細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)常見(jiàn)問(wèn)題解答

細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)問(wèn)答B(yǎng)HK細(xì)胞就是指BHK21嗎？答：BHK細(xì)胞是指幼年敘利亞地鼠腎細(xì)胞(BabyHamsterSyrianKidney),1961年建株。原始的細(xì)胞株是成纖維細(xì)胞，貼壁依賴性。1963年獲得單細(xì)胞克隆細(xì)胞。后經(jīng)無(wú)數(shù)次傳代后細(xì)胞可懸浮生長(zhǎng),它廣泛用于增殖各種病毒，生產(chǎn)獸用疫苗。最常用的是BHK21的一個(gè)亞克隆細(xì)胞，即克隆13或C13。二倍體細(xì)胞有什么特點(diǎn)？答：二倍體細(xì)胞的染色體組型是2n核型；貼壁依賴接觸抑制；一般可傳代培養(yǎng)50代；無(wú)致瘤性。如W1-38：正常胚肺組織人二倍體細(xì)胞系。MRC-5:從正常男性肺組織中獲得的人二倍體細(xì)胞系。什么是動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)？答：所謂動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)(large-scaleculturetechnology)是指在人工條件下(設(shè)定pH、溫度、溶氧等)，在細(xì)胞生物反應(yīng)器(bioreactor)中高密度大量培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞用于生產(chǎn)生物制品的技術(shù)。目前可大規(guī)模培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞有雞胚、豬腎、猴腎、地鼠腎等多種原代細(xì)胞及人二倍體細(xì)胞、CHO(中華倉(cāng)鼠卵巢)細(xì)胞、BHK-21、Vero細(xì)胞(非洲綠猴腎傳代細(xì)胞)等，并已成功生產(chǎn)了包括狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、紅細(xì)胞生成素、單克隆抗體等產(chǎn)品。在過(guò)去幾十年來(lái)，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)經(jīng)有了很大發(fā)展，從使用轉(zhuǎn)瓶(rollerbottle)、CellCube等貼壁細(xì)胞培養(yǎng)，發(fā)展為生物反應(yīng)器(Bioreactor)進(jìn)行大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)。細(xì)胞體內(nèi)外培養(yǎng)的差別是什么？答：細(xì)胞離體后，失去了神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)和細(xì)胞間的相互影響，生活在缺乏動(dòng)態(tài)平衡相對(duì)穩(wěn)定環(huán)境中，日久天長(zhǎng)，易發(fā)生如下變化：分化現(xiàn)象減弱；形態(tài)功能趨于單一化或生存一定時(shí)間后衰退死亡；或發(fā)生轉(zhuǎn)化獲得不死性，變成可無(wú)限生長(zhǎng)的連續(xù)細(xì)胞系或惡性細(xì)胞系。因此，培養(yǎng)中的細(xì)胞可視為一種在特定的條件下的細(xì)胞群體，它們既保持著與體內(nèi)細(xì)胞相同的基本結(jié)構(gòu)和功能，也有一些不同于體內(nèi)細(xì)胞的性狀。實(shí)際上從細(xì)胞一旦被置于體外培養(yǎng)后，這種差異就開(kāi)始發(fā)生了。什么是無(wú)血清培養(yǎng)基？與普通培養(yǎng)基有什么區(qū)別？答：無(wú)血清培養(yǎng)基(serumfreemedium,SFM):是不需要添加血清就可以維持細(xì)胞在體外較長(zhǎng)時(shí)間生長(zhǎng)繁殖的合成培養(yǎng)基。