豬瘟防治技術規(guī)范

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本規(guī)范規(guī)定了豬瘟的診斷、疫情報告、疫情處置、疫情監(jiān)測、預防措施、控制和消滅標準、控制和消滅標準等。本規(guī)范適用于中華人民共和國境內一切從事豬（含馴養(yǎng)的野豬）的飼養(yǎng)、經營及其產品生產、經營，以及從事動物防疫活動的單位和個人。2診斷依據本病流行病學特點、臨床癥狀、病理變化可作出初步診斷，確診需做病原分離與鑒定。2.1流行特點豬是本病唯一的自然宿主，發(fā)病豬和帶毒豬是本病的傳染源，不同年齡、性別、品種的豬均易感。一年四季均可發(fā)生。感染豬在發(fā)病前即能通過分泌物和排泄物排毒，并持續(xù)整個病程。與感染豬直接接觸是本病傳播的主要方式，病毒也可通過精液、胚胎、豬肉和泔水等傳播，人、其它動物如鼠類和昆蟲、器具等均可成為重要傳播媒介。感染和帶毒母豬在懷孕期可通過胎盤將病毒傳播給胎兒，導致新生仔豬發(fā)病或產生免疫耐受。2.2臨床癥狀2.2.1本規(guī)范規(guī)定本病潛伏期為3-10天，隱性感染可長期帶毒。根據臨床癥狀可將本病分為急性、亞急性、慢性和隱性感染四種類型。2.2.2典型癥狀2.2.2.1發(fā)病急、死亡率高；2.2.2.2體溫通常升至41℃2.2.2.3先便秘后腹瀉，或便秘和腹瀉交替出現；2.2.2.4腹部皮下、鼻鏡、耳尖、四肢內側均可出現紫色出血斑點，指壓不褪色，眼結膜和口腔黏膜可見出血點。2.3病理變化2.3.1淋巴結水腫、出血，呈現大理石樣變；2.3.2腎臟呈土黃色，表面可見針尖狀出血點；2.3.3全身漿膜、黏膜和心臟、膀胱、膽囊、扁桃體均可見出血點和出血斑，脾臟邊緣出現梗死灶；2.3.4脾不腫大，邊緣有暗紫色突出表面的出血性梗死；2.3.52.4實驗室診斷實驗室病原學診斷必須在相應級別的生物安全實驗室進行。2.4.1病原分離與鑒定2.4.1.1病原分離、鑒定可用細胞培養(yǎng)法（見附件1）；2.4.1.2病原鑒定也可采用豬瘟熒光抗體染色法，細胞漿出現特異性的熒光（見附件2）；2.4.1.3兔體交互免疫試驗（附件3）；2.4.1.4豬瘟病毒反轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）：主要用于臨床診斷與病原監(jiān)測（見附件4）。2.4.1.5豬瘟抗原雙抗體夾心ELISA檢測法：主要用于臨床診斷與病原監(jiān)測（見附件5）。2.4.2血清學檢測2.4.2.1豬瘟病毒抗體阻斷ELISA檢測法（見附件6）；2.4.2.2豬瘟熒光抗體病毒中和試驗（見附件7）：2.4.2.3豬瘟中和試驗方法（見附件8）。2.5結果判定2.5.1疑似豬瘟符合2．2．2．1，2．2．2．2，2．2．2．3，2．2．2．4，2．3．1，2．3．2，2．3．3，2．3．4之一的。豬瘟流行病學特點、臨床癥狀和病理變化。2.5.2確診非免疫豬符合結果判定2.5.1，且符合血清學診斷2.4.2.1，、2.4.2.2，、2.4.2.3，之一；，或符合病原學診斷2.4.1.1，、2.4.1.2，、2.4.1.3，、2.4.1.4，、2.4.1.5之一的；免疫豬符合結果2.5.1，且符合病原學診斷2.4.1.1，、2.4.1.2，、2.4.1.3，、2.4.1.4，、2.4.1.5之一的。