妥布霉素原料藥微生物限度檢查方法學(xué)驗(yàn)證

第3頁(yè)共2頁(yè)妥布霉素原料藥微生物限度檢查方法學(xué)驗(yàn)證1、概述妥布霉素的抗菌譜及抗菌作用與慶大霉素近似，對(duì)絕大多數(shù)腸桿菌科細(xì)菌、銅綠假單胞菌及葡萄球菌具有良好抗菌作用。妥布霉素原料藥的微生物限度檢查的方法學(xué)驗(yàn)證，應(yīng)采用薄膜過(guò)濾法。濾器可使用我公司生產(chǎn)的反復(fù)使用過(guò)濾器及濾膜（直徑50mm）。我公司實(shí)驗(yàn)室按照《中國(guó)藥典》2010版微生物限度檢查法中“計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證”程序，以金黃色葡萄球菌作為代表菌種對(duì)該藥品進(jìn)行了驗(yàn)證?，F(xiàn)將實(shí)驗(yàn)過(guò)程及結(jié)果介紹如下，供同行參考。2、實(shí)驗(yàn)用器材等1）樣品：妥布霉素（批號(hào)：110901），由制藥企業(yè)提供。2）HTY-601集菌儀（編號(hào)為JS-02-054）3）反復(fù)使用過(guò)濾器（FC50B）4)微孔濾膜（貨號(hào)為：2004）5）金黃色葡萄球菌CMCC(B)26003第5代3．實(shí)驗(yàn)步驟及結(jié)果3．1常規(guī)法3.1.1金黃色葡萄球菌菌液的制備：接種金黃色葡萄球菌的新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18-24h，上述培養(yǎng)物用0.9%的無(wú)菌氯化鈉溶液稀釋制成含菌量在50-100cfu/ml的菌懸液。3.1.2實(shí)驗(yàn)操作：取樣品8g，加pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至80ml，搖勻，制成1：10的供試液。分別取該供試液10ml，加至90mlpH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，搖勻，制備6份。取備妥的過(guò)濾器，分別濾過(guò)供試液，取pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液，各份按500ml、700ml、900ml的梯度，分別對(duì)6份供試液進(jìn)行沖洗，各個(gè)梯度制備2份。并分別取每個(gè)沖洗梯度的1個(gè)杯體，在最后100ml沖洗液中加入50-100cfu金黃色葡萄球菌，另1杯體不加菌，作為供試品對(duì)照組（測(cè)定本底菌數(shù)）；另取一個(gè)過(guò)濾器過(guò)濾pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液100ml，在最后100ml沖洗液中加入50-100cfu金黃色葡萄球菌，作為稀釋劑對(duì)照組。所有濾器濾干后取膜，菌面朝上貼于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板。置30-35度培養(yǎng)48小時(shí)，計(jì)數(shù)。3.1.3結(jié)果；稀釋劑回收率達(dá)到98%；試驗(yàn)組3個(gè)沖洗梯度的回收率測(cè)試結(jié)果，金黃色葡萄球菌均未生長(zhǎng)，故采用降低供試品接種量的方法繼續(xù)進(jìn)行驗(yàn)證。3．2降低供試品接種量試驗(yàn)法3.2.1實(shí)驗(yàn)操作：取1：10供試液1ml，加至99mlpH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，搖勻，制備6份，各份按300ml、500ml、700ml的梯度沖洗，以下操作同常規(guī)法。3.2.2結(jié)果：稀釋劑回收率達(dá)到93%；試驗(yàn)組3個(gè)沖洗梯度的回收率測(cè)試結(jié)果仍未達(dá)到70%。3．3再稀釋法按照《中國(guó)藥典》2010版微生物限度檢查法“計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證”中“根據(jù)供試品須符合的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)和菌數(shù)報(bào)告規(guī)則，在不影響檢驗(yàn)結(jié)果判斷的前提下，應(yīng)采用能使微生物生長(zhǎng)的更高稀釋級(jí)的供試液進(jìn)行方法驗(yàn)證試驗(yàn)”的相關(guān)規(guī)定，繼續(xù)采用再稀釋法進(jìn)行驗(yàn)證。3.3.1實(shí)驗(yàn)操作：取該品的1：100的稀釋液1ml，稀釋到99mlpH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，搖勻，制備4份，各取1份按300ml、500ml、700ml的梯度沖洗，取1份經(jīng)700ml沖洗作本底計(jì)數(shù)。以下操作同常規(guī)方法。3.3.2結(jié)果：稀釋劑回收率達(dá)到91%；3個(gè)沖洗梯度的回收率均達(dá)到70%。3.3.3重復(fù)試驗(yàn)：取1：100的稀釋液，按300ml、500ml、700ml沖洗梯度重復(fù)試驗(yàn)2次。3.3.3.1結(jié)果：500ml及700ml沖洗梯度的各2個(gè)杯體回收率均達(dá)到70%；300ml沖洗梯度未達(dá)到。3.3.4再稀釋法3個(gè)沖洗梯度3次試驗(yàn)的回收率及平均回收率均達(dá)到70%的為500ml及700ml梯度。3次試驗(yàn)的回收率具體情況見(jiàn)下表：再稀釋法3次試驗(yàn)的回收率及平均回收率沖洗量（ml）每次試驗(yàn)組回收率（%）3次試驗(yàn)平均回收率（%）30097/52/5009481797070096817078注：各批稀釋劑的回收率均達(dá)到90%；再稀釋法700ml沖洗量測(cè)定的供試品本底數(shù)均為0。4、結(jié)論妥布霉素原料藥的微生物限度檢查可按稀釋法進(jìn)行。具體