但是它們可能包含個(gè)別蛋白或大量蛋白組分?；境煞譃榛A(chǔ)培養(yǎng)基及添加組分兩大部分。添加組分可能包括纖連蛋白、層粘連蛋白等貼壁因子、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、硒等。什么是無(wú)血清無(wú)動(dòng)物組分培養(yǎng)基、無(wú)蛋白培養(yǎng)基和限定化學(xué)成分培養(yǎng)基？答：無(wú)血清無(wú)動(dòng)物組分培養(yǎng)基是不含任何動(dòng)物來(lái)源成份的無(wú)血清培養(yǎng)基，但可能添加植物蛋白或重組蛋白。無(wú)蛋白培養(yǎng)基(proteinfreemidium,PFM):即不含有蛋白的培養(yǎng)基，無(wú)論是植物蛋白或動(dòng)物蛋白。成分培養(yǎng)基(chemicaldefinedmedium,CDM):是指培養(yǎng)基中的素有成分都是明確的，它同樣不含有蛋白，也不是添加了植物水解物，而是使用了一些已知結(jié)構(gòu)與功能的小分子化合物，如短肽等。這種培養(yǎng)基更有利于分析細(xì)胞的分泌產(chǎn)物和產(chǎn)品純化。HEPES在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中起什么作用？答：HEPES溶液：是一種弱酸，中文名字是羥乙基哌秦乙硫磺酸，主要作用是防止培養(yǎng)基pH迅速變動(dòng)。在開(kāi)放式培養(yǎng)條件下，觀察細(xì)胞時(shí)培養(yǎng)基脫離了5%CO2的環(huán)境，CO2氣體迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此時(shí)可以維持pH7.0左右。一般在進(jìn)行克隆化培養(yǎng)時(shí)要添加HEPES。CO2培養(yǎng)箱之水盤(pán)如何保持清潔？答：定期（至少每?jī)芍芤淮危┮詿o(wú)菌蒸餾水或無(wú)菌去離子水更換之。培養(yǎng)基生產(chǎn)和使用常見(jiàn)問(wèn)題低血清培養(yǎng)基能用肉眼判斷其pH值嗎？答：低血清培養(yǎng)基中酚紅的含量與普通培養(yǎng)基中的酚紅含量不同，不能通過(guò)肉眼觀察或通過(guò)經(jīng)驗(yàn)來(lái)判定pH值，建議使用pH計(jì)進(jìn)行測(cè)定。低血清培養(yǎng)基的緩沖系統(tǒng)是什么？答：平衡鹽一般是由無(wú)機(jī)鹽及葡萄糖組成的。平衡鹽有Hanks，系統(tǒng)、Earless系統(tǒng)、Dulbecco、磷酸緩沖鹽系統(tǒng)等。199系列培養(yǎng)基、MEM系列培養(yǎng)基均有Hanks，系統(tǒng)的培養(yǎng)基及Earless系統(tǒng)的培養(yǎng)基。但是有些培養(yǎng)基均不是以上常規(guī)的平衡鹽系統(tǒng)，例如RPMI1640培養(yǎng)基、F12培養(yǎng)基。MEM（SLM）低血清培養(yǎng)基的平衡鹽系統(tǒng)也不是常規(guī)的平衡鹽系統(tǒng)，該平衡鹽系統(tǒng)的緩沖能力強(qiáng)于常規(guī)平衡鹽系統(tǒng)的緩沖能力。谷氨酰胺溶液和碳酸氫鈉的配制方法是什么？答：以0.2mol/L的L-谷氨酰胺配制為例：稱(chēng)取L-谷氨酰胺2.92g，加注射用水100ml，充分?jǐn)嚢杌靹?。?.2叩濾膜正壓過(guò)濾除菌。溶液應(yīng)在4°C下避光保存，2周內(nèi)使用。以7.5%NaHCO3的配制為例：稱(chēng)取NaHCO37.5g溶于100ml蒸餾水中過(guò)濾除菌。什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅？答：酚紅在培養(yǎng)基中用作pH值的指示劑：中性時(shí)為紅色，酸性時(shí)為黃色，堿性時(shí)為紫色。酚紅本身對(duì)生物制品質(zhì)量并不會(huì)產(chǎn)生影響，可以通過(guò)純化技術(shù)去除，但酚紅在無(wú)血清培養(yǎng)基可能帶來(lái)胞內(nèi)鈉/鉀失衡，影響細(xì)胞生長(zhǎng)，當(dāng)然這種作用能被血清所中和或減輕。