3疫情報告3.1任何單位和個人發(fā)現患有本病或疑似本病的豬，都應當立即向當地動物防疫監(jiān)督機構報告。3.2當地動物防疫監(jiān)督機構接到報告后，按國家動物疫情報告管理的有關規(guī)定執(zhí)行。4疫情處理根據流行病學、臨床癥狀、剖檢病變，結合血清學檢測做出的臨床診斷結果可作為疫情處理的依據。4.1當地縣級以上動物防疫監(jiān)督機構接到可疑豬瘟疫情報告后，應及時派員到現場診斷，根據流行病學調查、臨床癥狀和病理變化等初步診斷為疑似豬瘟時，應立即對病豬及同群豬采取隔離、消毒、限制移動等臨時性措施。同時采集病料送省級動物防疫監(jiān)督機構實驗室確診，必要時將樣品送國家豬瘟參考實驗室確診。4.2確診為豬瘟后，當地縣級以上人民政府獸醫(yī)主管部門應當立即劃定疫點、疫區(qū)、受威脅區(qū)，并采取相應措施；同時，及時報請同級人民政府對疫區(qū)實行封鎖，逐級上報至國務院獸醫(yī)主管部門，并通報毗鄰地區(qū)。國務院獸醫(yī)行政管理部門根據確診結果，確認豬瘟疫情。4.2.1劃定疫點、疫區(qū)和受威脅區(qū)疫點：為病豬和帶毒豬所在的地點。一般指病豬或帶毒豬所在的豬場、屠宰廠或經營單位，如為農村散養(yǎng)，應將自然村劃為疫點。疫區(qū)：是指疫點邊緣外延3公里受威脅區(qū)：是指疫區(qū)外延5公里4.2.2封鎖由縣級以上獸醫(yī)行政管理部門向本級人民政府提出啟動重大動物疫情應急指揮系統(tǒng)、應急預案和對疫區(qū)實行封鎖的建議，有關人民政府應當立即做出決定。4.2.3對疫點、疫區(qū)、受威脅區(qū)采取的措施疫點：撲殺所有的病豬和帶毒豬，并對所有病死豬、被撲殺豬及其產品按照GB16548規(guī)定進行無害化處理；對排泄物、被污染或可能污染飼料和墊料、污水等均需進行無害化處理；對被污染的物品、交通工具、用具、禽舍、場地進行嚴格徹底消毒（見附件9）；限制人員出入，嚴禁車輛進出，嚴禁豬只及其產品及可能污染的物品運出。疫區(qū)：對疫區(qū)進行封鎖，在疫區(qū)周圍設置警示標志，在出入疫區(qū)的交通路口設置動物檢疫消毒站(臨時動物防疫監(jiān)督檢查站)，對出入的人員和車輛進行消毒；對易感豬只實施緊急強制免疫，確保達到免疫保護水平；停止疫區(qū)內豬及其產品的交易活動，禁止易感豬只及其產品運出；對豬只排泄物、被污染飼料、墊料、污水等按國家規(guī)定標準進行無害化處理；對被污染的物品、交通工具、用具、禽舍、場地進行嚴格徹底消毒。受威脅區(qū)：對易感豬只(未免或免疫未達到免疫保護水平)實施緊急強制免疫，確保達到免疫保護水平；對豬只實行疫情監(jiān)測和免疫效果監(jiān)測。4.2.4緊急監(jiān)測對疫區(qū)、受威脅區(qū)內的豬群必須進行臨床檢查和病原學監(jiān)測。4.2.5疫源分析與追蹤調查根據流行病學調查結果，分析疫源及其可能擴散、流行的情況。對可能存在的傳染源，以及在疫情潛伏期和發(fā)病期間售(／運)出的豬只及其產品、可疑污染物（包括糞便、墊料、飼料等）等應當立即開展追蹤調查，一經查明立即按照GB16548規(guī)定進行無害化處理。4.2.6封鎖令的解除疫點內所有病死豬、被撲殺的豬按規(guī)定進行處理，疫區(qū)內沒有新的病例發(fā)生，徹底消毒10天后，經當地動物防疫監(jiān)督機構審驗合格，當地獸醫(yī)主管部門提出申請，由原封鎖令發(fā)布機關解除封鎖。