常見豬病檢測方法

常有豬病檢測方法常有豬病檢測方法28/28常有豬病檢測方法豬病診斷技術(shù)規(guī)范一、致病性大腸桿菌的檢測引用標(biāo)準(zhǔn)參照NY/T555-2002（動物產(chǎn)品大腸桿菌、糞大腸菌群和大腸桿菌的檢測方法）。范圍適用于豬大腸桿菌病的診斷。檢測方法3.1資料營養(yǎng)肉湯營養(yǎng)瓊脂生化判斷管小白鼠3.2分別培養(yǎng)將收集的肝、脾、心血或腸內(nèi)容物均分別接種伊紅美蘭瓊脂平板（同時接種營養(yǎng)肉湯增菌備用），置37℃培養(yǎng)18~24h。觀察培養(yǎng)特點，挑取黑色有金屬光彩的菌落，用該菌落涂片，革蘭氏染色，鏡檢。如可見到兩端鈍圓并多以單個存在的革蘭氏陰性粗短桿菌，應(yīng)取5~10個典型菌落再接種于TSI瓊脂。同時挑取典型菌落接種營養(yǎng)瓊脂，37℃培養(yǎng)16~18h的菌液用于生化特點判斷。3.3生化判斷挑取上述菌落純培養(yǎng)物接種以下生化培養(yǎng)基和乳糖發(fā)酵管，(36±1)℃培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。靛基質(zhì)試驗：滴加Kovacs氏靛基質(zhì)試劑0.1mL于靛基質(zhì)試驗培養(yǎng)基中混雜，觀察結(jié)果。出現(xiàn)紅色環(huán)的為反應(yīng)陽性；出現(xiàn)黃色環(huán)的為反應(yīng)陰性。甲基紅（MR）試驗滴加甲基紅指示劑0.2mL于MR-VP培養(yǎng)基中混雜，觀察結(jié)果。出現(xiàn)紅色為陽性反應(yīng)；出現(xiàn)黃色為陰性反應(yīng)。VP試驗滴加VP試劑甲液0.2mL于MR-VP培養(yǎng)基中混勻，再滴加VP試劑乙液0.1mL混勻，靜置，觀察結(jié)果。b)在15min內(nèi)出現(xiàn)紅色的為陽性反應(yīng)；無顏色變化的為陰性反應(yīng)。陰性結(jié)果1h后再觀察一次，出現(xiàn)紅色也為陽性反應(yīng)。枸櫞酸鹽試驗：觀察培養(yǎng)基顏色變化，出現(xiàn)藍(lán)色為陽性反應(yīng)；不變色為陰性反應(yīng)。3.4大腸桿菌判斷結(jié)果應(yīng)吻合表1要求。表1大腸桿菌判斷結(jié)果靛基質(zhì)MRVP枸櫞酸鹽判斷++--典型大腸埃希氏桿菌-+--非典型大腸埃希氏桿菌++-+典型檸檬酸鹽桿菌-+-+非典型檸檬酸鹽桿菌+典型產(chǎn)氣桿菌+--+非典型產(chǎn)氣桿菌出現(xiàn)表1的生化反應(yīng)種類時，若是為組織樣品，由此可初步報告為致病性大腸桿菌。若是為糞便，尿液，飼料，飲水，應(yīng)進(jìn)一步做致病性試驗。3.4致病性試驗取經(jīng)營養(yǎng)肉湯37℃培養(yǎng)16~18h后的純化菌株培養(yǎng)液，分別腹腔接種體重20g左右的小白鼠，每株接種2~3只，每只0.3mL（含菌量約為1×1012cfu／mL），同時用相同數(shù)量的小白鼠接種無菌肉湯作比較。飼養(yǎng)觀察、記錄死亡數(shù)，并從死亡鼠的心、肝中回收接種菌。在24小時內(nèi)出現(xiàn)死亡的可報告為致病性大腸桿菌。藥敏試驗優(yōu)選瓊脂平板上典型菌落接種營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)中，37℃培養(yǎng)16~18h，菌液用于藥敏試驗。將肉湯培養(yǎng)物（用標(biāo)準(zhǔn)比濁管比較達(dá)相同濁度）稀釋至含菌量為1×109cfu／mL，搖勻后蘸取菌懸液均勻涂布于瓊脂平板上，爾后用無菌鑷子將藥敏片貼附其上，每紙片2~5張，置37℃培養(yǎng)24ｈ后觀察。依照抑菌圈大小來判斷其對藥物的耐受性，選擇敏感藥物。二、沙門氏菌的檢測引用標(biāo)準(zhǔn)參照NY/T550-2002（動物和動物產(chǎn)品沙門氏菌檢測方法）。范圍適用于豬沙門氏菌病的診斷。檢測方法3.1資料賴氨酸脫羧酶（LD）鄰-硝基酚-β-D-半乳糖苷（DNPG）甘露醇糖發(fā)酵管3.2分別培養(yǎng)收集疑似病例的肝、脾、心血或腸內(nèi)容物樣品。無菌剪取肝、脾樣品1g，投入10mLSC增菌液中（血液、糞便樣品可以采合適直接投入10mL增菌液），36±1℃培養(yǎng)18~24h。取一接種環(huán)增菌液劃線接種于DHL瓊脂平板上，36±1℃培養(yǎng)18~24h。觀察平板上菌落生長形態(tài)。沙門氏菌在DHL平板上呈無色半透明，產(chǎn)硫化氫（H2S），菌落中心黑色或幾乎全黑色。3.3生化判斷挑取DHL平板上可疑菌落3~5個，每個菌落先洗入TSI培養(yǎng)基冷凝水中，既而在斜面上劃線接種并高層穿刺接種。再挑取同一菌落依次接種氨基酸脫羧酶發(fā)酵試驗（LD）和ONPG，甘露醇糖發(fā)酵管三支生化管，若菌落偏小，二次挑取菌落有困難，可用接種環(huán)醮取TSI培養(yǎng)基中冷凝水接種其余生化管，36±1℃培養(yǎng)18~24h（挑取菌落后的平板，應(yīng)置于4℃冰箱保留48h以備復(fù)查）。