酚紅并不是培養(yǎng)基中必需的一種成分，很多國(guó)外的疫苗或抗體生產(chǎn)企業(yè)在生產(chǎn)過(guò)程中都使用無(wú)酚紅培養(yǎng)基。放置在冰箱中的培養(yǎng)基顏色會(huì)發(fā)生變化，為什么？答：培養(yǎng)基保存于4C冰箱中，培養(yǎng)基內(nèi)CO2會(huì)逐漸溢出，造成培養(yǎng)基越來(lái)越偏堿性。而培養(yǎng)基中酸堿指示劑（通常為phenolred）的顏色也會(huì)隨堿性增加而更偏暗紅。培養(yǎng)基偏堿后再用于細(xì)胞培養(yǎng)將造成細(xì)胞生長(zhǎng)停滯或死亡。培養(yǎng)基偏堿時(shí)，可以通入無(wú)菌過(guò)濾的CO2,以調(diào)整pH值。

無(wú)血清培養(yǎng)與有血清培養(yǎng)使用的抗生素量一樣嗎？答：當(dāng)在無(wú)血清培養(yǎng)基中添加抗生素時(shí)，降低至少在有血清培養(yǎng)基中所使用濃度的50%。因?yàn)檠逯械牡鞍讜?huì)結(jié)合和滅活一些抗生素。而在無(wú)血清培養(yǎng)條件下，抗生素不被滅活。培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素后，可長(zhǎng)期保存嗎？答：一旦您在新鮮培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素時(shí)，您應(yīng)該在兩到三周內(nèi)使用它。因?yàn)橐恍┛股睾脱逯械幕境煞衷诮鈨龊缶烷_(kāi)始降解。什么是個(gè)性化培養(yǎng)基？它有什么優(yōu)點(diǎn)？答：根據(jù)細(xì)胞類(lèi)型、培養(yǎng)方式和生產(chǎn)工藝等特點(diǎn)所定制的培養(yǎng)基，即個(gè)性化培養(yǎng)基。個(gè)性化培養(yǎng)基在國(guó)外生物制藥企業(yè)被普遍采用，個(gè)性化培養(yǎng)基可以為細(xì)胞生長(zhǎng)提供充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，能提高細(xì)胞的生長(zhǎng)速率、培養(yǎng)密度、以及延長(zhǎng)細(xì)胞維持時(shí)間；也可以為細(xì)胞生長(zhǎng)提供均衡的營(yíng)養(yǎng)供給，減少細(xì)胞有害代謝物質(zhì)的積累，降低對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的危害；同時(shí)對(duì)貼壁細(xì)胞而言，能增加細(xì)胞的貼壁性，并降低培養(yǎng)過(guò)程中剪切力對(duì)細(xì)胞的損傷；個(gè)性化培養(yǎng)基可以根據(jù)各戶的特殊需求減少或不使用動(dòng)物源成分，從而使生物制品安全性更有保障。細(xì)胞培養(yǎng)基偶然被凍，可否繼續(xù)使用？答：如果細(xì)胞培養(yǎng)基偶然被凍，您應(yīng)該自然溶解培養(yǎng)基并觀察是否有沉淀產(chǎn)生。如果沒(méi)有沉淀產(chǎn)生,培養(yǎng)基可以正常使用，如果出現(xiàn)沉淀，只能丟棄這些培養(yǎng)基。細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基之成份為何？答：動(dòng)物細(xì)胞冷凍保存時(shí)最常使用的冷凍培養(yǎng)基是含5-10%DMSO(dimethylsulfoxide)和90-95%原來(lái)細(xì)胞生長(zhǎng)用的新鮮培養(yǎng)基均勻混合。注意：由于DMSO稀釋時(shí)會(huì)放出大量熱能，故不可將DMSO直接加入細(xì)胞液中，必須使用前先行配制完成。培養(yǎng)基及其它添加物和試劑可反復(fù)凍融嗎？答：大部分添加物和試劑最多可以凍融3次，如果次數(shù)過(guò)多會(huì)將使含有的蛋發(fā)生降解和沉淀，這將會(huì)影響它的性能。液體培養(yǎng)基的保存是冷藏好？還是冷凍好？答：要冷藏??！通常液體培養(yǎng)基在冷藏條件下可存放6個(gè)月到一年。