4.2.7疫情處理記錄對處理疫情的全過程必須做好詳細的記錄（包括文字、圖片和影像等），并歸檔。5預防與控制以免疫為主，采取“撲殺和免疫相結合”的綜合性防治措施。5.1飼養(yǎng)管理與環(huán)境控制飼養(yǎng)、生產、經營等場所必須符合《動物防疫條件審核管理辦法》（農業(yè)部[2002]15號令）規(guī)定的動物防疫條件，并加強種豬調運檢疫管理。5.2消毒各飼養(yǎng)場、屠宰廠（場）、動物防疫監(jiān)督檢查站等要建立嚴格的衛(wèi)生（消毒）管理制度，做好；豬圈、加工廠、用具、車輛、糞便、道路和人員等應進行定期的嚴格消毒、殺蟲、滅鼠工作（見附件9）。5.3免疫和凈化5.3.1免疫國家對豬瘟實行全面免疫政策。預防免疫按農業(yè)部制定的免疫方案規(guī)定的免疫程序進行。所用疫苗必須是經國務院獸醫(yī)主管部門批準使用的豬瘟疫苗。5.3.2凈化對種豬場和規(guī)模養(yǎng)殖場的種豬定期采樣進行病原學檢測，對檢測陽性豬及時進行撲殺和無害化處理，以逐步凈化豬瘟。5.4監(jiān)測和預警5.4.1監(jiān)測方法非免疫區(qū)域：以流行病學調查、血清學監(jiān)測為主，結合病原鑒定。免疫區(qū)域：以病原監(jiān)測為主，結合流行病學調查、血清學監(jiān)測。5.4.2監(jiān)測范圍、數量和時間對于各類種豬場每年要逐頭監(jiān)測兩次；商品豬場每年監(jiān)測兩次，抽查比例不低于0.1%，最低不少于20頭；散養(yǎng)豬不定期抽查?；虬凑辙r業(yè)部年度監(jiān)測計劃執(zhí)行。5.4.3監(jiān)測報告監(jiān)測結果要及時匯總，由省級動物防疫監(jiān)督機構定期上報中國動物疫病預防控制中心。5.4.4預警各級動物防疫監(jiān)督機構對監(jiān)測結果及相關信息進行風險分析，做好預警預報。5.5消毒飼養(yǎng)場、屠宰廠（場）、交易市場、運輸工具等要建立并實施嚴格的消毒制度。5.6檢疫5.6.1產地檢疫生豬在離開飼養(yǎng)地之前，養(yǎng)殖場/戶必須向當地動物防疫監(jiān)督機構報檢。動物防疫監(jiān)督機構接到報檢后必須及時派員到場/戶實施檢疫。檢疫合格后，出具合格證明；對運載工具進行消毒，出具消毒證明，對檢疫不合格的按照有關規(guī)定處理。5.6.2屠宰檢疫動物防疫監(jiān)督機構的檢疫人員對生豬進行驗證查物，合格后方可入廠/場屠宰。檢疫合格并加蓋（封）檢疫標志后方可出廠/場，不合格的按有關規(guī)定處理。5.6.3種豬異地調運檢疫跨省調運種豬時，應先到調入地省級動物防疫監(jiān)督機構辦理檢疫審批手續(xù)，調出地按照進行檢疫，檢疫合格方可調運。到達后須隔離飼養(yǎng)10天以上，由當地動物防疫監(jiān)督機構檢疫合格后方可投入使用。6控制和消滅標準6.1免疫無豬瘟區(qū)6.1.1該區(qū)域首先要達到國家無規(guī)定疫病區(qū)基本條件。6.1.2有定期、快速的動物疫情報告記錄。6.1.3該區(qū)域在過去3年內未發(fā)生過豬瘟。6.1.4該區(qū)域和緩沖帶實施強制免疫，免疫密度100%，所用疫苗必須符合國家獸醫(yī)主管部門規(guī)定。6.1.5該區(qū)域和緩沖帶須具有運行有效的監(jiān)測體系，過去2年內實施疫病和免疫效果監(jiān)測，未檢出病原，免疫效果確實。6.1.6所有的報告，免疫、監(jiān)測記錄等有關材料詳實、準確、齊全。