按表1記錄反應(yīng)結(jié)果，比較表2進(jìn)行判斷。凡吻合表2生化反應(yīng)模式，可報告為沙門氏菌。表1生化反應(yīng)結(jié)果判斷生化管TSILDONPGMAN底a斜面b硫化氫第一次顏色黃黃黑紫深黃黃記錄吻合++++++第二次顏色紅紅無黑色黃無色或淡紫黃記錄符號a“底”觀察葡萄糖反應(yīng)。b“斜面”觀察乳糖和蔗糖反應(yīng)。表2生化檢測沙門氏菌屬判斷表序TSIONP斜LDMAN判斷號底硫化氫G面A+-++-+沙門氏菌亞種Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ沙門氏菌亞種Ⅲb、15％ⅢaBa++++++沙門氏菌亞種Ⅲa、Ⅴ、15％Ⅲb、C+-++++15％ⅡDb+-+--+Ec+--+-+少許沙門氏菌亞種Ⅰ少許沙門氏菌亞種ⅠFd++甲型副傷寒沙門氏菌G-+--+-++-非沙門氏菌a含1％硫化氫陽性的大腸埃希氏菌，可加試靛基質(zhì)加以鑒別，其中大腸桿菌陽性，沙門氏菌陰性。賴氨酸陰性的沙門氏菌主要有：甲型副傷寒、傷寒、豬霍亂沙門氏菌孔成道夫變種、雞等。硫化氫陰性的沙門氏菌主要有：甲型副傷寒、傷寒、豬霍亂、豬傷寒、仙臺、貝塔、巴布亞、雞、馬流產(chǎn)、山夫登堡、都柏林登。?？芍苯佑茫∣）單因子血清證明，以消除雷極氏普羅菲登斯菌登。藥敏試驗優(yōu)選DHL平板上典型菌落接種營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)中，36±1℃培養(yǎng)16~18h，菌液用于藥敏試驗。將肉湯培養(yǎng)物（用標(biāo)準(zhǔn)比濁管比較達(dá)相同濁度）稀釋至含菌量為1×109cfu／mL，搖勻后蘸取菌懸液均勻涂布于瓊脂平板上，爾后用無菌鑷子將藥敏片貼附其上，每紙片2~5張，置36±1℃培養(yǎng)24ｈ后觀察。依照抑菌圈大小來判斷其對藥物的耐受性，選擇敏感藥物。三、產(chǎn)氣莢膜梭菌的檢測引用標(biāo)準(zhǔn)自定標(biāo)準(zhǔn)。范圍適用于豬產(chǎn)氣莢膜梭菌病的診斷。資料3.1綿羊血瓊脂3.2牛乳培養(yǎng)基。組織染色鏡檢對疑似病例的腸道黏膜涂片，魏氏梭菌呈G+，直桿狀，兩端鈍圓，單在或成雙，無鞭毛，不運動。芽孢大而卵圓，位于菌體中央或近端，多數(shù)菌株可形成莢膜。分別培養(yǎng)可將腸道內(nèi)容物接種血平板，37℃厭氧培養(yǎng)18～24h后觀察。菌落特點：魏氏梭菌在血平板上可形成直徑2～5mm、圓形、邊緣整齊、灰色至灰黃色、表面圓滑半透明、圓屋頂狀菌落，有雙層溶血環(huán)?？山?jīng)過鏡檢對形態(tài)進(jìn)一步確定。生化判斷對牛乳培養(yǎng)基的“暴烈發(fā)酵”。腸內(nèi)毒素檢查收集空腸后段或結(jié)腸前段內(nèi)容物，加合適生理鹽水稀釋，經(jīng)離心積淀后取上清液分成兩份，一份加熱（60℃30min）。兩份上清液分別靜脈注射家兔（1～3ml）或小鼠（0.1～0.3ml）。如有毒素存在，不加熱組動物常于數(shù)分鐘至數(shù)小時內(nèi)死亡，而加熱組動物不死亡。報告因為正常人畜腸道內(nèi)存在此菌，并且發(fā)病菌主要靠在腸道內(nèi)產(chǎn)生毒素致病，細(xì)菌自己其實不侵入機(jī)體。因此只有細(xì)菌分別和腸毒素檢查都吻合，并結(jié)合臨床癥狀才能報告產(chǎn)氣莢膜梭菌感染。鑒別A型和C型要靠中和保護(hù)試驗。四、豬痢疾診斷引用標(biāo)準(zhǔn)參照NY/T545-2002。范圍適用于豬痢疾（SD）的實驗室診斷。3糞便中Sh顯微鏡檢查3.1資料器材：顯微鏡，暗視野鏡頭，玻片及蓋玻片，酒精燈等染色液：結(jié)晶紫染色液或稀釋的石炭酸復(fù)紅。樣品：病豬新鮮糞便（含粘）或直腸拭子或大腸內(nèi)容物及黏膜3.2操作方法，水洗，吸干后待檢。懸滴樣品制作：取樣品少許懸于生理鹽水，待檢。每份樣品最少制片2張顯微鏡檢查：染色樣品以油鏡直接觀察，懸滴樣品在暗視野400~1000倍鏡頭下觀察。3.3結(jié)果判斷典型Sh菌體長6μm~8.5μm，呈2~5個密螺旋體，兩端尖銳，呈蛇樣爽朗運動。當(dāng)視野中有數(shù)量（3~5條以上）Sh樣菌體時，在獲培養(yǎng)前，可作為診斷的重要參照。分別培養(yǎng)和判斷4.1資料準(zhǔn)備器材：厭氧培養(yǎng)裝置及使用方法，細(xì)菌學(xué)實驗老例器材，外科手術(shù)器材，微孔濾器0.65μm濾膜。試驗動物：小鼠（20g左右）試劑：PBS(0.01M，pH7.2)，生理鹽水，多粘菌素，TSA。樣品：病豬新鮮糞便或大腸粘膜刮取物（含粘液）。對死豬或撲殺豬大腸分段結(jié)扎（每段10cm），分別取出。樣品應(yīng)盡早分別培養(yǎng)，也可0～4℃保留4～7d。