常見(jiàn)血清使用問(wèn)題III常見(jiàn)血清使用問(wèn)題III血清使用時(shí)一定需要滅活么？答：實(shí)驗(yàn)顯示，經(jīng)過(guò)正確處理的熱滅活血清對(duì)大多數(shù)的細(xì)胞而言是不需要的。經(jīng)此處理過(guò)的血清對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)只有微小的促進(jìn)，或完全沒(méi)有任何作用，甚至因?yàn)楦邷靥幚碛绊懥搜宓馁|(zhì)量，而造成細(xì)胞生長(zhǎng)速率的降低。而經(jīng)過(guò)熱處理的血清，沉淀物的形成會(huì)顯著的增多，這些沉淀物在倒置顯微鏡下觀察，像是“小黑點(diǎn)”，常常會(huì)讓研究者誤以為是血清遭受污染，而把血清放在37°C環(huán)境中，又會(huì)使此沉淀物更增多，使研究者誤認(rèn)為是微生物的分裂擴(kuò)增。若非必須，可以不需要做熱處理這一步。不但節(jié)省時(shí)間，更確保血清的質(zhì)量。何謂FBS,FCS,CS,HS?答：FBS(fetalbovineserum)和FCS(fetalcalfserum)是相同的意思，兩者都是指胎牛血清，F(xiàn)CS乃錯(cuò)誤的使用字眼，請(qǐng)不要再使用。CS(calfserum)則是指小牛血清。HS(horseserum)則是指馬血清。保存血清最好的方法是什么？答：我們建議血清應(yīng)保存在-5°C至-2O°C。若存放于4°C時(shí)，請(qǐng)勿超過(guò)一個(gè)月。若一次無(wú)法用完一瓶,建議無(wú)菌分裝血清至恰當(dāng)?shù)臏缇萜鲀?nèi)，再放回冷凍。如何解凍血清才不會(huì)使產(chǎn)品質(zhì)量受損？答：將血清從冷凍箱取出后，先置于2?8C冰箱使之融解，然后在室溫下使之全融。但必須注意的是，融解過(guò)程中必須規(guī)則地?fù)u晃均勻。血清解凍后發(fā)現(xiàn)有絮狀沉淀物出現(xiàn)，該如何處理?答：血清中沉淀物的出現(xiàn)有許多種原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的變性所造成，而血纖維蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血清解凍后，也會(huì)存在于血清中，亦是造成沉淀物的原因之一。但這些絮狀沉淀物，并不影響血清本身的質(zhì)量。若欲去除這些絮狀沉淀物，可以將血清分裝至無(wú)菌離心管內(nèi)，以400g稍微離心，上清液即可接著加入培養(yǎng)基內(nèi)一起過(guò)濾。最好不使用過(guò)濾的方法去除這些絮狀沉淀物，因?yàn)樗赡軙?huì)阻塞過(guò)濾膜。如何避免血清中沉淀物的產(chǎn)生？答:(1)解凍血清時(shí)，請(qǐng)按照所建議的逐步解凍法(-20C至4C至室溫)，若血清解凍時(shí)改變的溫度太大(如-20C至37C),非常容易產(chǎn)生沉淀物。解凍血清時(shí)，請(qǐng)隨時(shí)將之搖晃均勻，使溫度及成分均一，減少沉淀的發(fā)生。請(qǐng)勿將血清置于37C太久。若在37C放置太久，血清會(huì)變得混濁，同時(shí)血清中許多較不穩(wěn)定的成分也會(huì)因此受到損害，而影響血清的質(zhì)量。血清的熱滅活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以無(wú)須做此步驟。若必須做血清的熱滅活，請(qǐng)遵守56C,30分鐘的原則，并且隨時(shí)搖晃均勻。溫度過(guò)高，時(shí)間過(guò)久或搖晃不均勻，都會(huì)造成沉淀物的增多。細(xì)胞培養(yǎng)常用試劑使用問(wèn)答谷氨酰胺使用方法是什么？答：谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，故4C下放置1周可分解50%,使用中最好單獨(dú)配制，置-20C冰箱中保存，用前加入培養(yǎng)液中。碳酸氫鈉在室溫條件存放是否穩(wěn)定？答：碳酸氫鈉白色粉末，或不透明單斜晶系細(xì)微結(jié)晶。