流式細(xì)胞儀在白血病免疫分型診斷的概述近年來白血病的免疫分

一、流式細(xì)胞儀在白血病免疫分型診斷的概述近年來白血病的免疫分型已成為診斷血液惡性腫瘤不可缺少的重要標(biāo)準(zhǔn)之一APAAP方法基本被廢棄。國際上公認(rèn)的通用的方法是流式細(xì)胞術(shù)。流及其分化程度。流式細(xì)胞儀診斷白血病的依據(jù)⑴FCM能快速，多參數(shù)，客觀的定性又定量測定細(xì)胞膜、漿、核的抗原表達(dá)⑵至今尚未發(fā)現(xiàn)白血病的特異抗原。⑶能用正常血細(xì)胞的單抗來進(jìn)行免疫分型是基于白血病形成的分化阻斷學(xué)說表達(dá)增多與減少甚至消失與血細(xì)胞的分化發(fā)育階段密切相關(guān)流式細(xì)胞儀診斷白血病的意義一步深化，國際白血病MIC（ALL）或急性未分化白血病但缺乏特異性淋巴細(xì)胞系列抗原標(biāo)記。③混合性白血病。④部分髓系白血病。目前CD7CD34達(dá)，預(yù)后不好。⑶疾病監(jiān)測：可監(jiān)測病程的發(fā)展，療效，可進(jìn)行微小殘留白血病的檢測。二、免疫分型常用的免疫標(biāo)志及其意義白血病系列分化抗原T淋巴細(xì)胞白血病：CD3、CD5、CD7。B淋巴細(xì)胞白血?。篊D10、CD19、CD22。NK淋巴細(xì)胞白血?。篊D16、CD56、CD57。髓系白血病：CD13、CD14、CD33、MPO（髓過氧化物酶）。紅白血病：GlyA（血型糖蛋白A）。巨核細(xì)胞白血病：CD41、CD42、CD61。白血病系列非特異性抗原CD34、HLA－DR為早期細(xì)胞抗原，無系列特異性，可與CD38聯(lián)合運用于免疫分型。一般而言，干/祖細(xì)胞CD34＋、HLA－DR＋、CD38－，原始細(xì)胞CD34＋、HLA－DR＋、CD38＋，而幼稚細(xì)胞（如早幼粒細(xì)胞）CD34－、HLA－DR－、CD38＋。白血病分化階段抗原T細(xì)胞抗原CD4、CD8。B細(xì)胞抗原：CD10、Cyμ（胞漿μ鏈）、SmIg（表面膜免疫球蛋白）、CD38和CyIg（胞漿免疫球蛋白）、CD11C。白細(xì)胞共同抗原CD45為白細(xì)胞共同抗原，其表達(dá)量在淋巴細(xì)胞最高，單核細(xì)胞，成熟粒細(xì)胞，早期造血細(xì)胞（）CD45。用SSC/CD45PerCPMcAb加CD45FSCSSCMcAbl-FITCMcAb2-PECD45PerCP五參數(shù)分析，可特異地分析原幼白血病細(xì)胞的免疫表型而不受成熟細(xì)胞的干擾。三、白血病及淋巴瘤免疫分型AMLMO：有低的SSC和FSC。在CD45－SSCCD13CD116MPOCD13CD33CD7CD4。一般HLA－DR、CD34CD7CD34共表達(dá)在AML：流式上M1M0CD13CD33HLA－DR－，但CD34M0，可能表達(dá)部分CD15。M2：M0與M1CD15M1CD34弱于M1，CD13有時表達(dá)強于CD33，多數(shù)病例HLA－DR（-）CD45－SSC圖顯示從髓系blastblastsM3、高顆粒性，具較高的SSC，但CD45較成熟C少，多數(shù)情況HLA－DR（-）或表達(dá)減少，CD34少于M2、一般CD13弱（＋），可有CD2表達(dá)。M4：兩型表型相似，但M4M5表達(dá)更多的CD34（＋），較之M0M5FSSSSC，CD45－SSC圖上，成熟CCD13、CD33、HLA－DR、CD14和CD15，CD33可表達(dá)強于CD13，CD33（＋）、CD13（－）、CD34（－）很可能為M5，但只出現(xiàn)在少數(shù)病人中，部分M5可見CD56（＋）。M6：M6較少見且特征不明顯，一般HLA－DR，CD34、CD13、CD33陽性，CD45－SSC圖顯示主要為紅系成份。M7：巨核細(xì)胞白血病，在AML1％。一般CD61（GpⅢa）/或CD41（GpⅡb-Ⅲa）blastsEDTA下，測GpⅡb/ⅢaCD34ALL：ALL是兒童中最常見的惡性腫瘤2ALL約占急性白血病的我們將ALL分為BCD10＋或CD10－，前BB祖細(xì)胞型ALL：在幼兒約占ALL55％～60％，成人為50％90％病例CD1050％病例CD10＋，blastsFSCSSC很少，是FAB標(biāo)準(zhǔn)的L1L2，一般TdT(+)HLA-DR(+)，CD19(+2CD10－，前者預(yù)祖細(xì)胞被定義為sIgBALL：此?