4.2操作方法樣品種Sh鏡檢將樣品少許摸片染色或作成懸滴標(biāo)本，鏡檢，觀察Sh有無活力。含菌量少且無活力者，則難以分別成功。分別培養(yǎng)直接劃線分別法：即取樣品直接在TSA上劃線接種若干皿。集菌法：先將樣品以生理鹽水或PBS作1：5稀釋，2000r/min，棄去積淀。將上清液再以6000～8000r/min離心20min。取積淀劃線接種TSA若干皿。4.2.2.3稀釋法：將樣品或集菌法的積淀物作10倍梯度稀釋至10-6～10-8。取各梯度稀釋液各1滴，分別劃線接種于TSA上，（每梯度稀釋液最少接種3皿）。接種后的培養(yǎng)皿置厭氧罐內(nèi)進(jìn)行厭氧培養(yǎng)。若上述稀釋液中加入多粘菌素200U/mL～300U/mL，可提高分別率。4.3結(jié)果判斷觀察每隔2～4d開罐檢查一次，共2～4次，觀察有無溶血區(qū)及溶血菌落。致病性Sh呈強(qiáng)β溶血，一般看不見菌落。當(dāng)培養(yǎng)條件合適時，再溶血區(qū)可見到云霧狀菌苔。無害蛇樣螺旋體等呈弱β溶血。移植純化先作溶血區(qū)內(nèi)物質(zhì)涂片，染色鏡檢。如見Sh樣菌體，可在無菌落溶血區(qū)內(nèi)移取小塊瓊脂劃線于TSA若干皿。這樣每隔2天移植一次，一般2~4次后即可純化和保留。豬蛇樣螺旋體判斷溶血試驗將豬蛇樣螺旋體、無害蛇樣螺旋體或毛腸蛇樣螺旋體及被檢菌株，分別劃線于同一TSA上不相同區(qū)內(nèi)，經(jīng)48h培養(yǎng)后，觀察比較其溶血程度。腸致病性試驗每菌株最少接種6只小鼠，將小鼠停飼24h后，每只每次灌服1mL（含菌3～5億），次日再灌服一次，15d后剖檢觀察盲腸病變。感染后50％出現(xiàn)腹瀉和病變者，則為致病Sh。五、豬巴氏桿菌病診斷技術(shù)引用標(biāo)準(zhǔn)參照NY/T564-2002。范圍適用于豬巴氏桿菌病的檢測。資料3.1改良馬丁氏瓊脂3.2馬丁氏肉湯3.3常用生化培養(yǎng)基。組織染色鏡檢用肝臟組織或心血摸片或純培養(yǎng)物染色呈陰性，瑞氏染色呈兩極濃染的球桿菌。病原分別判斷將瀕死前或死后數(shù)小時內(nèi)以無菌手術(shù)采用病死豬的心血、肝臟組織，接種于改良馬丁氏瓊脂斜面，進(jìn)行分別。培養(yǎng)18～24h后，改良馬丁瓊脂斜面生長純粹的培養(yǎng)物，呈微藍(lán)色菌臺或菌落。馬丁肉湯培養(yǎng)物生長為均勻渾濁，不產(chǎn)生菌膜。生化判斷本菌發(fā)酵葡萄糖、果糖、半乳糖，多數(shù)發(fā)酵蔗糖，不發(fā)酵乳糖、肌醇、菊糖、水楊素及鼠李糖，吲哚試驗和氧化酶試驗陽性。診斷判斷依照臨床癥狀和病理變化，加上涂片染色鏡檢，可對本病作出初步的診斷，但確診要靠病原分別判斷。六、豬鏈球菌病診斷技術(shù)引用標(biāo)準(zhǔn)參照GB/T19915.2-2005和GB/T19915.9-2005范圍適用于豬鏈球菌病診斷。資料3.1綿羊血瓊脂組織染色鏡檢對最急性和急性病例，無菌采用集病死豬的心、肝、脾、肺、腎和淋奉迎等組織做觸片，姬姆薩染色，鏈球菌可見較純的單個或成雙的圓形或橢圓形球菌,有少許形成短鏈和長鏈，如見鏈球菌則表示病料中可能含有鏈球菌。病原分別判斷無菌取心、肝、脾、肺、腎或淋奉迎內(nèi)部組織劃線接種一般瓊脂綿羊血平板，36±1℃培養(yǎng)24±2h，若是菌落生長緩慢，可延伸至48±2h后觀察。若是是豬鏈球菌2型，培養(yǎng)24h，在一般瓊脂綿羊血平板形成圓形、微凸、表面光滑、濕潤、邊緣整齊、半透明的菌落，直徑0.3mm～1mm，大多數(shù)菌株呈α溶血，部分菌株產(chǎn)生β溶血。將可疑菌落做革蘭氏染色和過氧化氫酶試驗。本菌為革蘭氏陽性球菌，菌體直徑μl固體培養(yǎng)物以雙球菌為多，少許呈3個～5個排列的短鏈，液體培養(yǎng)物以鏈狀為主，無芽孢，能形成莢膜。本菌過氧化氫酶試驗均為陰性。菌落生長特點、革蘭氏染色、菌體形態(tài)和過氧化氫試驗吻合者，可初步確定為鏈球菌。生化判斷經(jīng)初步判斷后，做5％乳糖、海藻糖、七葉苷、甘露醇、山梨醇、馬尿酸鈉等糖發(fā)酵試驗。7PCR判斷可否為豬鏈球菌2型必要時進(jìn)行豬鏈球菌2型毒力因子PCR檢測。7.1儀器：臺式高速（12000r/min）離心計；DNA擴(kuò)增儀；水浴鍋；穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀和水平電泳槽；電泳凝膠成相解析系統(tǒng)；可調(diào)移液器一套，包括1～20μL2支，20～200L1支，200～1000μL1支；與移液器般配的滴頭；1.5mL離心管；0.5mL或0.2mL（與擴(kuò)增儀配套）塑料管。7.2試劑細(xì)菌DNA提取試劑盒×PCRBuffer2引物聚合酶×TAE（保留液）和1×TAE（使用液）瓊脂糖：電泳級7.3PCR引物依照豬鏈球菌2型溶血素基因設(shè)計引物，引物序列以下，其目的片斷長度為495bp。