比重2.159。無(wú)臭、味咸，可溶于水，微溶于乙醇。其水溶液因水解而呈微堿性，受熱易分解，在65°C以上迅速分解，在270°C時(shí)完全失去二氧化碳，在干燥空氣中無(wú)變化，在潮濕空氣中緩慢分解。培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)減慢的原因有哪些？其解決辦法有哪些？答：可能得原因有：更換了不同的培養(yǎng)液或血清；培養(yǎng)液中一些細(xì)胞生長(zhǎng)必需成分如谷氨酰胺或生長(zhǎng)因子等耗盡或缺乏或已被破壞；培養(yǎng)物中有少量細(xì)菌或真菌污染；試劑保存不當(dāng)；比較新培養(yǎng)液與原培養(yǎng)液成分，比較新血清與舊血清支持細(xì)胞生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)找出可能的原因。解決辦法：增加起始培養(yǎng)細(xì)胞濃度；讓細(xì)胞逐漸適應(yīng)新培養(yǎng)液；換入新鮮配制培養(yǎng)液；補(bǔ)加谷氨酰胺或生長(zhǎng)因子等；用無(wú)抗生素培養(yǎng)液培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)污染，丟棄培養(yǎng)物，或用抗生素除菌；血清需保存在-5C到-20C；培養(yǎng)液需在2-8C避光保存；含血清完全培養(yǎng)液在2-8C保存，并在2周內(nèi)用完;分離培養(yǎng)物，檢測(cè)支原體。L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)中重要嗎？它在溶液中不穩(wěn)定嗎？答：L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)非常重要的。脫掉氨基后，L-谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來(lái)源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后會(huì)降解，降解率隨保存溫度而變。L-谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成，而氨對(duì)于一些細(xì)胞具有毒性。細(xì)胞傳代消化時(shí)所用胰酶濃度越高越好嗎？答：不見(jiàn)得！因?yàn)橐鹊鞍酌溉芤旱南芰κ呛腿芤旱膒H、溫度、胰酶濃度及溶液中是否含有Ca++,Mg++離子和血清等因素有關(guān)。通常情況下，pH8.0,溫度37oC其作用能力最強(qiáng)。另外，鈣、鎂離子及血清均能大大降低其消化能力。我們每次進(jìn)行傳代消化前，一定要用D-Hanks液或PBS液反復(fù)沖洗細(xì)胞培養(yǎng)瓶，以便于將含血清的培養(yǎng)基沖洗干凈，這樣就能大大提高消化液的消化能力。通常使用的消化液濃度為：0.05%胰蛋白酶+0.02%EDTA；0.25%胰蛋白酶多數(shù)細(xì)胞傳代消化可使用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA這種消化液。二價(jià)離子抑制胰蛋白酶活性嗎？使用胰蛋白酶時(shí)加入EDTA的目的是什么？答：二價(jià)離子的確抑制胰蛋白酶活性。EDTA用來(lái)螯合游離的鎂離子和鈣離子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細(xì)胞前，用EDTA清洗細(xì)胞，以消除來(lái)自培養(yǎng)基中所有的二價(jià)離子。GlutaMAX-I是什么？培養(yǎng)細(xì)胞如何利用GlutaMAX-I？這個(gè)二肽有多穩(wěn)定？答：GlutaMAX-I即谷丙氨酸二肽，是一個(gè)L-谷氨酰胺的衍生物，其不穩(wěn)定的alpha-氨基用L-丙氨酸來(lái)保護(hù)。一種肽酶逐漸裂解二肽，釋放L-谷氨酰胺供利用。GlutaMAX-I二肽非常穩(wěn)定，即使在121磅滅菌20分鐘，GlutaMAX-I二肽溶液有最小的降解，如果在相同條件下，L-谷氨酰胺幾乎完全降解。培養(yǎng)基中丙酮酸鈉的作用是什么？