型約占兒童ALL的25％，細(xì)胞一般為CD19＋，CD24，HLA－DR＋，胞漿CD22＋，CD10CD20多為陰性，前B?型被認(rèn)為比B出現(xiàn)相關(guān)并由此產(chǎn)生E2A－PBX1融合蛋白，它的表型為CD19CD10CD9CD20CD34－，確認(rèn)此表型有助于診斷基因上不確定的病例。B細(xì)胞型ALL：成熟B細(xì)胞型ALL約占ALL％～B細(xì)胞型ALL較之B祖細(xì)胞型ALL有更大的FSC和SSC，CD45－SSCFAB標(biāo)準(zhǔn)的CD19CD20CD22CD24CD10sIg使之區(qū)別于更早的B極少數(shù)成熟BALLFAB－L3T－ALL：多數(shù)病例有大的FSC、SSC，在CD45－SSC圖上可能出現(xiàn)在淋系未成熟細(xì)胞和髓系、CD5、CD7CD4/CD8雙陽與極少膜表面CD3TdTCD7、TdT強表達(dá)。髓質(zhì)期?型表達(dá)CD2、CD5、CD7、與CD3＋CD4＋/CD3+CD8+,很少見TdT表達(dá)。前T細(xì)胞?型，表達(dá)CD7胞漿CD3＋且無其它T特征是喪失T雜合型白血?。翰∪硕酁锽TCD22CD3MPO。CML：CD45－SSC髓像，CMLCML起病與發(fā)展相對緩慢，慢性期的持續(xù)1急變期CML主要表現(xiàn)為髓系，偶為淋系，髓性急變可表現(xiàn)出多種形態(tài)包括未分化細(xì)胞。淋性急變具典型形態(tài)特征，為CD10＋B祖細(xì)胞ALL極少有T細(xì)胞型ALL。CLL：CLL、SIgD弱表達(dá)，B系抗原為CD19CD20CD43CD79aCD5表達(dá)使得CLLMU，即（CLL：CD23＋，MCL：CD23－），CD10CD23CD11c和CD25、CD20達(dá)，盡管CLL起病慢，但CLL的三聯(lián)體trisony12、、13q、11q，免疫表型上沒有特異的變化而免疫表型的變化并不是提示染色體異常。最近，有研究表明，三聯(lián)體trisony12與SIg、CD20表達(dá)量高度相關(guān)，CD23FMC7B較CLLB－DLLCLL發(fā)揮很大作用，B－DLLCD5－，CD22＋，表達(dá)更強的sig。MU病人平均生存率不超過5年，與CLL在形態(tài)上很難區(qū)分，與CLL相似有CD5＋B祖細(xì)胞，但Sig表達(dá)強于CLL，且CD22－。另一與CLL難于區(qū)分的是FCC，細(xì)胞為強Sig、CD5－、CD10＋、CD23＋，具B系表型：對于診斷為CLL，CD5、FMC7、CD22與SIg，CD20異常強表表達(dá)的病例我們要考慮是否為DLL、MCC或CLL的?型（trisomy12）因為它們危險性更大。四、流式細(xì)胞儀免疫分型實驗樣本采集、運輸、保存和操作⑴樣本類型：適用于多種臨床標(biāo)本，如外周血、骨髓穿刺液、骨髓活檢物、淋巴樣組織活檢物、漿液、腦脊液、皮膚、黏膜（內(nèi)窺鏡活檢物）、細(xì)針穿刺物等等。EDTAACD計數(shù)和流式分析，則應(yīng)用EDTA抗凝。骨髓穿刺可用肝素。其他體液用EDTAACD或肝素均可，但保存的樣本活性可能會降低，的優(yōu)點是成熟髓性細(xì)胞貼壁造成的損失及血小板聚集較小，但細(xì)胞散射光特征丟失較肝素標(biāo)本快；由于相對大量的ACD會通過改變pH而影響骨髓細(xì)胞活性問題，通常不推薦用ACD⑶樣本的保存：樣本的完整性和細(xì)胞活性與抗凝劑的選擇、運輸、保存和溫度息息相關(guān)。①理想狀態(tài)下，樣本應(yīng)在采集后立刻進(jìn)行處理和染色。②短期保存（1小時或更短）應(yīng)在室溫(18-22℃);③長時間保存血或骨髓標(biāo)本室溫即可，有些樣本可能4℃為佳。④標(biāo)本保存的時間上限取決于標(biāo)本類型及其保存條件。⑤肝素抗凝的血和骨髓通常可保存至48-72小時；⑥EDTA抗凝的血和骨髓可保存至12－24小時。⑦ACD抗凝的血和骨髓可保存至72小時，但?quot要分析的抗原特性和染色方式，采用之前一定要進(jìn)行新鮮標(biāo)本的對照和驗證實驗。樣本制備⑴單細(xì)胞懸液的制備①血和骨髓：天然單細(xì)胞懸液。