帶虹彩光闌的物鏡，借調(diào)節(jié)光闌的大小，達到最佳的圖象對比度。有些被檢物體不能應(yīng)用蓋玻片，應(yīng)選用無罩物鏡。另外在進行油浸熒光顯微照相時，應(yīng)使用無熒光油。照相目鏡的作用是為物鏡的色差、象差做光學(xué)補償，使投射到感光底片上的圖象，四周與中心都盡可能在一個焦點平面上。因此，正確選用生產(chǎn)廠家推薦的照相目鏡，是十分重要的。（5）載物臺能夠移動。（6）聚光鏡帶有孔徑光闌和調(diào)節(jié)光軸中心的機構(gòu)。聚光鏡的選擇聚光鏡在顯微攝影中的作用很大，它不僅是將光源投射來的光有效地聚焦到被檢物體上，更重要的是產(chǎn)生與物鏡相適應(yīng)的光束使圖象的反差和焦深處在最佳狀態(tài)。這些條件的獲得，是以調(diào)節(jié)聚光鏡的孔徑光闌從而使聚光鏡的數(shù)值孔徑與所用物鏡數(shù)值孔徑達到對應(yīng)關(guān)系。根據(jù)使用的意圖，可準(zhǔn)備幾種不同的聚光鏡。特別在使用超低倍物鏡，如1X、2X和4X時，視場邊緣往往發(fā)生光亮不均勻或光亮不足的缺陷，因而必須有超低倍的聚光鏡與物鏡組配。（7）顯微鏡要有視場光闌。（8）光源要保證有足夠的亮度，可以按照觀察和攝影的需要來調(diào)節(jié)光亮強度。物鏡從低倍到高倍變化時，要求光亮度都能均勻。（9）要能夠安裝濾色鏡。濾色鏡在顯微攝影中的作用濾色鏡又稱濾光鏡，它在顯微鏡的鏡檢和顯微照相種的作用是不可忽視的。合理的選用濾色鏡能提高圖象的襯度、分辨率和增強反差；在彩色顯微照相中，能調(diào)節(jié)光源的色溫。附濾色鏡的相關(guān)知識(1)濾色鏡的種類與功能濾色鏡為有色玻璃（或有色膠摸）制成的透明鏡片。濾色鏡有各種各樣，種類很多，性能不一。所以，很好地了解性能，選用符合照相目的的濾色鏡，是拍好照片的關(guān)鍵。A色溫轉(zhuǎn)換濾色鏡這是在拍攝彩色照片時，為了使顯微鏡光源的色溫與膠片本身要求的色溫相符合（色溫轉(zhuǎn)換）而使用的濾色鏡。燈光型彩色片選用LBT濾色鏡，日光型彩色片選用LBD-2濾色鏡。如果色溫轉(zhuǎn)換得不合適，就不能很好地使彩色還原。B中灰ND濾色鏡（NeutralDensityFilter）這是一種不改變色溫而減少照明的光量，并能使曝光時間延長的濾色鏡。ND25僅允許25%的光量透過，阻止75%的光量通過；ND50則允許50%的光量透過，阻止50%的光量通過。C反差濾色鏡（綠和橙黃色）這是拍攝黑白照片專用的。它是為了使標(biāo)本的色調(diào)與照片上的色調(diào)相一致，起著有時加強反差，有時減弱反差的作用。通常用綠濾色鏡（G530）或橙濾色鏡（O560）為最多。D彩色補償濾色鏡（ColorCompensatingFilter）這是為了解決彩色照相拍攝標(biāo)本顏色或背景顏色不正常時作為顏色補償用的一種濾色鏡。E銣鐠濾色鏡（OLYMPUS用FF表示）這是在拍攝彩色照片時，為了加深紅顏色而使用的一種濾色鏡F吸熱濾色鏡這是在拍攝生物標(biāo)本時，吸收來自光源的紅外線，為避免因熱輻射而使生物標(biāo)本（如活細胞等）死亡而使用的一種濾色鏡。濾色鏡本身帶有一種很淺的顏色，所以在拍攝彩色照片時顏色會發(fā)生變化，需要加彩色補償濾色鏡（CC10Y或CC10M）。