細菌染色和涂片觀察的方法

關于細菌染色和涂片觀察的方法第1頁，共49頁，2022年，5月20日，23點41分，星期五第一節(jié)

不染色標本檢查法所謂不染色標本檢查法是將細菌標本不經(jīng)染色直接鏡檢，從而觀察生活狀態(tài)下細菌的形態(tài)及運動狀況的一種檢查方法。這種檢查方法雖可看到細菌的大致輪廓，但主要用于觀察細菌的動力。第2頁，共49頁，2022年，5月20日，23點41分，星期五一、不染色標本檢查法的具體方法1、壓滴法2、懸滴法3、毛細管法第3頁，共49頁，2022年，5月20日，23點41分，星期五第二節(jié)

染色標本檢查法所謂染色標本檢查法是用特殊的手段對細菌進行染色，而后再檢查其形態(tài)、大小、排列方式、染色反應以及特殊結構的一種檢查方法,有助于細菌的初步識別或診斷。第4頁，共49頁，2022年，5月20日，23點41分，星期五

細菌染色的一般程序細菌染色的基本程序是：涂片→固定→（媒染）→染色→（脫色）→（復染）第5頁，共49頁，2022年，5月20日，23點41分，星期五1、涂片制備：

隨標本的種類而略有不同。一般臨床標本大多可直接涂抹于潔凈載玻片上；培養(yǎng)的細菌，若為液體培養(yǎng)液，亦可直接涂于載玻片上；若為固體培養(yǎng)基上的細菌，則先取一接種環(huán)生理鹽水于載玻片中央，然后從培養(yǎng)基上取菌少許，在鹽水中研磨均勻，使呈輕度乳濁，以接種環(huán)擴成1cm2或2份硬幣大小的涂面，在室溫下自然干燥或放在火焰上方的熱空氣中慢慢烘干。但切忌緊靠火焰烤干。第6頁，共49頁，2022年，5月20日，23點41分，星期五2、固定：染色前必須先行固定。其目的在于凝固細胞質(zhì)和其它細胞結構成分而殺死細菌；使菌體粘附于玻片上以及改變細菌對染料的通透性（因活菌通常不易使染料透入細胞內(nèi)）。固定的方法一般采用火焰加熱法，在特殊目的時也可用冷凍干燥法或化學法如醇、酸、氯化高汞、重金屬鹽或氧化劑等進行固定。第7頁，共49頁，2022年，5月20日，23點41分，星期五3、媒染：媒染的目的是增加染料和被染物的親和力。凡使染料固定于被染物；或引起細胞膜通透性改變的物質(zhì)統(tǒng)稱為媒染劑。常用的媒染劑有明礬、苦味酸、金屬鹽、碘等。也可用加熱法媒染。媒染劑可用于固定之后，亦可含于固定液或染液中，也可在初染之后復染之前進行。第8頁，共49頁，2022年，5月20日，23點41分，星期五4、染色：隨目的而選用適宜的染液。染色時，滴加染液以覆蓋涂面為度，染色時間隨方法而定。單染法只用一種染料如呂氏美蘭、稀釋石炭酸復紅等；而多數(shù)染色法需用第二種染液進行復染。第9頁，共49頁，2022年，5月20日，23點41分，星期五5、脫色：脫色：是使被染物脫去已染上的顏色。脫色的目的是觀察細菌與染料結合的穩(wěn)定程度，故可作為鑒別染色之用。凡具有脫色作用的化學試劑稱脫色劑。脫色劑或呈溶媒作用，如醇類、丙酮等；或能影響蛋白質(zhì)的電離程度，改變其電荷性質(zhì)或數(shù)量，因而影響細菌與染料的結合程度，如酸類能減少細菌的負電荷，故可作堿性染料的脫色劑。第10頁，共49頁，2022年，5月20日，23點41分，星期五6、復染：已經(jīng)脫色處理的細胞或其結構常以復染液作復染以便于觀察。復染液與初染液的顏色不同而成鮮明對比，所以復染也稱為對比染色。復染液不宜太強，以免掩蓋初染的顏色而失去對比作用。第11頁，共49頁，2022年，5月20日，23點41分，星期五常用染色法細菌的常用染色法有：單染色法、復染色法、特殊結構染色法、負染色法以及熒光染色法等。第12頁，共49頁，2022年，5月20日，23點41分，星期五（一）、單染色法：