當(dāng)有血凝塊時，應(yīng)用50um尼龍網(wǎng)過濾，同時進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)和血涂片以判斷靶細(xì)胞群體是否仍然存在。⑵分離靶細(xì)胞群體樣本的任何處理方式都可能導(dǎo)致靶細(xì)胞群體的丟失的處理過程。去除紅細(xì)胞是流式分析要求的至少步驟。兩種方法：①紅細(xì)胞裂解：較佳。操作簡單、快、并最可能保持原始標(biāo)本的白細(xì)胞分布。溶血劑的選擇應(yīng)基于其選擇性去除成熟紅細(xì)胞而最小程度的影響其他細(xì)胞的特點。最好在染色后溶血。若在染色前溶血，需確認(rèn)：抗原性不被溶血過程改變；溶血劑被徹底洗去，細(xì)胞和抗體結(jié)合的動力反應(yīng)未受影響；所用溶血劑不含固定劑，否則會影響細(xì)胞活性及表面標(biāo)記結(jié)果。⑶估細(xì)胞懸液變，應(yīng)棄用。②細(xì)胞丟失和分布：確認(rèn)細(xì)胞形態(tài)和原始標(biāo)本相似。密度梯度離心之后更應(yīng)檢查細(xì)胞分布。可做血涂片判斷。③細(xì)胞計數(shù)和濃度調(diào)整：廠家推薦的抗體濃度通常是假定靶細(xì)胞數(shù)量在正常范圍內(nèi)(500,000-1,000,000／testAb)。白細(xì)胞數(shù)量上的顯著變化會帶來染色模式的變化。而白血WBC<1000/uL:用200uLWBC:1000-10000/uL,100uLWBC:10000-20000/uL,50uL量；WBC>20000/uL(2)(3)范圍內(nèi)。骨髓標(biāo)本常常要在PBS1:10（如自己稀釋抗體④細(xì)胞活性：死細(xì)胞對許多抗體有非特異性染色，有些抗原同時存在于胞膜和胞漿，這就使樣本的細(xì)胞活性檢測變得重要尤其毖揪 順な奔淶腦聳浜痛⒋媯蚨匝鏡鬧譜鞴灘惶宄薄＜觳獾姆椒ㄍǔＳ辛街鄭閡皇鞘凳鋇牧魘郊觳猓豪糜餿玖螾I7-AAD或EMA（ethidium?；罴?xì)胞將拒染這些染料。此方法的優(yōu)勢是細(xì)胞表面標(biāo)志和性分析可同時進(jìn)行通過設(shè)門即可得到活細(xì)胞的染色特性尤其適用于高度壞死的樣本樣本染色后需固定。應(yīng)在加固定劑之前洗去多余的7AAD，以保證區(qū)分的是固定前細(xì)胞的死活狀態(tài)。但隨著時間延長會在固定的細(xì)胞群體重新分配，死活細(xì)胞的區(qū)分變難。對于染色后常規(guī)固定并在固定后12小時以上分析的標(biāo)本最好用EMAEMA與死細(xì)胞DNA穩(wěn)定的共價結(jié)合保證了長時間固定后仍能很好地區(qū)分固定前的死活狀態(tài)。二是手工檢測：使用Trypanblue或其他細(xì)胞活性染料。⑷細(xì)胞染色②細(xì)胞內(nèi)染色：有些胞內(nèi)特異性抗原的檢測對白血病的免疫分型尤為重要，如TdT,MPO,cCD3,cCD22,以及胞漿內(nèi)Ig抗體組合的確定：估和分類。確認(rèn)細(xì)胞異常的能力與所用抗體的數(shù)量直接成正比。⑴選擇抗體組合的基本原則如下：1）達(dá)比例也更準(zhǔn)確。如現(xiàn)在用CD45抗體來區(qū)分正常和幼稚細(xì)胞，此方法尤其在幼稚細(xì)胞含量少時更顯優(yōu)勢。3）4）必要時用活性檢測排除死細(xì)胞較強的非特異性染色。國外統(tǒng)計，約70%組織樣本和48%血或骨髓標(biāo)本有活性檢測結(jié)果。5）CD⑵常用的方案考慮：大而全的抗體組合：全面了解抗原表達(dá)，無需額外染色，省時但費用高30%國外實驗室采用此法?；谂R床或形態(tài)學(xué)的資料，選用有目標(biāo)性的抗體組合以確認(rèn)可疑的診斷或分類。樣本獲取1-2x104256數(shù)據(jù)分析味著綜合細(xì)胞的光散射和多色熒光特征。最少的要求應(yīng)是42參數(shù)）。采用的參數(shù)越多，分析步驟越復(fù)雜，流式免疫分型的靈敏度越高。原則是要用多參數(shù)的數(shù)據(jù)創(chuàng)造可以區(qū)分正常和異常細(xì)胞的圖形，如FSCvs.SSC,FLvs.FL,Scattervs.FL細(xì)胞則通過進(jìn)一步設(shè)門分析確定表型特點。