若免疫無豬瘟區(qū)內發(fā)生豬瘟時，最后一例病豬撲殺后12個月，經實施有效的疫情監(jiān)測，確認后方可重新申請免疫無豬瘟區(qū)。6.2非免疫無豬瘟區(qū)6.2.1該區(qū)域首先要達到國家無規(guī)定疫病區(qū)基本條件。6.2.2有定期、快速的動物疫情報告記錄。6.2.3在過去2年內沒有發(fā)生過豬瘟，并且在過去12個月內，沒有進行過免疫接種；另外，該地區(qū)在停止免疫接種后，沒有引進免疫接種過的豬。6.2.4在該區(qū)具有有效的監(jiān)測體系和監(jiān)測區(qū)，過去2年內實施疫病監(jiān)測，未檢出病原。6.2.5所有的報告、監(jiān)測記錄等有關材料詳實、準確、齊全。若非免疫無豬瘟區(qū)發(fā)生豬瘟后，在采取撲殺措施及血清學監(jiān)測的情況下，最后一例病豬撲殺后6個月；或在采取撲殺措施、血清學監(jiān)測及緊急免疫的情況下，最后一例免疫豬被屠宰后6個月，經實施有效的疫情監(jiān)測和血清學檢測確認后，方可重新申請非免疫無豬瘟區(qū)。

附件1病毒分離鑒定采用細胞培養(yǎng)法分離病毒是診斷豬瘟的一種靈敏方法。通常使用對豬瘟病毒敏感的細胞系如PK-15細胞等，加入2%扁桃體、腎臟、脾臟或淋巴結等待檢組織懸液于培養(yǎng)液中。37℃培養(yǎng)48～72步驟如下：1.制備抗生素濃縮液（青霉素10000IU/mL、鏈霉素10000IU/mL、卡那霉素和制霉菌素5000IU/mL），小瓶分裝，-20℃2.取1～2g待檢病料組織放入滅菌研缽中，剪刀剪碎，加入少量無菌生理鹽水，將其研磨勻漿；再加入Hank’’Ss平衡鹽溶液或細胞培養(yǎng)液，制成20%(w/v)組織懸液；最后按1/10的比例加入抗生素濃縮液，混勻后室溫作用1小時；以1000g離心15分鐘，取上清液備用。3.用胰酶消化處于對數生長期的PK-15細胞單層，將所得細胞懸液以1000g離心10分鐘，再用一定量EMEM生長液[含5%胎牛血清(無BVDV抗體)，56℃滅活30分鐘]、0.3％谷氨酰胺、青霉素100IU/mL、鏈霉素100IU/mL)懸浮，使細胞濃度為2×106/mL4.9份細胞懸液與1份上清液混合，接種6～8支含細胞玻片的萊頓氏管(leighton’s)(或其它適宜的細胞培養(yǎng)瓶),每管0.2mL；同時設3支萊頓氏管接種細胞懸液作陰性對照；另設3支萊頓氏管接種豬瘟病毒作陽性對照。5.經培養(yǎng)24、48、72小時，分別取2管組織上清培養(yǎng)物及1管陰性對照培養(yǎng)物、1管陽性對照培養(yǎng)物，取出細胞玻片，以磷酸緩沖鹽水（PBS液，pH7.2，0.01M）或生理鹽水洗滌2次，每次5分鐘，用冷丙酮(分析純)固定10分鐘，晾干，采用豬瘟病毒熒光抗體染色法進行檢測（見附件2）。6.根據細胞玻片豬瘟熒光抗體染色強度，判定病毒在細胞中的增殖情況，若熒光較弱或為陰性，應按步驟4將組織上清細胞培養(yǎng)物進行病毒盲傳。臨床發(fā)病豬或疑似病豬的全血樣是豬瘟早期診斷樣品。接種細胞時操作程序如下：取-20℃凍存全血樣品置37℃水浴融化；向24孔板每孔加300微升血樣以覆蓋對數生長期的PK-15單層細胞；37℃吸附2小時。棄去接種液，用細胞培養(yǎng)液洗滌細胞二次，然后加入EMEM維持液，37℃培養(yǎng)24至