sly1：5’-CCCAAGTTCAAGCCGCATTTA-3’(1542)sly2：5’-GAAGATTGCGAGCATTTCCTG-3’(2036)7.4DNA提取利用對數(shù)生長遠(yuǎn)的液體培養(yǎng)物，嚴(yán)格依照DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行。7.5PCR擴(kuò)增反應(yīng)系統(tǒng)25μL：細(xì)菌總DNA5.0μL10pmol/μL的上游引物1.0μL10pmol/μL的下游引物1.0μL2.5mmol/LdNTPs混雜物2.0μL10×PCRBuffer2.5μL25mmol/L的MgCl22.0μL5U的TaqDNA聚合酶0.3μL雙蒸水補(bǔ)至25μL。循環(huán)參數(shù)：℃預(yù)變性5min；℃變性1min；℃退火1min；共35個循環(huán)，℃延伸1min；℃延伸10min，4℃保留。7.6電泳檢測1.5g瓊脂糖，于100mL電泳緩沖液中加熱，充分溶化，制膠。在電泳槽中加入電泳緩沖液，使液面方才沒過凝膠。取8～10μlPCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別和合適加樣緩沖液和CYBgreen混雜后加樣，進(jìn)行電泳。電壓大小依照電泳槽長度來確定，一般控制在3V/cm～5V/cm，電泳時間為30min～35min。將電泳好的凝膠放紫外透射儀或凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果。陽性比較的PCR產(chǎn)物電泳后在495bp的地址上出現(xiàn)一條特異性條帶，陰性比較PCR產(chǎn)物電泳后沒有條帶，試驗結(jié)果成立。在試驗結(jié)果成立的前提下，若是樣品中PCR產(chǎn)物電泳后在495bp的地址上出現(xiàn)一條特異性條帶，判為該菌株含有豬鏈球菌2型溶血素基因。七、副豬嗜血桿菌（Hps）PCR診斷技術(shù)引用標(biāo)準(zhǔn)自定標(biāo)準(zhǔn)。范圍副豬嗜血桿菌診斷。資料3.1儀器：臺式高速（12000r/min）離心計；DNA擴(kuò)增儀；水浴鍋；穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀和水平電泳槽；電泳凝膠成相解析系統(tǒng)；可調(diào)移液器一套，包括1～20μL2支，20～200L1支，200～1000μL1支；與移液器般配的滴頭；1.5mL離心管；0.5mL或0.2mL（與擴(kuò)增儀配套）塑料管。3.2試劑培養(yǎng)基培養(yǎng)基溶液中溶菌buffer(0.0005%Tween20，0.24mg/mLproteinaseK和0.1mol/LTris，pH8.5)×PCRBuffer2引物×TAE（保留液）和1×TAE（使用液）LoadingBuffer瓊脂糖CYBgreen操作方法4.1鏡檢對從臨床癥狀疑似副豬嗜血桿菌病的發(fā)病仔豬的肺和脾作組織觸片，革蘭氏染色，副豬嗜血桿菌鏡檢呈革蘭氏陰性小球桿菌。4.2分別培養(yǎng)取出患病仔豬病變肺、氣管分泌物、胸水、腹水及脾組織，劃線接種于TSA平板。37℃，5%CO2培養(yǎng)24～48ｈ。副豬嗜血桿菌呈無色、透明、濕潤、圓滑的露珠樣微小菌落，革蘭氏染色呈陰性小球桿菌，老齡培養(yǎng)物呈多形態(tài)(微小桿狀、短鏈狀和長絲狀)。4.3PCR引物設(shè)計HP16S1：5′-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3′HP16S2：5′-GGCTTCGTCACCCTCTGT-3′該引物擴(kuò)增出編碼16SrRNA的DNA部分片段，長度為822bp。tbpA55：5′-TTAGCCTTGCTCTTCTTAGCC-3′tbpA33：5′-AAGCTTGAAACTAAGGTACTCTAA-3′該引物擴(kuò)增出編碼轉(zhuǎn)鐵結(jié)合蛋白A的DNA部分片段，長度為1.9kb。4.4細(xì)菌DNA提取將TSA平板上典型菌落接種TSB，37℃過夜培養(yǎng)，取對數(shù)生長遠(yuǎn)分別菌懸浮于10mmol/LTris/1mmol/LEDTA溶液中，10000r/min離心5min；棄上清，積淀用溶菌buffer重懸；56℃作用30min；最后煮沸15min；12000r/min離心5min；收集上清，-20℃保留備用。注：DNA的提取可以用試劑盒，按試劑盒操作說明進(jìn)行，以節(jié)約時間，減少DNA損失。4.5編碼16SrRNA的DNA部分片段的擴(kuò)增反應(yīng)系統(tǒng)25μL：細(xì)菌總DNA2.0μL10pmol/μL的上游引物1.0μL10pmol/μL的下游引物1.0μL2.5mmol/LdNTPs混雜物2.0μLMg2+緩沖液2.5μL25mmol/L的MgCl21.5μL5U的TaqDNA聚合酶0.3μL雙蒸水補(bǔ)至25μL。