FSCvs.SSCL&LSSCBBκ鏈和抗λT細(xì)胞淋巴瘤時用一個全T細(xì)胞抗體設(shè)門使腫瘤細(xì)胞的分型更加明確。另外，通過細(xì)胞特異的"backgateCD14vs.CD45意：①在L&L中，定性的描述（陽性或陰性）通常要比陽性百分率的計算更有價值。只有在設(shè)門內(nèi)細(xì)胞全部是感興趣的細(xì)胞而且熒光分布的形狀可以非常清楚地區(qū)分陽性和陰性?群的分析（X%幼稚細(xì)胞CDX）；百分率也可用于描述異常和正常細(xì)胞的比例。CD4CD8或CD38CD22或CD4等抗原則在所謂陽性范圍內(nèi)在不同細(xì)胞類型上的區(qū)別較小。③區(qū)分弱陽性和陰性群體：在某些情況下對診斷有較大的價值，如B細(xì)胞惡性腫瘤的CD5"20直方圖上與對照組相比向右移動來判斷陽性所需的最小位移也是人為的標(biāo)準(zhǔn)K-S統(tǒng)計判斷弱陽性染色的特異與否。數(shù)據(jù)解釋雖然對流式免疫分型結(jié)果的解釋最好與形態(tài)學(xué)結(jié)果綜合考慮甚至在一些典型表現(xiàn)下流式免疫分型可以在其他方法的輔助下診斷疾病附：白血病免疫分型的結(jié)果圖Table1.CellularmarkersusefulintheidentificationandclassificationofacuteleukemiaCoreCoreCD2,CD5,CD7,CD10,CD13,CD14,CD19,CD33,CD34,CD45,HLA-DR,KAPPA,LAMBDASupplementalCD1a,s/cytoplCD3,CD4,CD8,CD20,s/cytoplCD22,CD38,CD61,CD71,MPO,TdTTable2.CellularmarkersusefulintheidentificationandclassificationoflymphoproliferativediseaseBloodandBoneMarrowBloodandBoneMarrowTissueandBodyFluidCoreCD3,CD4,CD5,CD7,CD8,CD5,CD10,CD19,CD20,CD23,CD45,CD10,CD19,CD20,CD45,KAPPA,LAMBDAKAPPA,LAMBDASupplementalCD2,CD11c,CD16,CD22,CD2,CD3,CD4,CD7,CD8,CD11c,CD13,CD23,CD25,CD56,CD57,CD16,CD22,CD33,CD38,FMC7,CD38,FMC7 CD57,IgM,IgD,IgG,IgAUsefulcombinationsUsefulcombinationsPopulationstobeUsefulcombinationsUsefulcombinationsPopulationstobeidentifiedUsefultargetsfor2-colorfor3-colorImmatureBcellsNormalorClonalBcellsCD19,CD20,Kappa,LambdaCD19(CD20)/K,CD19(CD20)/LCD19(CD20)/K/LCD19,CD20,BcellofCLLvsCD23,lymphoproliferativedisordersCD22,FMC7,CD11c,CD103,CD10CD20/5,CD23/FMC7,CD5/3/20,CD5/K/L,CD19(20)/11c,CD19/11c/103,CD19(20)/103,CD19/23/FMC7CD19(20)/10PlasmacellsCD38,Cytkappa,Cytlambda,BB4,CD56CD38/Cytkappa,CD38/CytlambdaCD38/56/45,CD38/45/CytkappaCD38/45/CytlambdaImmatureTcellsCD1,CD4,CD34,CD8,CD7,cytCD3,CD2,CD1a,TdTCD1a/2,CD2/7,CD4/8CD7/1a/2analysisanalysisCD19,CD10,CD34,CD20,CD19/10;CD20/10;CD19/10/34;CD79a,CD22,CD45,TdTCD34/22;CD45/19CD19/79a/10NormalorabnormalTcells

CD3,CD5,CD7,CD3/4,CD2,