附件2豬瘟熒光抗體染色法熒光抗體染色法快速、特異，可用于檢測扁桃體等組織樣品以及細胞培養(yǎng)中的病毒抗原。操作程序如下：1樣品的采集和選擇1.1活體采樣：利用扁桃體采樣器（鼻捻子、開口器和采樣槍）。采樣器使用前均須用3%氫氧化鈉溶液消毒后經清水沖洗。首先固定活豬的上唇，用開口器打開口腔，用采樣槍采取扁桃體樣品，用滅菌牙簽挑至滅菌離心管并作標記。1.2其它樣品：剖檢時采取的病死豬臟器，如扁桃體、腎臟、脾臟、淋巴結、肝臟和肺等臟器，或病毒分離時待檢的細胞玻片。1.3樣品采集、包裝與運輸按農業(yè)部相關要求執(zhí)行。2檢測方法與判定2.1方法：將上述組織制成冰凍切片，或待檢的細胞培養(yǎng)片（見附件1），將液體吸干后經冷丙酮固定5～10分鐘，晾干。滴加豬瘟熒光抗體覆蓋于切片或細胞片表面，置濕盒中37℃作用30分鐘。然后用PBS液洗滌，自然干燥。用碳酸緩沖甘油（pH9.0～9.5，0.5M2.2判定：在熒光顯微鏡下，見切片或細胞培養(yǎng)物（細胞蓋片）中有胞漿熒光，并由抑制試驗證明為特異的熒光，判豬瘟陽性；無熒光判為陰性。2.3熒光抑制試驗：將兩組豬瘟病毒感染豬的扁桃體冰凍切片，分別滴加豬瘟高免血清和健康豬血清（豬瘟中和抗體陰性），在濕盒中37℃作用30分鐘，用生理鹽水或PBS(pH7.2)漂洗2次，然后進行熒光抗體染色。經用豬瘟高免血清處理的扁桃體切片，隱窩上皮細胞不應出現熒光，或熒光顯著減弱；而用陰性血清處理的切片，隱窩上皮細胞仍出現明亮的黃綠色熒光。

附件兔體交互免疫試驗本方法用于檢測疑似豬瘟病料中的豬瘟病毒。1試驗動物家兔1.5～2kg、體溫波動不大的大耳白兔，并在試驗前1天測基礎體溫。2試驗操作方法將病豬的淋巴結和脾臟，磨碎后用生理鹽水作1：10稀釋，對3只健康家兔作肌肉注射，5mL/只，另設3只不注射病料的對照兔，間隔5天對所有家兔靜脈注射1:20的豬瘟兔化病毒（淋巴脾臟毒），1mL/只，24h后，每隔6小時測體溫一次，連續(xù)測96小時，對照組2/3出現定型熱或輕型熱，試驗成立。3兔體交互免疫試驗結果判定接種病料后體溫反應接種豬瘟兔化弱毒后體溫反應結果判定--含豬瘟病毒-+不含豬瘟病毒+-含豬瘟兔化病毒++含非豬瘟病毒熱原性物質注：“+”表示多于或等于三分之二的動物有反應。附件4豬瘟病毒反轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）RT-PCR方法通過檢測病毒核酸而確定病毒存在，是一種特異、敏感、快速的方法。在RT-PCR擴增的特定基因片段的基礎上，進行基因序列測定，將獲得的基因信息與我國豬瘟分子流行病學數據庫進行比較分析，可進一步鑒定流行毒株的基因型，從而追蹤流行毒株的傳播來源或預測預報新的流行毒株。材料與樣品準備1.1材料準備：本試驗所用試劑需用無RNA酶污染的容器分裝；各種離心管和帶濾芯吸頭需無RNA酶污染；剪刀、鑷子和研缽器須經干烤滅菌。1.2樣品制備：按1：5（W/V）比例，取待檢組織和PBS液于研缽中充分研磨，4℃，1000g離心15分鐘，取上清液轉入無RNA酶污染的離心管中，備用；全血采用脫纖抗凝備用；細胞培養(yǎng)物凍融3次備用；其它樣品酌情處理。制備的樣品在2～8℃保存不應超過24小時，長期保存應小分裝后置RNA提取2.1取1.5mL離心管，每管加入800μLRNA提取液（通用Trizol）和被檢樣品200μL，充分混勻，靜置5分鐘。同時設陽性和陰性對照管，每份樣品換一個吸頭。