循環(huán)參數(shù)：℃預(yù)變性5min；94℃變性30s；59℃退火30s；共30個循環(huán)，72℃延伸90s；72℃延伸10min。4.6編碼tbpA的DNA部分片段的擴(kuò)增反應(yīng)系統(tǒng)同4.5，循環(huán)參數(shù)為：94℃預(yù)變性5min;℃變性1min；℃退火1min；共30個循環(huán)72℃延伸2min；最后72℃延伸10min。4.7結(jié)果解析與判斷％瓊脂糖凝膠板的制備稱取1g瓊脂糖，加入100mL1×TAE中，加熱融化后，倒入放置在水平臺面上的凝膠盤中，膠板厚5mm左右。依仍舊品數(shù)采用合適的梳子。待凝膠冷卻凝固后拔出梳子（膠中形成加樣空），放入電泳槽中，加1×TAE緩沖液淹沒膠面。加樣6～8μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物和2～3μL加樣緩沖液和合適CYBgreen混勻后加入一個加樣孔。每次電泳最少加1孔陽性比較的擴(kuò)增產(chǎn)物作為比較，沒有陽性比較的情況下，必然加Marker。電泳電壓80～100V，或電流40～50mA，電泳30～40min。結(jié)果觀察與判斷電泳結(jié)束后，取出凝膠板置于紫外透射儀上，打開紫外燈觀察。如某一待檢樣品擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA帶與陽性比較的帶在一條直線上，即他們與加樣孔的距離相同，或依照Marker判斷大小與設(shè)計的大?。?20bp和1.9kb）一致，則該樣品判斷為陽性。診斷判斷同份樣品在2個PCR中全部陽性的才可以判為本豬（群）已經(jīng)感染Hps，依照流行病學(xué)、臨床癥狀和病理變化判斷豬群可否發(fā)病。八、豬生殖與呼吸綜合征（PRRS）PCR檢測技術(shù)引用標(biāo)準(zhǔn)自定標(biāo)準(zhǔn)。范圍適用于PRRS的PCR診斷。資料3.1儀器：組織勻漿機(jī)；低溫臺式高速（12000r/min）離心計；DNA擴(kuò)增儀；水浴鍋；穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀和水平電泳槽；電泳凝膠成相解析系統(tǒng)；可調(diào)移液器一套，包括1～20μL2支，20～200μL1支，200～1000μL1支；與移液器般配的滴頭；1.5mL離心管；0.5mL或0.2mL（與擴(kuò)增儀配套）塑料管。3.2試劑試劑氯仿異丙醇反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV（200U/μL）乙醇焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶液×PCRBuffer210pmol/L引物50×TAE（保留液）和1×TAE（使用液）LoadingBuffer瓊脂糖Oligo(dT)18（50μmol/L）CYBgreen操作步驟4.1樣品收集取疑似豬的肺臟、淋奉迎和脾臟病變部位組織，-20℃保留備用。4.2樣品辦理取部分組織樣品，磨碎并用0.01MPBS（PH7.2~7.4）稀釋成1:5乳劑（或?qū)⒉×嫌眉舻都舫尚K，放入5mL青霉素小瓶，進(jìn)一步剪碎，按5倍體積的0.01MPBS后，用勻漿機(jī)勻漿），-20℃保留備用或馬上用于RNA提取。4.3RNA的提取取辦理好的稀釋樣品200~300μL，加入700μLTRIZOL試劑，渦懸混勻，在15~30℃溫育2~3min；加入200μL的氯仿，蓋緊管蓋，上下顛倒混勻15s，15~30℃溫育2~3min，2~8℃12000g離心15min；轉(zhuǎn)移水相500μL到一新的離心管中，加入0.5mL的異丙醇，15~30℃作用10min，2~8℃12000g離心10min；棄去上清液，加入75%乙醇1.0mL，振搖，2~8℃7500g離心5min；棄去上清，干燥積淀物（室溫約5min）；加入20μLDEPC水溶解，-20℃保留或馬上使用（置冰上）。4.4引物設(shè)計依照文件和PRRSV代表株VR2332和LV設(shè)計了一對引物：PRRSVN1：5′-ATGGCCAGCCAGTCAATCA-3′PRRSVN2：5′-TCGCCCTAATTGAATAGGTG-3′4.5RT整體積為10μL，反應(yīng)系統(tǒng)以下：5×RTbuffer2.0μLdNTP（10mmol/L）0.25μLOligo(dT)180.5μLRNA模板7μL混勻離心，65℃作用10min，冰上冷卻，加入M-MLV（200U/μL）0.25μL，42℃1h，冰上冷卻后作為PCR模板。4.6PCRPCR反應(yīng)整體積為25μL，包括：2條PRRSV引物（10pmol/μL）各1μL++(Mg25mmol/L)1.5μLdNTP(2.5mmol/L)2.0μL10×Buffer2.5μLTaq酶（5U/μL）0.2μL模板cDNA5μL滅菌雙蒸水11.8μL瞬時離心混勻，將PCR反應(yīng)管置于PCR儀內(nèi)。