單染色法是指用一種染料進行染色的方法。如用美蘭或稀釋石炭酸復紅等，使各種細菌均染成同一種單一的顏色。故此法只能顯示細菌的形態(tài)及大小，對細菌的鑒別價值不大。第13頁，共49頁，2022年，5月20日，23點41分，星期五（二）、復染色法：

復染色法是用二種以上染料進行染色的方法。此法除顯示細菌的形態(tài)、大小外，還有鑒別細菌種類的價值，因此也稱鑒別染色法。常用的鑒別染色法有革蘭氏染色法及抗酸染色法。第14頁，共49頁，2022年，5月20日，23點41分，星期五1、革蘭氏染色法（Gram’sStain）是最常用的鑒別染色法之一。此染色法是由丹麥細菌學家ChristianGram氏于1882～1884年發(fā)明的，至今已逾百年，仍在廣泛使用，是細菌學中最為經(jīng)典的染色方法。第15頁，共49頁，2022年，5月20日，23點41分，星期五（1）、革蘭氏染色的方法：第16頁，共49頁，2022年，5月20日，23點41分，星期五固定—→初染—→媒染—→脫色

（結晶紫或龍膽紫）（盧戈氏碘液）（95%酒精）—→復染

（稀釋復紅）第17頁，共49頁，2022年，5月20日，23點41分，星期五

固定初染媒染脫色復染

革蘭氏陽性菌，用符號“G+”或“GP”

（Gram’sPositive）表示。

革蘭氏陰性菌，用符號“Gˉ”或“GN”（Gram’sNegative）表示。

第18頁，共49頁，2022年，5月20日，23點41分，星期五第19頁，共49頁，2022年，5月20日，23點41分，星期五革蘭氏陽性葡萄球菌例子(金黃色葡萄球菌x1000)第20頁，共49頁，2022年，5月20日，23點41分，星期五革蘭氏陽性鏈球菌例子第21頁，共49頁，2022年，5月20日，23點41分，星期五革蘭氏陰性桿菌例子(大腸桿菌x1000)第22頁，共49頁，2022年，5月20日，23點41分，星期五革蘭氏陰性弧菌例子第23頁，共49頁，2022年，5月20日，23點41分，星期五革蘭氏陽性產(chǎn)芽孢桿菌例子第24頁，共49頁，2022年，5月20日，23點41分，星期五革蘭氏陽性短桿菌例子(李斯特菌x1000)第25頁，共49頁，2022年，5月20日，23點41分，星期五革蘭氏陰性彎曲菌例子第26頁，共49頁，2022年，5月20日，23點41分，星期五革蘭氏陽性棒狀桿菌例子第27頁，共49頁，2022年，5月20日，23點41分，星期五革蘭氏染色的結果與培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件、操作技術及菌齡等有密切的關系。培養(yǎng)基成分：在缺乏鎂鹽的培養(yǎng)基中，革蘭氏陽性菌可變?yōu)楦锾m氏陰性菌。培養(yǎng)條件：在酸性環(huán)境中細菌帶正電荷。操作技術：如涂片太厚影響酒精脫色，革蘭氏陰性菌則可染成革蘭氏陽性菌；脫色時倘酒精作用時間太長，革蘭氏陽性菌又會染成革蘭氏陰性菌。菌齡：菌齡也能影響染色的結果，這和細菌生長過程中核酸含量的改變有關。例如本是革蘭氏陽性的老齡菌，因核酸減少則常有許多菌細胞變?yōu)楦锾m氏陰性。第28頁，共49頁，2022年，5月20日，23點41分，星期五革蘭氏陽性菌細胞壁中肽聚糖含量較多，脂類較少，與95%酒精接觸后可迅速導致細胞壁脫水，通透性降低，使在細菌細胞內(nèi)著色的染料——結晶紫與碘的復合物不易透出，所以保留了紫色。而革蘭氏陰性菌細胞壁含肽聚糖較少、脂類較多，與95%酒精接觸后肽聚糖脫水不明顯，而脂類被酒精溶解后使細胞壁通透性增加，酒精易透入菌體內(nèi)溶解染料——碘復合物并使其透出，因而使紫色被洗脫后又被染成紅色。第29頁，共49頁，2022年，5月20日，23點41分，星期五3）、革蘭氏染色法的臨床意義①、鑒別細菌：該染色法可將細菌分為GP菌與GN菌兩大類，這樣可以初步識別細菌、縮小范圍，便于進一步鑒定。②、了解細菌與致病性的關系：大多數(shù)GP菌的致病物質(zhì)主要為外毒素；而大多數(shù)GN菌的致病物質(zhì)主要為內(nèi)毒素。通過革蘭氏染色，可了解細菌的致病物質(zhì)，從而做出相應的治療對策。第30頁，共49頁，2022年，5月20日，23點41分，星期五③、選擇抗菌藥物：GP菌和GN菌在細胞壁等結構上有很大差別，因而對抗菌藥物的敏感性不同。如大多數(shù)GP菌對青霉素、紅霉素、頭孢菌素等敏感；而大多數(shù)GN菌對這幾種抗生素不敏感，但對鏈霉素、氯霉素、慶大霉素、卡那霉素等敏感，故臨床上可根據(jù)病原菌的革蘭氏染色性，選擇有效的藥物進行治療。第31頁，共49頁，2022年，5月20日，23點41分，星期五2、