答：丙酮酸鈉可以作為細(xì)胞培養(yǎng)中的替代碳源，盡管細(xì)胞更傾向于以葡萄糖作為碳源，但是，如果沒(méi)有葡萄糖的話，細(xì)胞也可以代謝丙酮酸鈉。Hank，s平衡鹽溶液(HBS)和Earless平衡鹽溶液(EBS)有什么本質(zhì)的功能差別？答：HBS和EBS的主要差別在于碳酸氫鈉的水平，在Eagle、(2.2g/L)中比在Hanks，(0.35g/L)中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡，以維持溶液的PH值。Eagle's液在空氣水平的CO2中，溶液會(huì)變堿，Hanks'液在CO2培養(yǎng)箱中會(huì)變酸。如果希望在CO2培養(yǎng)箱中保存組織，需要用Eagle's液，。如果僅僅是清洗將要在細(xì)胞培養(yǎng)基中儲(chǔ)存的組織，用Hanks'液就可以了。細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程常見(jiàn)問(wèn)題為什么培養(yǎng)的細(xì)胞要及時(shí)傳代？答：體外培養(yǎng)的細(xì)胞大多具有生長(zhǎng)接觸抑制的特性，也就是說(shuō)當(dāng)一個(gè)細(xì)胞被其他細(xì)胞包圍的時(shí)候，它就會(huì)停止生長(zhǎng)，及時(shí)傳代后，細(xì)胞的生長(zhǎng)得以繼續(xù)。培養(yǎng)液pH下降很快可能原因有哪些？其解決辦法是什么？答：通常細(xì)胞生長(zhǎng)得非?？鞎r(shí)，pH值通常下降得很快。此時(shí)可以及時(shí)傳代、提高傳代比例或降低血清量等方法進(jìn)行解決。此外，培養(yǎng)瓶蓋擰得太緊、NaHCO3緩沖系統(tǒng)緩沖能力不夠、培養(yǎng)液中鹽濃度不正確、細(xì)菌、酵母或真菌污染等也能導(dǎo)致pH值通常下降得很快。按培養(yǎng)液中NaHCO3濃度增加或減少培養(yǎng)箱內(nèi)CO2濃度，2.0g/L到3.7g/L濃度NaHCO3對(duì)應(yīng)CO2濃度為5%到10%。改用不依賴CO2培養(yǎng)液。松開(kāi)瓶蓋1/4圈。加HEPES緩沖液至10到25mM終濃度。在CO2培養(yǎng)環(huán)境中改用基于Earle's鹽配制的培養(yǎng)液，在大氣培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)改用Hanks鹽配制的培養(yǎng)液。如果是污染造成的則丟棄培養(yǎng)物或用抗生素除菌。培養(yǎng)液pH對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響？答：由于大多數(shù)細(xì)胞適宜pH為7.2-7.4,偏離此范圍可能對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)將產(chǎn)生有害的影響。但各種細(xì)胞對(duì)pH的要求也不完全相同，原代培養(yǎng)細(xì)胞一般對(duì)pH變動(dòng)耐受差，無(wú)限細(xì)胞系耐受力強(qiáng)。但總體來(lái)說(shuō)，細(xì)胞耐酸性比耐堿性強(qiáng)一些。在配制培養(yǎng)用液時(shí)，需要注意一點(diǎn)：培新配的培養(yǎng)基在經(jīng)過(guò)0.10um或0.22um濾膜過(guò)濾時(shí)，溶液的pH還會(huì)向上浮動(dòng)0.2左右。購(gòu)買(mǎi)之細(xì)胞冷凍管經(jīng)解凍后，為何會(huì)發(fā)生細(xì)胞數(shù)目太少之情形？答：研究人員在冷凍細(xì)胞之培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞數(shù)目太少，大都是因?yàn)殡x心過(guò)程操作上的失誤，造成細(xì)胞的物理性損傷，以及細(xì)胞流失。建議細(xì)胞解凍后不要立刻離心，應(yīng)待細(xì)胞生長(zhǎng)隔夜后再更換培養(yǎng)基即可。但對(duì)于DMSO敏感的細(xì)胞，還是復(fù)蘇細(xì)胞時(shí)，用離心去除DMSO比較好。