PCR反應(yīng)參數(shù)為：95℃預(yù)變性5min；94℃45min；51℃45min；共35個循環(huán)，72℃1min；72℃延伸10min。將PCR產(chǎn)物放4℃保留或馬上做瓊脂糖凝膠電泳，解析PCR產(chǎn)物。4.7結(jié)果解析與判斷％瓊脂糖凝膠板的制備稱取1.5g瓊脂糖，加入100mL1×TAE中，加熱融化后，倒入放置在水平臺面上的凝膠盤中，膠板厚5mm左右。依仍舊品數(shù)采用合適的梳子。待凝膠冷卻凝固后拔出梳子（膠中形成加樣空），放入電泳槽中，加1×TAE緩沖液淹沒膠面。加樣6～8μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物和2～3μL加樣緩沖液和和合適CYBgreen混勻后加入一個加樣孔。每次電泳最少加1孔陽性比較的擴(kuò)增產(chǎn)物作為比較，沒有陽性比較的情況下，必然加Marker。電泳電壓80～100V，或電流40～50mA，電泳30～40min。結(jié)果觀察與判斷電泳結(jié)束后，取出凝膠板置于紫外透射儀上，打開紫外燈觀察。如某一待檢樣品擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA帶與陽性比較的帶在一條直線上，即他們與加樣孔的距離相同，或依照Marker判斷大小與設(shè)計的大?。?00bp或430kb）一致，則該樣品判斷為陽性。診斷判斷PCR檢測結(jié)果陽性，表示該豬（群）已感染PRRSV，依照流行病學(xué)、臨床癥狀和病理變化判斷豬群可否發(fā)病。九、古典豬瘟（CSFV）PCR檢測技術(shù)引用標(biāo)準(zhǔn)自定標(biāo)準(zhǔn)。范圍適用于古典豬瘟（CSFV）的PCR診斷。資料3.1儀器：組織勻漿機(jī)；低溫臺式高速（13000～20000r/min）離心計；DNA擴(kuò)增儀；水浴鍋；穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀和水平電泳槽；電泳凝膠成相解析系統(tǒng)；可調(diào)移液器一套，包括1～20μL2支，20～200μL1支，200～1000μL1支；與移液器般配的滴頭；1.5mL離心管；0.5mL或0.2mL（與擴(kuò)增儀配套）塑料管。3.2試劑試劑氯仿異丙醇反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV（200U/μL）乙醇焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶液×PCRBuffer210μmol/L引物50×TAE（保留液）和1×TAE（使用液）LoadingBuffer瓊脂糖BSA(0.4mg/mL)CYBgreen操作方法4.1病料收集：可用于檢測的病料包括扁桃體、淋奉迎、脾臟和母豬流產(chǎn)胎兒及死胎(扁桃體、淋奉迎和脾臟)，-20℃保留備用。4.2病料辦理：取部分資料0.5～2.0g于無菌研缽，磨碎并用PBS（0.01M,PH7.2~7.4）稀釋成1:5乳劑（或?qū)⒉×嫌眉舻都舫尚K，放入5mL青霉素小瓶，進(jìn)一步剪碎，按5倍體積的PBS后，用勻漿機(jī)勻漿），-20℃保留備用或馬上用于RNA提取。4.3RNA提取取辦理好的稀釋樣品200～300μL，加入700μLTRIZOL試劑，渦懸混勻，在15~30℃溫育2~3min；加入200μL的氯仿，蓋緊管蓋，上下顛倒混勻15s，15~30℃溫育2~3min，2~8℃12000g離心15min；轉(zhuǎn)移水相500μL到一新的離心管中，加入0.5mL的異丙醇，15~30℃作用10min，2~8℃12000g離心10min；棄去上清液，加入75%乙醇1.0mL，振搖，2~8℃7500g離心5min；棄去上清，干燥積淀物（室溫約5min）；加入20μLDEPC水溶解，-20℃保留或馬上使用（置冰上）。4.4引物設(shè)計依照華中農(nóng)業(yè)大學(xué)2004年在Genbank中公開公布的序列DQ127910設(shè)計的引物，產(chǎn)物大小為374bp，引物序列以下：gE1:5'-CCACCCGACGCTACGATTGT-3'gE2:5'-CTGGCATCCATCATTCCCTG-3'4.5RT以提取到的組織總RNA為模板，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)為20μL。反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)以下：RNA7μL10μmol/L引物(gE1/gE2)1μL于70℃水浴中5分鐘，爾后室溫冷卻10分鐘；再加入：dNTP(10mM)1μL5×M-MLVbuffer4μLBSA(0.4mg/mL)5μLM-MLV反轉(zhuǎn)錄酶1μL混均后，37℃水浴45-60分鐘。-20℃保留。