2.2加入200μL氯仿，充分混勻，靜置5分鐘，4℃、12000g離心152.3取上清約500μL（注意不要吸出中間層）移至新離心管中，加等量異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10分鐘，4℃、12000g離心102.4小心棄上清，倒置于吸水紙上，沾干液體；加入1000μL75%乙醇，顛倒洗滌，4℃、12000g離心102.5小心棄上清，倒置于吸水紙上，沾干液體；4000g離心10分鐘，將管壁上殘余液體甩到管底部，小心吸干上清，吸頭不要碰到有沉淀的一面，每份樣品換一個吸頭，室溫干燥。2.6加入10μLDEPC水和10URNasin,輕輕混勻，溶解管壁上的RNA，4000g離心10分鐘，盡快進行試驗。長期保存應置-70℃cDNA合成取200μLPCR專用管，連同陽性對照管和陰性對照管，每管加10μLRNA和50pM下游引物P2(P25’-CACAG（CT）CC（AG）AA（TC）CC（AG）AAGTCATC-3’PCR4.1取200μLPCR專用管，連同陽性對照管和陰性對照管，每管加上述10μLcDNA和適量水，95℃預變性54.2每管加入10倍稀釋緩沖液5μL，上游引物P1（5’-TC（GA）（AT）CAACCAA（TC）GAGATAGGG-3’）和下游引物P2各50pM，10mol/LdNTP2μL，Taq酶2.5U，補水至50μ4.3置PCR儀，循環(huán)條件為95C50sec，58C60sec，72C35sec，共40個循環(huán)，72結果判定取RT-PCR產物5μL，于1%瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠中含0.5μL/mL溴化乙錠，電泳緩沖液為0.5×TBE，80V30分鐘，電泳完后于長波紫外燈下觀察拍照。陽性對照管和樣品檢測管出現251nt的特異條帶判為陽性；陰性管和樣品檢測管未出現特異條帶判為陰性。

附件5豬瘟抗原雙抗體夾心ELISA檢測方法本方法通過形成的多克隆抗體-樣品-單克隆抗體夾心，并采用辣根過氧化物酶標記物檢測，對外周血白細胞、全血、細胞培養(yǎng)物以及組織樣本中的豬瘟病毒抗原進行檢測的一種雙抗體夾心ELISA方法。具體如下：1試劑盒組成1.1多克隆羊抗血清包被板條8孔×12條（96孔）1.2CSFV陽性對照，含有防腐劑1.5mL1.3CSFV陰性對照，含有防腐劑1.5mL1.4100倍濃縮辣根過氧化物酶標記物（100×）辣根過氧化物酶標記抗鼠IgG，含防腐劑200uL1.510倍濃縮樣品稀釋液（10×）55mL1.6底物液，TMB/H2O2溶液12mL1.7終止液，1MHCL（小心，強酸）12mL1.810倍濃縮洗滌液（10×）125mL1.9CSFV單克隆抗體，含防腐劑4mL1.10酶標抗體稀釋液15mL2樣品制備注意：制備好的樣品或組織可以在2～7℃保存7天，或-20℃冷凍保存6個月以上。但這些樣品在應用前應該再次以1500g離心10分鐘或10000g離心2～52.1外周血白細胞2.1.1取10mL肝素或EDTA抗凝血樣品，1500g離心15～20分鐘。2.1.2再用移液器小心吸出血沉棕黃層，加入500uL樣品稀釋液（1×）,在旋渦振蕩器上混勻，室溫下放置1小時，期間不時旋渦混合。然后直接進行步驟2.1.6操作。2.1.3假如樣品的棕黃層壓積細胞體積非常少，那么就用整個細胞團（包括紅細胞）。將細胞加進10mL的離心管，并加入5mL預冷（2～7℃，下同）的0.17MNH4Cl?；靹?