DB37-T 4049-2020 種雞雞毒支原體和滑液囊支原體病凈化技術(shù)規(guī)范-（高清版）

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DB37山 東 省 地 方 標(biāo) 準(zhǔn)DB37/T4049—2020TechnicalcriterionforeradicationofmycoplasmagallisepticumandmycoplasmaTechnicalcriterionforeradicationofmycoplasmagallisepticumandmycoplasmasynoviaeinbreederflock2020070920200809山東省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布前言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省畜牧獸醫(yī)局提出并組織實(shí)施。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。種雞雞毒支原體和滑液囊支原體病凈化技術(shù)規(guī)范范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了種雞群雞毒支原體和滑液囊支原體病凈化技術(shù)規(guī)范。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T17999.4SPF雞微生物學(xué)監(jiān)測(cè)第4部分：SPF雞血清平板凝集試驗(yàn)NY/T553禽支原體PCR檢測(cè)方法NY/T1168畜禽糞便無(wú)害化處理技術(shù)規(guī)范NY/T5030無(wú)公害農(nóng)產(chǎn)品獸藥使用準(zhǔn)則DB34/T2160雞毒支原體感染防治技術(shù)DB63/T1652病害動(dòng)物及病害動(dòng)物產(chǎn)品無(wú)害化處理技術(shù)規(guī)程T/CVMA1禽白血病凈化技術(shù)規(guī)范世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）陸生動(dòng)物診斷試驗(yàn)和疫苗標(biāo)準(zhǔn)手冊(cè)下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1種雞breedingchicken3.2家禽疫病凈化poultrydiseaseeradication診斷參照DB34/T2160的臨床癥狀和病理變化。感染通常見于4周～16周齡的雞。雞群的患病率一般為5%～10%，病死率不超過(guò)10%。對(duì)種雞群雞毒支原體和滑液囊支原體凝集抗體的檢測(cè)，參照GB/T17999.4進(jìn)行，在2min內(nèi)出現(xiàn)凝集者為陽(yáng)性；2min內(nèi)不凝集者為陰性；介于上述兩者之間為可疑，進(jìn)行復(fù)核試驗(yàn)，如仍為可疑，判為陽(yáng)性（見附錄B）。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）方法可任選其一。試劑除非另有說(shuō)明，僅使用分析純?cè)噭?。GB/T66822×TaqPCRMasterMix10×LAMPAmplificationBuffer，-2010mmol/LBetaineA.1，-20BstDNAPolymerase（6U/μL），-204.4.1.6MgSO4(100mmol/L)A.2，-20dNTP(10mmol/L)，-20SYBRGreen4DNAMarker2000，-2043DNA4MGF-36MSGX11-TPCR≥12000r/min4.4.2.32μL、10μL、100μL200μL1000μL0.01mg。取咽喉棉拭子。將棉拭子樣品懸浮于1mLPBS溶液中，混勻成懸浮液。DNA4000r/min5min1.5mL℃條件下，12000g20min25μL～50μL0.1%焦碳DEPDNADNA（PCR）雞毒支原體和滑液囊支原體的PCR檢測(cè)方法使用的引物及反應(yīng)條件等參考NY/T553。（LAMP）引物的mgc2的16SrRNALAMP200bpMG-F3：5’-ACACTTGTTTTACATGAAGGT-3’MG-B3：5’-CAACCATCTTTTGGTGTTCT-3’MG-FIP：5’-ACAATCAACCCAGCACCTGCGTTGGTCCAAGAAAGATTACCT-3’MG-BIP：5’-TGTTTCTTTACTCTTGGGTTTAGGGTCACGTTCTTGGATCATCA-3’MS-F3：5’-GCATTAAGCGGATCGGTT-3’MS-B3：5’-AACTGCTGCATCAAGAGC-3’MS-FIP：5’-TGTTGCTGCTGTGTATTTTTCTTCTGCAGTTAAAGATGATGCACAA-3’MS-BIP：5’-ACTAGAAGATGGAACAAAACTTGCAGCAGATTCTAGATCACTTTGAGT-3’LAMP所采用的試劑盒反應(yīng)體系見表1。表1禽支原體LAMP反應(yīng)體系反應(yīng)組分體積10×AmplificationbufferⅡ2.5μLdNTP混合液(10mmol/L)4.0μLF3/B3(10μmol/L)0.5μL×2FIP/BIP(30μmol/L)1μL×2Betaine(10mmol/L)2μLDNA1μLBstDNAPolymerase(6U/μL)1μLMgSO4(100mmol/L)1μLddH2010.5μL取DNA1-5μLLAMP1mL1000×SYBRGreen6360min，8010minLAMPSYBRGreenⅠ核酸染料與LAMPC）。