購(gòu)買(mǎi)之細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活率不佳可能原因？答：研究人員在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)存活率不佳，原因比較復(fù)雜，常見(jiàn)原因可歸納為：培養(yǎng)基使用錯(cuò)誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳；血清使用錯(cuò)誤或血清的品質(zhì)不佳；解凍過(guò)程錯(cuò)誤；冷凍細(xì)胞解凍后，加以洗滌細(xì)胞和離心；懸浮細(xì)胞誤認(rèn)為死細(xì)胞；培養(yǎng)溫度使用錯(cuò)誤；細(xì)胞置于-80°C太久等。建議嚴(yán)格參照ATCC或ECACC的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇、凍存等工作。支原體污染會(huì)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)有何影響？答：支原體污染幾乎可影響所有細(xì)胞之生長(zhǎng)參數(shù)、代謝及研究之任一數(shù)據(jù)。故進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前，必須確認(rèn)細(xì)胞為mycoplasma-free,實(shí)驗(yàn)結(jié)果之?dāng)?shù)據(jù)方有意義。冷凍保存細(xì)胞之方法？答：冷凍保存方法一:冷凍管置于4°C(30—60分鐘)—-20°C(30分鐘)—-80°C(16—18小時(shí)或隔夜)-液氮罐長(zhǎng)期儲(chǔ)存。冷凍保存方法二:冷凍管置于已設(shè)定程序之可程序降溫機(jī)中每分鐘降1-3C至-80°C以下，再放入液氮中長(zhǎng)期儲(chǔ)存。注意：-20C不可超過(guò)1小時(shí)，以防止冰晶過(guò)大，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過(guò)此步驟直接放入-80C冰箱中，惟存活率稍微降低一些。懸浮細(xì)胞應(yīng)如何繼代處理？答：一般僅需持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)瓶中，稀釋細(xì)胞濃度即可。若培養(yǎng)液太多時(shí)可分瓶取出一部份含細(xì)胞之培養(yǎng)液至另一新的培養(yǎng)瓶中，加入新鮮培養(yǎng)基稀釋至適當(dāng)濃度，重復(fù)前述步驟即可。欲將一般動(dòng)物細(xì)胞離心下來(lái)，其離心速率應(yīng)為多少轉(zhuǎn)速？答：欲回收動(dòng)物細(xì)胞，其離心速率一般為300xg(約1,000rpm),5-10分鐘，過(guò)高之轉(zhuǎn)速過(guò)長(zhǎng)時(shí)間都將造成細(xì)胞死亡。合適的離心轉(zhuǎn)速是根據(jù)相對(duì)離心決定。RCF=1.119x105xrx(rpm)2r為離心機(jī)轉(zhuǎn)軸中心與離心套管底部?jī)?nèi)壁的距離；rpm為離心機(jī)每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)；RCF(relativeeentrifugalforce)為相對(duì)離心力，以重力加速度g(980.66cm/s2)的倍數(shù)來(lái)表示表示單位。培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)使用5%還是10%CO2,或者根本沒(méi)有影響？答：一般培養(yǎng)基中大都使用HCO3-/CO32-/H+作為pH的緩沖系統(tǒng)，而培養(yǎng)基中NaHCO3的含量將決定細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用的CO2濃度。