(2)光源的色溫及色溫平衡濾色鏡光源的色溫，即光源的放射能，它是由波長來表現(xiàn)的，也就是由光的顏色來表現(xiàn)的。色溫以“°K”作單位，是以標(biāo)準(zhǔn)黑體的絕對溫度為起點，每升高1°C為1°K。這里必須明確，在照相上光源色溫的應(yīng)用是指光線中所含顏色的成分，而不是指光線中冷熱的溫度。日光的色溫為5500-6000°K，即指日光與標(biāo)準(zhǔn)黑體在5500-6000絕對溫度時發(fā)出的光一樣。彩色膠片在很多情況下，是以日光下進行攝影作為前提而制造出來的。換句話說，如果不與日光相同的色溫進行彩色進行彩色攝影，則就不能得到正確的顏色還原。顯微鏡的照明光源多為低壓鎢絲燈和鹵素?zé)?，前者的色溫?600-3000°K，后者為3000-3400A選擇功率高的照明光源如12V100W的鹵素?zé)?，以獲得較接近日光的色溫。B使用濾色鏡改變光源的色溫，用于此目的的濾色鏡叫做色溫轉(zhuǎn)換濾色鏡。請注意，應(yīng)用色溫轉(zhuǎn)換濾色鏡，在顯微攝影中非常重要。2.顯微鏡的安放與顯微鏡室的布置:（1）顯微鏡不要離機械設(shè)備或機器太近，也不要放置在經(jīng)常有人走過的地方，以免外界的震動使底片上的圖象模糊。（2）顯微鏡不要靠近窗戶。因為從窗戶射入的亮光影響了聚焦的準(zhǔn)確性。（3）放置顯微鏡的工作室不要太亮，否則反射光和照明的眩光透過目鏡會反射到底片上感光。（4）顯微鏡不要放置于有灰塵和骯臟的房間，并注意清潔顯微鏡。（二）適合顯微攝影的顯微攝影裝置1.顯微攝影裝置的要求（1）要有能夠連接顯微照相機附件的裝置，如35mm照相機后背或大畫面底片暗盒。（2）能按照攝影中需要的不同光亮條件進行光路調(diào)節(jié)。（3）能夠?qū)?biāo)本不同的面積進行測光（對30%面積的平均測光，或?qū)?%、0.1%面積的點測光）。（4）能夠把照相機附件牢固地固定在顯微鏡上?？蛇B接色溫測定的裝置。（5）ISO/ASA感光度要有廣泛的選擇范圍。（6）要有倒易律失效補償裝置，可以進行長時間的自動曝光。（7）要能夠根據(jù)標(biāo)本的具體情況，進行曝光量的調(diào)節(jié)。（8）要能夠進行手動曝光。（9）要能裝配特殊用途的裝置，如拍16mm電影或35mm膠片的定使定格攝影（在此情況下，還應(yīng)有專門的曝光控制裝置）。（10）控制器內(nèi)要裝有自動曝光鎖機構(gòu)2.顯微攝影裝置一般有：（1）手控曝光顯微攝影裝置：包括專為顯微攝影用的不帶鏡頭的鏡箱。需要目測或測光表，測出光值后，先推出正確的曝光時間，再進行手控曝光。如OLYMPUS老型號的PM-6，PM-10-35和測光表EMM-7。（2）單鏡頭反光鏡箱顯微攝影裝置。如OLYMPUSOM系列，鏡箱內(nèi)有內(nèi)測光系統(tǒng)，可以自動曝光。（3）自動曝光顯微攝影專用裝置。具有自動卷片、自動測光、自動控制曝光以及測量色溫和倒易律失效的補償?shù)裙δ?。如OLYMPUSPM-10-AD系列，PM20/30系列。（三）照相機一般常用高質(zhì)量單鏡頭反光式135相機。1.單鏡頭反光照相機的設(shè)計普通單鏡頭反光照相機獨一無二的性能在于其取景器的設(shè)計。