，靜置102.1.4用冷（2～7℃）超純水或雙蒸水加滿離心管，輕輕上下顛倒混勻，1500g離心52.1.5棄去上清，向細胞團中加入500uL樣品稀釋液（1×）,用潔凈的吸頭懸起細胞，在旋渦振蕩器上混勻，室溫放置1小時。期間不時旋渦混合。2.1.61500g離心5分鐘,取上清液按操作步驟進行檢測。注意：處理好的的樣品可以在2～7℃保存7天，或-20℃冷凍保存62.2外周血白細胞（簡化方法）2.2.1取0.5～2mL肝素或EDTA抗凝血與等體積冷0.17MNH4Cl加入離心管混合。室溫放置102.2.21500g離心10分鐘（或10000g離心2－3分鐘），棄上清。2.2.3用冷（2～7℃）超純水或雙蒸水加滿離心管，輕輕上下顛倒混勻，1500g離心52.2.4棄去上清，向細胞團加入500ul樣本稀釋液（1×）。旋渦振蕩充分混勻，室溫放置1小時。期間不時旋渦混勻。取75ul按照“操作步驟”進行檢測。2.3全血（肝素或EDTA抗凝）2.3.1取25uL10倍濃縮樣品稀釋液（10×）和475uL全血加入微量離心管，在旋渦振蕩器上混勻。2.3.2室溫下孵育1小時，期間不時旋渦混合。此樣品可以直接按照“操作步驟”進行檢測?；颍褐苯訉?5uL全血加入酶標板孔中，再加入10uL5倍濃縮樣品稀釋液（5×）?；蝿用笜税澹鍡l，使樣品混合均勻。再按照“操作步驟”進行檢測。2.4細胞培養(yǎng)物2.4.1移去細胞培養(yǎng)液，收集培養(yǎng)瓶中的細胞加入離心管中。2.4.22500g離心5分鐘，棄上清。2.4.3向細胞團中加入500uL樣品稀釋液（1×）。旋渦振蕩充分混勻，室溫孵育1小時。期間不時旋渦混合。取此樣品75uL按照“操作步驟”進行檢測。2.5組織最好用新鮮的組織。如果有必要，組織可以在處理前于2～7℃冷藏保存1個月。每只動物檢測1～2種組織，最好選取扁桃體、脾、腸、腸系膜淋巴結或肺。2.5.1取1～2g組織用剪刀剪成小碎塊（2～5mm大小）。2.5.2將組織碎塊加入10mL離心管，加入5mL樣品稀釋液（1×）,旋渦振蕩混勻，室溫下孵育1～21小時，期間不時旋渦混合。2.5.31500g離心5分鐘，取75uL上清液按照“操作步驟”進行檢測。3操作步驟注意：所有試劑在使用前應該恢復至室溫18～22℃；使用前試劑應在室溫條件下至少放置1小時。3.1每孔加入25uLCSFV特異性單克隆抗體。此步驟可以用多道加樣器操作。3.2在相應孔中分別加入75uL陽性對照、陰性對照，各加2孔。注意更換吸頭。3.3在其余孔中分別加入75uL制備好的樣品，注意更換吸頭。輕輕拍打酶標板，使樣品混合均勻。3.4置濕盒中或用膠條密封后室溫（18～22℃）孵育過夜。也可以孵育43.5甩掉孔中液體，用洗滌液（1×）洗滌5次，每次洗滌都要將孔中的所有液體倒空，用力拍打酶標板，以使所有液體拍出?；蛘?，每孔加入洗滌液250～300uL用自動洗板機洗滌5次。注意:，洗滌酶標板要仔細。3.6每孔加入100uL稀釋好的辣根過氧化物酶標記物，在濕盒或密封后置室溫孵育1小時。3.7重復操作步驟3.5；每孔加入100uL底物液，在暗處室溫孵育10分鐘。第1孔加入底物液開始計時。3.8每孔加入100uL終止液終止反應。加入終止液的順序與上述加入底物液的順序一致。3.9在酶標儀上測量樣品與對照孔在450nm處的吸光值，或測量在450nm和620nm雙波長的吸光值（空氣調零）。3.10計算每個樣品和陽性對照孔的矯正OD值的平均值（參見“計算方法”）。