參照T/CVMA11.5mL0.5mL將采集到的樣品一分為二。一部分樣品用于進(jìn)行PCR或LAMP檢測(cè)（二選其一）。PCR按照NY/T553LAMP4.4.6PCR或LAMP即對(duì)可疑樣品的備份按照世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）陸生動(dòng)物診斷試驗(yàn)和疫苗標(biāo)準(zhǔn)手冊(cè)進(jìn)行病原分離和鑒定?；騆AMPPCR或LAMP觀察雞群，對(duì)有4.1.1或4.1.2臨床癥狀的可疑育成期雞進(jìn)行淘汰。100SPA采集可疑雞群的咽喉棉拭子樣品進(jìn)行PCR或LAMP，分別檢測(cè)雞毒支原體和雞滑液囊支原體。淘汰所有PCR或LAMP檢測(cè)陽(yáng)性的雞。陰性雞群應(yīng)小群隔離飼養(yǎng)，作為后備育種雞群。淘汰所有PCR或LAMP檢測(cè)陽(yáng)性的雞。陰性雞群應(yīng)小群隔離飼養(yǎng)，作為后備育種雞群。觀察開產(chǎn)前雞群，對(duì)有4.1.1或4.1.2臨床癥狀的可疑病雞進(jìn)行淘汰。同5.1.2.2。同5.1.2.3。淘汰所有血清學(xué)檢測(cè)陽(yáng)性和PCR或LAMP檢測(cè)陽(yáng)性的雞。對(duì)檢測(cè)為陰性的雞群應(yīng)維持小群飼養(yǎng)，作為后備育種雞群。觀察留種雞群，對(duì)有4.1.1或4.1.2臨床癥狀的可疑病雞進(jìn)行淘汰。1005.1.2.2和5.2.2.3PCR或LAMP5.1.4.3預(yù)防用藥在留種前2周，按照7.2進(jìn)行選擇用藥。5.1.5種蛋的選留和孵化5.1.1～5.1.4145℃，維持14父母代PCR或PCR或LAMP同5.1.2。同5.1.3。同5.1.4。5.2.1～5.2.4雞毒支原體和雞滑液囊支原體凈化后的商品代雞群。6凈化周期啟動(dòng)和終止5.1.1～5.1.45.2.1～5.2.4凈化效果評(píng)估應(yīng)按照國(guó)家農(nóng)業(yè)行業(yè)主管部門制定的雞毒支原體和雞滑液囊支原體病凈化評(píng)估程序和凈化評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)。凈化評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)見附錄D。6.3凈化后檢測(cè)比例的調(diào)整按照6.2所列要求判定為種雞達(dá)到雞毒支原體和雞滑液囊支原體病凈化狀態(tài)的雞群建議不再按照5.1.1～5.1.45.2.1～5.2.4105.1.1～5.1.4和5.2.1～5.2.42～37.1.9NY/T11687.1.9NY/T1168DB63/T1652化處理。NY/T50308檔案管理LAMP或PCR附錄A（資料性附錄）試劑的配制10mmol/LBetaine溶液Betaine 1.171510即配置成1mol/L濃度，取10μL加DEPC水至1mL，制成10mmol/LBetaine溶液。100mmol/LMgSO4MgSO4.7H2O 0.2461附錄B（資料性附錄）血清平板凝集試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)血清平板凝集試驗(yàn)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)圖見圖B.1。圖B.1血清平板凝集試驗(yàn)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照?qǐng)D（左為陽(yáng)性，中為可疑，右為陰性）附錄C（）LAMPC.1可見光下LAMP反應(yīng)結(jié)果判定圖C.1可見光下LAMP反應(yīng)陽(yáng)性（綠色熒光）與陰性（橙黃色）對(duì)照?qǐng)DC.2紫外光下LAMP反應(yīng)結(jié)果圖C.2紫外光下LAMP反應(yīng)陽(yáng)性（綠色熒光）與陰性（無(wú)熒光）對(duì)照?qǐng)D附錄D（資料性附錄）雞毒支原體病和滑液囊支原體病凈化評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)同時(shí)滿足以下要求，視為達(dá)到凈化標(biāo)準(zhǔn)：——種雞群抽檢，雞毒支原體和滑液囊支原體病原學(xué)檢測(cè)均為陰性；——連續(xù)兩年以上無(wú)臨床病例；——現(xiàn)場(chǎng)綜合審查通過(guò)。同時(shí)滿足以下要求：150GB/T17999.4—2008SPA1D.2.2病原學(xué)評(píng)估（）3%～5PCRLAMP附錄E（）表E.1種雞群凈化雞毒支原體檢測(cè)記錄表雞場(chǎng)名稱：檢測(cè)日期：頁(yè)碼1/2種雞品種種群規(guī)模（羽）周齡（W）凈化世代抽檢量檢測(cè)項(xiàng)目雞毒支原體（MG）MG抗原及標(biāo)準(zhǔn)血清批號(hào)平板凝集反應(yīng)SPA陰性編號(hào)陽(yáng)性編號(hào)可疑編號(hào)PCR或LAMP陰性編號(hào)陽(yáng)性編號(hào)