被攝體的反射光經(jīng)過鏡頭照射在一面呈45度角的反光鏡上，然后光線向上反射透過聚焦屏進入五棱鏡，光線在此經(jīng)由安裝在后部的取景窗透射出照相機。這就意味著無論安裝在照相機上的鏡頭其焦距有多長，拍攝者透過取景器所觀察到的場景與鏡頭所看到的完全一致。圖2-2照相機的內(nèi)部結(jié)構(gòu)圖2-3照相機鏡頭（1）鏡頭：鏡頭的調(diào)節(jié)主要是指焦距和光圈的調(diào)節(jié)。大多數(shù)鏡頭都標(biāo)有距離指示，告訴你鏡頭調(diào)焦的遠近、景深范圍的大小，以及清晰聚焦區(qū)域的寬窄。（景深:被攝體周圍適度清晰聚焦的范圍）影響景深的三個因素是光圈，被攝體到照相機的距離，以及鏡頭的焦距。焦距最短的鏡頭對準(zhǔn)無限遠聚焦時，其最小的有效光圈能產(chǎn)生最大景深。也就是說光圈越大，焦距越長，被攝體距離越近，景深就越小。光圈的調(diào)整是控制膠片曝光的一個重要因素。最佳光圈的選擇有賴于景物所需的景深多少和快門速度的調(diào)定?？焖倏扉T能凝固被攝體的動作，避免照相機抖動影響景象質(zhì)量，而慢速快門能產(chǎn)生模糊影象。①口徑：②光圈：控制進光量。向上轉(zhuǎn)動光圈環(huán)至下一個f/光圈數(shù)（例如從f/4到f/5.6）,光圈大小減半（即達到膠片的光量減半）；向下轉(zhuǎn)動光圈環(huán)至下一個f/光圈數(shù)（例如從f/4到f/2.8）。光圈大小增加一倍。③焦距：④視角：（2）鏡頭的種類：

①標(biāo)準(zhǔn)鏡頭：用標(biāo)準(zhǔn)鏡頭拍攝的影象與我們用裸眼看的景物大致相仿。大部分35毫米單反機都配備一只標(biāo)準(zhǔn)鏡頭，但也可以換用焦距較短的或較長的鏡頭。標(biāo)準(zhǔn)鏡頭的最大光圈孔徑往往比較大，因此適合在低照度下使用。標(biāo)準(zhǔn)鏡頭適用于拍攝大部分戶外景物。②廣角鏡頭：廣角鏡頭比標(biāo)準(zhǔn)鏡頭的視角寬，有利于拍攝群體像或在狹窄和的空間里攝影。如果在使用時太靠近被攝體，可有會出現(xiàn)影象變形現(xiàn)象，無論光圈調(diào)在哪一級，其景深都比較大，因此，當(dāng)被攝體的每一部分都必須清晰再現(xiàn)時，這種性能就十分見效。廣角鏡頭適用于拍攝內(nèi)景。③變焦鏡頭：變焦鏡頭可通過調(diào)節(jié)焦距來仔細調(diào)整被攝體的畫幅。每一只變焦鏡頭包括了三四只固定焦距的鏡頭的焦距范圍，給你的合理消費帶來巨大的靈活性。由于無需顧及鏡頭的更換，因此錯過重要瞬間的可能性也相應(yīng)減小。變焦鏡頭適用于拍攝動態(tài)畫面。④長焦鏡頭：在拍攝遠距離的大影象時，或當(dāng)你使用較短的鏡頭無法靠近被攝體時，長焦鏡頭就顯得十分有用，由于長焦鏡頭份量重，因此利用其高速快門速度，避免照相機抖動比份量較輕、焦距較短的鏡頭在這方面顯得更為重要。遠攝鏡頭是一種結(jié)構(gòu)小巧，長度較短的長焦鏡頭。長焦鏡頭適用于拍攝自然歷史的題材。圖2-4各種鏡頭（3）照相機的其他部件:機身、快門和快門調(diào)節(jié)裝置、取景器、測距器、閃光連動裝置。二、顯微攝影的基礎(chǔ)知識1．顯微攝影裝置的放大倍率照片的放大倍率，