4.6PCR擴(kuò)增反應(yīng)cDNA5.0μL10×PCRbuffer2.5μLdNTP(2.5mM)2.0μLMgCl2（25mM）1.5μL上游引物（10μmol/L）1.0μL下游引物（10μmol/L）1.0μLTaqDNA聚合酶（5U）0.2μL滅菌雙蒸水1.8μL配好反應(yīng)液后，將PCR反應(yīng)管置于PCR儀內(nèi)，循環(huán)參數(shù)以下：95℃5min94℃45min;56℃45min;共35個循環(huán)72℃1min；℃10minPCR產(chǎn)物放4℃保留或馬上做瓊脂糖凝膠電泳，解析PCR產(chǎn)物。4.7結(jié)果解析與判斷％瓊脂糖凝膠板的制備稱取1.5g瓊脂糖，加入100mL1×TAE中，加熱融化后，倒入放置在水平臺面上的凝膠盤中，膠板厚5mm左右。依仍舊品數(shù)采用合適的梳子。待凝膠冷卻凝固后拔出梳子（膠中形成加樣空），放入電泳槽中，加1×TAE緩沖液淹沒膠面。加樣6～8μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物和2～3μL加樣緩沖液和合適CYBgreen混勻后加入一個加樣孔。每次電泳最少加1孔陽性比較的擴(kuò)增產(chǎn)物作為比較，沒有陽性比較的情況下，必然加Marker。電泳電壓80～100V，或電流40～50mA，電泳30～40min。結(jié)果觀察與判斷電泳結(jié)束后，取出凝膠板置于紫外透射儀上，打開紫外燈觀察。如某一待檢樣品擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA帶與陽性比較的帶在一條直線上，即他們與加樣孔的距離相同，或依照Marker判斷大小與設(shè)計的大小（370bp）一致，則該樣品判斷為陽性。診斷判斷若是是在免疫后20d收集的樣品，PCR檢測結(jié)果陽性，表示該豬（群）已感染野毒，依照流行病學(xué)、臨床癥狀和病理變化判斷豬群可否發(fā)病。十、豬微小病毒(PPV)PCR診斷技術(shù)引用標(biāo)準(zhǔn)自定標(biāo)準(zhǔn)。范圍適用于豬微小病毒（PPV）病的PCR診斷。資料3.1儀器：臺式高速離心計；DNA擴(kuò)增儀；水浴鍋；穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀和水平電泳槽；電泳凝膠成相解析系統(tǒng)；可調(diào)移液器一套，包括1～20μL2支，20～200μL1支，200～1000μL1支；與移液器般配的滴頭；1.5mL離心管；0.5mL或0.2mL（與擴(kuò)增儀配套）塑料管。3.2主要試劑緩沖液％SDS蛋白酶K飽和酚酚：氯仿：異戍醇（25:24:1）氯仿：異戍醇（24：1）純乙醇×PCRBuffer25mmol/LMgCl210μmol/L引物50×TAE（保留液）和1×TAE（使用液）LoadingBuffer瓊脂糖CYBgreen操作步驟：4.1樣品的收集：收集病豬的淋奉迎、脾臟、肝臟置-20℃保留。4.2樣品辦理和DNA提取所采病料經(jīng)組織研磨器充分研磨，按1:5用TEN緩沖液懸浮收集于離心管內(nèi)，-70℃屢次凍融3次，7000r/min離心5min。取上清液472.5μl,加入25μl10％SDS和2.5μl的20mg/mL蛋白酶K，50℃水浴搖床上放置2h。加入等量的飽和酚500μl，渦旋20s。離心取上清液，加等量的酚：氯仿：異戍醇（25:24:1）抽提一次。用氯仿：異戍醇（24:1）再抽提一次。用乙醇積淀，真空抽干后加入20μl雙蒸水溶解，-20℃儲藏備用。4.3引物依照GenBank中公開公布的序列，設(shè)計擴(kuò)增豬微小病毒VP2基因部分片段，序列以下：P1:5′-CAGAATCAGCAACCTCAC--3′P2:5′-TGGTCTCCTTCTGTGGTAGG--3′4.4PCR反應(yīng)系統(tǒng)25μl，組成以下：引物各1.0μl25mMMgCl21.μ5ldNTPs2.0μl10×緩沖液2.5μlTaq聚合酶0.2μlDNA模板3.0μl滅菌去離子水13.8μl擴(kuò)増條件為：94℃變性3min，進(jìn)入循環(huán)，94℃45s，54℃45s，72℃60s，30個循環(huán)后，72℃延伸10min。4.5結(jié)果解析與判斷％瓊脂糖凝膠板的制備稱取1.5g瓊脂糖，加入100mL1×TAE中，加熱融化后，倒入放置在水平臺面上的凝膠盤中，膠板厚5mm左右。依仍舊品數(shù)采用合適的梳子。待凝膠冷卻凝固后拔出梳子（膠中形成加樣空），放入電泳槽中，加1×TAE緩沖液淹沒膠面。加樣6～8μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物和2～3μL加樣緩沖液和和合適CYBgreen混勻后加入一個加樣孔。每次電泳最少加1孔陽性比較的擴(kuò)增產(chǎn)物作為比較，沒有陽性比較的情況下，必然加Marker。