生物化學：第二章蛋白質化學

第二章蛋白質化學

（ChemistryofProtein)生化教研室：導學掌握蛋白質的分子組成與結構熟悉蛋白質的理化；常用分離、純化技術的基本原理。了解蛋白質分子結構與功能的關系；蛋白質的分類以及重要的活性肽。教學內容

蛋白質的分子組成蛋白質的分子結構蛋白質的理化性質與分離純化第一節(jié)蛋白質的分子組成蛋白質含量=樣品所含氮量×6.25一、蛋白質元素組成：蛋白質的特征元素，平均含量：16%CHONS二、蛋白質的基本組成單位—氨基酸（一）氨基酸的結構α共同結構氨基酸結構特點：20種編碼氨基酸氨基酸的不同在于R側鏈不同均為L-α-氨基酸（甘氨酸、脯氨酸除外）（二）氨基酸的分類非極性中性氨基酸極性中性基氨基酸極性酸性氨基酸極性堿性氨基酸根據R基極性大小分：R基有極性，但不帶電，呈親水性R基無極性，呈疏水性R基有極性，電離后R基帶負電荷R基有極性，電離后R基帶正電荷非極性中性氨基酸極性中性氨基酸酸性氨基酸堿性氨基酸H2N-C-NH—=NH（三）氨基酸的理化性質氨基酸具有氨基、羧基等能接受H+而成——NH3+具堿性能電離出H+而成——COO-具酸性兩性電離和等電點氨基酸的兩性電離pH<pIpH=pI（兼性離子）pH>pI等電點：氨基酸所帶正負電荷相等時溶液的pH（pI）值即該氨基酸的等電點2.紫外吸收特性色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在280nm附近。3.茚三酮反應

（藍紫色）脯氨酸、羥脯氨酸與茚三酮反應生成黃色化合物三、肽

（一）肽的形成和命名

肽鍵的形成1.肽鍵2.肽的形成與命名肽、寡肽(oligopeptide)、多肽(polypeptide)多肽鏈（polypeptidechain）主鏈骨架（backbone）側鏈部分（sidechain）羧基末端或C-末端（C-terminus）氨基末端或N-末端（N-terminus）多肽鏈的結構

側鏈N-末端C-末端主鏈骨架HOH（二）體內重要的肽

谷胱甘肽（GSH）的結構Glu-Cys-Gly功能基：-SH解毒劑、抗氧化劑第二節(jié)蛋白質的分子結構蛋白質的分子結構基本結構空間結構一級結構二級結構三級結構四級結構一、一級結構概念：多肽鏈中氨基酸的組成與排列順序主鍵：肽鍵意義：決定蛋白質的空間結構胰島素的一級結構A鏈B鏈二、維持蛋白質構象的主要作用力二、二級結構（secondarystructure）定義多肽主鏈骨架的局部構象，不涉及側鏈的空間排布。肽鍵平面（一）二級結構的類型α-螺旋β-折疊β-轉角無規(guī)則卷曲1.α-螺旋（α-helix）

右手螺旋

每周含3.6個殘基

螺距0.54nm

作用鍵：氫鍵0.50nm0.54nm氫鍵α-碳原子側鏈2.β-折疊

（β-sheet）鋸齒狀順向平行、逆向平行作用鍵：氫鍵平行俯視側視反平行俯視側視3.β-轉角（β-turn）4．無規(guī)卷曲（randomcoil）肽鏈的肽鍵平面不規(guī)則排列，形成松散的二級結構。（二）超二級結構與結構域

超二級結構（supersecondarystructure）二級結構單元進一步聚集和組合在一起——模序（motif）如αα、βαβ、βββ等

亮氨酸拉鏈和鋅指結構

三、三級結構

（tertiarystructure）定義：在二級結構基礎上，所有原子（主鏈+側鏈）相互作用形成的空間構象

三、三級結構

（tertiarystructure）化學鍵--氫鍵、疏水鍵、離子鍵、二硫鍵等次級鍵--親水基團：分子表面；疏水基團：分子內部三級結構示意圖二硫鍵極性基團離子鍵超二級結構與結構域結構域（domain）超二級結構的進一步組合、折疊形成的球狀區(qū)域。是蛋白質的功能部位免疫球蛋白結構域

重鏈輕鏈結構域四、四級結構（quaternarystructre）定義：兩個或兩個以上獨立三級結構的多肽鏈通過次級鍵結合而形成的空間結構疏水鍵、氫鍵、鹽鍵亞基血紅蛋白四級結構示意圖4個亞基構成2α-亞基2β-亞基

蛋白質一、二、三、四級結構示意圖五、維持蛋白質分子空間構象的主要化學鍵

氫鍵、疏水鍵、離子鍵、范德華力、二硫鍵等蛋白質分子中的主要次級鍵

離子鍵疏水鍵二硫鍵

氫鍵范德華力六、蛋白質結構與功能的關系蛋白質的一級結構決定其高級結構蛋白質的空間構象決定蛋白質的生物學功能。（一）一級結構與功能的關系

某些蛋白質的一級結構加工后，才具有生物學活性。如胰島素原（proinsulin）的一級結構加工（一）一級結構與功能的關系一級結構的改變可引起某些疾病的發(fā)生由于蛋白質分子的變異或缺失而產生的疾病，稱為分子?。╩oleculardisease）。如鐮狀紅細胞性貧血（二）空間結構與功能的關系空間構象決定蛋白質功能構象改變，功能改變血紅蛋白結合氧前后構象的變化當血紅蛋白結合氧以后，α1β1與α2β2兩個二聚體彼此滑動15°，其構象由T（tense）型轉變?yōu)镽（relaxed）型。Hb(T態(tài))HbO2(R態(tài))α1β1α2β215o任何一個亞基接受氧分子后，會增進其它亞基吸附氧分子的能力環(huán)境氧濃度高時Hb快速吸收氧分子環(huán)境氧濃度低時Hb快速釋出氧分子動脈靜脈血紅蛋白對氧的運輸第三節(jié)蛋白質的理化性質與分離純化一、蛋白質的理化性質（一）蛋白質的一般性質