當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3含量為每公升3.7g時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用10%CO2；當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3為每公升1.5g時(shí)，則應(yīng)使用5%CO2培養(yǎng)細(xì)胞。細(xì)胞冷凍管解凍培養(yǎng)時(shí)，是否應(yīng)馬上去除DMSO？答：除少數(shù)特別注明對(duì)DMSO敏感之細(xì)胞外，絕大部分細(xì)胞株(包括懸浮性細(xì)胞)，在解凍之后，應(yīng)直接放入含有10-15ml新鮮培養(yǎng)基之培養(yǎng)方瓶中，待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO即可，如此可避免大部分解凍后細(xì)胞無(wú)法生長(zhǎng)或貼附之問(wèn)題。冷凍管應(yīng)如何解凍？答：取出冷凍管后，須立即放入37°C水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1—2分鐘內(nèi)大部分融化,特別注意，需殘留一小塊冰塊，就可拿到超凈工作臺(tái)操作細(xì)胞，用75%消毒凍存管，用新鮮培養(yǎng)基將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶。另外冷凍管由液氮桶中取出解凍時(shí)，必須注意安全，預(yù)防冷凍管之爆裂。如何用臺(tái)盼蘭計(jì)數(shù)活細(xì)胞？答：將樣品適當(dāng)稀釋后，用稀釋后的樣品和0.4%的臺(tái)盼蘭溶液按1:1混合后，用移液槍點(diǎn)樣到血球計(jì)數(shù)板，置于倒置顯微鏡下觀察、計(jì)數(shù)，其中藍(lán)色細(xì)胞是死細(xì)胞，因活細(xì)胞排斥臺(tái)盼蘭，不被染色。細(xì)胞欲冷凍保存時(shí)，細(xì)胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細(xì)胞濃度？答：冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為1-8x106cells/mlvial。細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基之成份為何？答：動(dòng)物細(xì)胞冷凍保存時(shí)最常使用的冷凍培養(yǎng)基是含9-10%DMSO（dimethylsulfoxide）和90-95%原來(lái)細(xì)胞生長(zhǎng)用之新鮮培養(yǎng)基均勻混合之。注意：由于DMSO稀釋時(shí)會(huì)放出大量熱能，故不可將DMSO直接加入細(xì)胞液中，必須使用前先行配制完成。如何消除組織培養(yǎng)的污染？答：當(dāng)重要的培養(yǎng)細(xì)胞污染時(shí)，研究者可能試圖消除或控制污染。首先，確定污染物是細(xì)菌、真菌、支原體或酵母，把污染細(xì)胞與其它細(xì)胞系隔離開(kāi)，用實(shí)驗(yàn)室消毒劑消毒培養(yǎng)器皿和超凈臺(tái)，檢查HEPA過(guò)濾器。高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對(duì)一些細(xì)胞系有毒性，因而，做劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)確定抗生素和抗霉菌素產(chǎn)生毒性的劑量水平。這點(diǎn)在使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂(lè)菌素時(shí)尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養(yǎng)污染的實(shí)驗(yàn)步驟。1） 在無(wú)抗生素的培養(yǎng)基中消化、計(jì)數(shù)和稀釋細(xì)胞，稀釋到常規(guī)細(xì)胞傳代的濃度。2） 分散細(xì)胞懸液到多孔培養(yǎng)板中，或幾個(gè)小培養(yǎng)瓶