電泳電壓80～100V，或電流40～50mA，電泳30～40min。結(jié)果觀察與判斷電泳結(jié)束后，取出凝膠板置于紫外透射儀上，打開紫外燈觀察。如某一待檢樣品擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA帶與陽性比較的帶在一條直線上，即他們與加樣孔的距離相同，或依照Marker判斷大小與設(shè)計的大小（440bp）一致，則該樣品判斷為陽性。十一、口蹄疫(FMDV)PCR診斷技術(shù)引用標(biāo)準(zhǔn)參照GB/T18935-2003和OIEFMDV參照實驗室的方法NB:VERSIONADOPTEDMAY2006）。范圍適用于FMDVO型和AsiaI型的PCR診斷。樣品收集3.1水泡液和水泡皮：用一次性注射器抽取水泡液，用灼燒的止血鉗封死注射器前端，放入保鮮盒，加冰儲藏送檢；將水泡皮剪下，放入干凈青霉素瓶中，放入保鮮盒加凍儲藏送檢。3.2組織臟器：如血液、淋奉迎、肌肉等。取樣后放入干凈青霉素瓶或干凈食袋中，于保鮮盒內(nèi)加冰儲藏送檢。3.3鼻咽拭子：用滅菌的棉簽收集后，放保鮮袋中加冰儲藏送檢。樣品辦理4.1水泡皮、臟器等：取1-2g用無菌PBS緩沖液（0.04M,pH7.2-7.4）沖洗干凈，剪碎、研磨，用PBS稀釋成1:2~1:5的懸液置4℃冰箱過夜。8000rpm離心5min，取上清液為檢測資料。4.2鼻咽拭子：加入2mLPBS緩沖液，充分?jǐn)D壓，取出棉簽8000rpm離心5min，取上清液。4.3血液、水泡液：血液可直接作檢測資料；水泡液于8000rpm離心5min后取上清，若量太少可合適加入PBS緩沖液。5PCR診斷5.1引物依照Genbank中AsiaIJiangsu株自行設(shè)計引物，片段大小約330bp，序列以下：Asia1:5′-ACTCACCCAGCCCAAGAGCAC-3’Asia2:5′-GCGTGCAAGGGCGGCGAGATC-3’依照武漢大學(xué)在Genbank中公開公布的序列自行設(shè)計，擴(kuò)增片段大小約350bp，序列以下：O1:5′-GTCAAGCCACAGGAACAGG-3′O1:5′-AGAGTTCTTTCTGCCTTCTGAGC-3′5.2RNA提取取辦理好的稀釋樣品200～300μL，加入700μLTRIZOL試劑，渦懸15s混勻，室溫靜止3min；加入200μL的氯仿，蓋緊管蓋，上下顛倒混勻15s，室溫靜止3min，2~8℃20000g離心15min；轉(zhuǎn)移水相500μL到一新的離心管中，加入0.5mL的異丙醇，混勻，室溫靜止10min，2~8℃20000g離心10min；棄去上清液，加入70%乙醇1.0mL，振搖，2~8℃20000g離心10min；棄去上清，干燥積淀物（室溫約5min）；加入20μLDEPC水溶解，-20℃保留或馬上使用（置冰上）。5.3RTRNA7μL10μmol/L引物(gE1/gE2)1μL70℃水浴中5min，爾后室溫冷卻10分鐘；再加入：dNTP(10mM)1μL5×M-MLVbuffer4μLBSA(0.4mg/mL)5μLM-MLV反轉(zhuǎn)錄酶1μL混均后，37℃水浴45-60分鐘。-20℃保留。5.4PCR擴(kuò)增反應(yīng)cDNA5.0μL10×PCRbuffer2.5μLdNTP(2.5mM)2.0μLMgCl2（25mM）1.5μL上游引物（10μmol/L）1.0μL下游引物（10μmol/L）1.0μLTaqDNA聚合酶（5U）0.2μL滅菌雙蒸水11.8μL配好反應(yīng)液后，將PCR反應(yīng)管置于PCR儀內(nèi)，循環(huán)參數(shù)以下：℃5min℃45min;AsiaI型53℃，O型58℃45min;共35個循環(huán)72℃1min；℃10min。PCR產(chǎn)物放4℃保留或馬上做瓊脂糖凝膠電泳，解析PCR產(chǎn)物。5.5結(jié)果解析與判斷％瓊脂糖凝膠板的制備稱取1.5g瓊脂糖，加入100mL1×TAE中，加熱融化后，倒入放置在水平臺面上的凝膠盤中，膠板厚5mm左右。依仍舊品數(shù)采用合適的梳子。待凝膠冷卻凝固后拔出梳子（膠中形成加樣空），放入電泳槽中，加1×TAE緩沖液淹沒膠面。加樣6～8μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物和2～3μL加樣緩沖液和合適CYBgreen混勻后加入一個加樣孔。每次電泳最少加1孔陽性比較的擴(kuò)增產(chǎn)物作為比較，沒有陽性比較的情況下，必然加Marker。電泳電壓80～100V，或電流40～50mA，電泳30～40min。結(jié)果觀察與判斷電泳結(jié)束后，取出凝膠板置于紫外透射儀上，打開紫外燈觀察。如某一待檢樣品擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA帶與陽性比較的帶在一條直線上，即他們與加樣孔的距離相同，或依照Marker判斷大小與設(shè)計的大?。?30或350bp）一致，則該樣品判斷為陽性。十