1.蛋白質的紫外吸收特征蛋白質（色氨酸、酪氨酸）（苯丙氨酸）

λ=280nmλ=260nm

紫外吸收（與蛋白質濃度成正比）蛋白質的紫外吸收10,000100010010200250300波長（nm）TrpPheTyr摩爾吸光度（M-1cm-1）2.蛋白質的兩性電離和等電點與氨基酸的兩性電離、等電點相同雙縮脲反應：

Cu2+

蛋白質紫色絡合物

OH-3.蛋白質的呈色反應顏色反應→光吸收→定量分析3.蛋白質的呈色反應顏色反應→光吸收→定量分析酚試劑反應：磷鎢酸蛋白質藍色化合物磷鉬酸米倫試劑反應：米倫試劑蛋白質紅色沉淀△3.蛋白質的呈色反應顏色反應→光吸收→定量分析考馬斯亮藍反應：考馬斯亮藍蛋白質（R-250）紅藍色（G-250）藍綠色3.蛋白質的呈色反應顏色反應→光吸收→定量分析一、透析

(dialysis)用透析袋（半透膜）把大分子和小分子分開的方法（二）蛋白質的高分子性質蛋白質的膠體性質蛋白質分子的直徑在膠體顆粒的范圍(1~100nm)蛋白質溶液是穩(wěn)定親水膠體溶液穩(wěn)定因素：水化膜、同種電荷二、蛋白質沉淀堿堿酸酸沉淀(precipitation)定義：蛋白質分子相互聚集從溶液中析出的現象原理：破壞同種電荷和水化膜方法：鹽析法有機溶劑沉淀法重金屬鹽沉淀法生物堿試劑沉淀法1.鹽析（saltingout）法

定義：高濃度中性鹽使蛋白質從溶液中析出沉淀的方法原理：破壞水化膜、中和電荷特點：蛋白質不變性分段鹽析：不同濃度的中性鹽分離不同蛋白質2.有機溶劑沉淀蛋白質

原理：破壞水化膜條件：pH=pI特點：常在低溫下進行常用有機溶劑：乙醇、丙酮等3.重金屬鹽沉淀蛋白質原理：中和負電荷條件：pH＞pI特點：蛋白質變性4.生物堿試劑與某些酸類沉淀蛋白質原理：中和正電荷條件：pH＜pI特點：蛋白質變性常用酸類：苦味酸、鞣酸、鎢酸、三氯醋酸、硝酸、過氯酸等三、蛋白質的變性與復性變性劑蛋白質空間構象破壞生物學活性喪失理化性質改變加熱、酸堿、有機溶劑、尿素、鹽酸胍、去污劑易水解易沉淀蛋白質非共價鍵和二硫鍵破壞，不涉及肽鍵復性：去除變性因素，蛋白質恢復空間構象與生物學活性的過程三、蛋白質的變性與復性核糖核酸酶的變性與復性示意圖8M尿素或β-巰基乙醇透析某些蛋白質在發(fā)生熱變性后，松散的多肽鏈相互纏繞在一起，變成固體狀態(tài)，稱為蛋白質的凝固（coagulation）。2.蛋白質的擴散與沉降蛋白質分子大，擴散速度慢沉降：通過超速離心克服布朗運動使蛋白質顆粒下沉的現象沉降系數（S）可粗略反映蛋白質分子大小二、蛋白質的分離純化鑒定技術

蛋白質在細胞內常與核酸、多糖、脂類及其它小分子物質結合在一起，需要對其進行分離、純化與鑒定。（一）離心原理：分子大小、密度不同→沉降速度不同分類：普通離心：3~10kr/min

高速離心：10~25kr/min

超速離心：＞25kr/min常用S值表示蛋白質分子質量相對大小（四）蛋白質層析

（chromatography）定義：待分離的液體（流動相mobilephase）經過一個固態(tài)物質（固定相solidphase)后所發(fā)生的各組分在兩相中分布的變化。原理：根據混合物溶液中蛋白質分子的大小、形狀、極性、親和力等差異而加以分離。類型：離子交換層析（ionexchangechromatography）凝膠過濾層析(gelfiltrationchromatography)親和層析(affinitychromatography)（四）蛋白質層析（chromatography）（五）電泳（electrophoresis）定義：帶電顆粒在電場中將向與自身電荷相反的電極移動，從而到達分離的方法。常用的電泳技術：瓊脂糖凝膠電泳（agarosegelelectrophoresis，AGE）聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE）等電聚焦電泳（isoelectricfocusing，IEF）雙向電泳（twodimensionalelectrophoresis，2DE）毛細管電泳（capillaryelectrophoresis，CE）（五）電泳（electroph