4計算方法首先計算樣品和對照孔的OD平均值，在判定結果之前，所有樣品和陽性對照孔的OD平均值必須進行矯正，矯正的OD值等于樣本或陽性對照值減去陰性對照值。矯正OD值＝樣本OD值－陰性對照OD值5試驗有效性判定陽性對照OD平均值應該大于0.500，陰性對照OD平均值應小于陽性對照平均值的20％，試驗結果方能有效。否則，應仔細檢查實驗操作并進行重測。如果陰性對照的OD值始終很高，將陰性對照在微量離心機中10000g離心3～5分鐘，重新檢測。6結果判定被檢樣品的矯正OD值大于或等于0.300，則為陽性；被檢樣品的矯正OD值小于0.200，則為陰性；被檢樣品的矯正OD值大于0.200，小于0.300，則為可疑。附件6豬瘟病毒抗體阻斷ELISA檢測方法本方法是用于檢測豬血清或血漿中豬瘟病毒抗體的一種阻斷ELISA方法，通過待測抗體和單克隆抗體與豬瘟病毒抗原的競爭結合，采用辣根過氧化物酶與底物的顯色程度來進行判定。1操作步驟在使用時，所有的試劑盒組分都必須恢復到室溫18～25℃。使用前應將各組分放置于室溫至少1小時。1.1分別將50uL樣品稀釋液加入每個檢測孔和對照孔中。1.2分別將50uL的陽性對照和陰性對照加入相應的對照孔中，注意不同對照的吸頭要更換，以防污染。1.3分別將50uL的被檢樣品加入剩下的檢測孔中，注意不同檢樣的吸頭要分開，以防污染。1.4輕彈微量反應板或用振蕩器振蕩，使將反應板中的溶液混勻。1.5將微量反應板用封條封閉置或于濕箱中（18～25℃）孵育2小時，也可以將微量反應板用封條置或1.6吸出反應孔中的液體，并用稀釋好的洗滌液洗滌3次，注意每次洗滌時都要將洗滌液加滿反應孔。1.7分別將100uL的抗CSFV酶標二抗（即取即用）加入反應孔中，用封條封閉反應板并于室溫下或濕箱中孵育30分鐘。1.8洗板（見1.6）后，分別將100uL的底物溶液加入反應孔中，于避光、室溫條件下放置10分鐘。加完第一孔后即可計時。1.9在每個反應孔中加入100uL終止液終止反應。注意要按加酶標二抗的順序加終止液。1.10在450nm處測定樣本以及對照的吸光值，也可用雙波長(450nm和620nm)測定樣本以及對照的吸光度值，空氣調零。1.11計算樣本和對照的平均吸光度值。計算方法如下：計算被檢樣本的平均值OD450（＝ODTEST）、陽性對照的平均值（＝ODPOS）、陰性對照的平均值（＝ODNEG）。根據以下公式計算被檢樣本和陽性對照的阻斷率；ODNEG-ODTEST阻斷率＝———————×100%ODNEG2試驗有效性陰性對照的平均OD450應大于0.50。陽性對照的阻斷率應大于50%％。3結果判定如果被檢樣本的阻斷率大于或等于40％，該樣本被判定為陽性（有CSFV抗體存在）。如果被檢樣本的阻斷率小于或等于30％，該樣本被判定為陰性（無CSFV抗體存在）。如果被檢樣本阻斷率在30～40％之間，應在數日后再對該動物進行重測。附件7熒光抗體病毒中和試驗本方法是國際貿易指定的豬瘟抗體檢測方法。該試驗是采用固定病毒稀釋血清的方法。測定的結果表示待檢血清中抗體的中和效價。具體操作如下：將濃度為2×105細胞/mL的PK-15細胞懸液接種到帶有細胞玻片的5cm平皿或萊頓氏管（leighton’s），也可接種到平底微量培養(yǎng)板中；細胞培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)至匯合率為70%～80%的細胞單層（1～2將待檢血清56℃滅活30分鐘，用無血清EMEM培養(yǎng)液作