抗酸染色法有些細菌如結核桿菌、麻風桿菌等分枝桿菌，用一般染色法不易著色，必須使用強染色劑（如石炭酸復紅）并采用加熱和延長染色時間的方法才能使其著色。且一旦染上顏色后又不易被酸性酒精脫色。這種能夠抵抗酸性酒精脫色的細菌，稱為抗酸桿菌。應用這種原理進行染色的方法叫抗酸染色法?？顾崛旧ǔＳ玫挠休隆{二氏染色法和潘本漢氏染色法。第32頁，共49頁，2022年，5月20日，23點41分，星期五①染色的步驟：

直接涂片法第33頁，共49頁，2022年，5月20日，23點41分，星期五夾層杯液基集菌法：第34頁，共49頁，2022年，5月20日，23點41分，星期五固定——→初染——→脫色——→復染石炭酸復紅加熱3%鹽酸酒精呂氏美蘭第35頁，共49頁，2022年，5月20日，23點41分，星期五染色過程中的細菌顏色變化：抗酸桿菌非抗酸桿菌第36頁，共49頁，2022年，5月20日，23點41分，星期五第37頁，共49頁，2022年，5月20日，23點41分，星期五鏡檢與報告：

用光學顯微鏡鏡檢(目鏡10×，油鏡100×)染色痰片。在淡藍色背景下，抗酸桿菌呈紅色，其它細菌和細胞呈藍色。所見結果按下列標準報告：1)抗酸桿菌陰性：連續(xù)觀察300個不同視野，未發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌。

2)抗酸桿菌(1+)：1～9條抗酸桿菌／100視野。

3)抗酸桿菌(2+)：l一9條抗酸桿菌／10視野。

4)抗酸桿菌(3+)：1～9條抗酸桿菌／每個視野。

5)抗酸桿菌(4+)：≥10條抗酸桿菌／每個視野。第38頁，共49頁，2022年，5月20日，23點41分，星期五③

抗酸染色的意義：用以鑒別抗酸菌（如結核桿菌和麻風桿菌）和非抗酸菌。第39頁，共49頁，2022年，5月20日，23點41分，星期五（三）、特殊結構染色法細菌的某些基本結構如細胞壁、核質(zhì)、胞漿顆粒和特殊結構如莢膜、芽孢、鞭毛等，用普通染色法不易著色，須用一些特殊染色法才能染上顏色。特殊染色法主要有莢膜染色法、鞭毛染色法、芽孢染色法、異染顆粒染色法等。這些染色法不僅能使特殊結構著色，還可使特殊結構染成與菌體不同的顏色，有利于觀察和區(qū)別。第40頁，共49頁，2022年，5月20日，23點41分，星期五第41頁，共49頁，2022年，5月20日，23點41分，星期五第42頁，共49頁，2022年，5月20日，23點41分，星期五在細菌檢驗工作中，除異染顆粒染色法較常用外，由于其它特殊結構染色法操作費時，費用較高、染色過程要求非常嚴格，而普通染色法雖不能使特殊結構本身著色，但菌體著色后，莢膜和芽孢部分由于不著色也能顯示出來，再加上特殊染色法比較復雜，故日常工作中較少使用這些特殊結構染色法第43頁，共49頁，2022年，5月20日，23點41分，星期五第44頁，共49頁，2022年，5月20日，23點41分，星期五第45頁，共49頁，2022年，5月20日，23點41分，星期五（四）、負染色法

所謂負染色法是指使背景著色而細菌本身不著色的一種染色方法。常用的有墨汁染色法。也可用酸性染料如剛果紅或水溶性苯胺黑等進行染色。因酸性染料帶負電荷，而細菌本身在近乎中性的環(huán)境中也帶負電荷，同種電荷相排斥，故染色時菌體不著色，