瘧原蟲的鏡檢技術(shù)課件

瘧原蟲的RDT檢測(cè)

及鏡檢技術(shù)豐城市疾病預(yù)防控制中心

檢驗(yàn)科：黃曾

2014-7-15瘧疾的實(shí)驗(yàn)室診斷1.病原學(xué)診斷：顯微鏡血涂片檢查結(jié)果陽性；這種鏡檢確診最可靠。2.免疫學(xué)診斷：（1）循環(huán)抗原的檢測(cè)（2）循環(huán)抗體的檢測(cè)3.分子生物學(xué)技術(shù)：PCR和DNA探針已應(yīng)用與瘧疾的診斷。

分子生物學(xué)、血清學(xué)技術(shù)發(fā)展迅猛，但是確診瘧疾的“金標(biāo)準(zhǔn)”

仍然是病原學(xué)診斷顯微鏡檢查瘧原蟲?！?/p>

快速診斷試紙條可與鏡檢瘧原蟲相互補(bǔ)充。

瘧原蟲抗原檢測(cè)（一）原理快速檢測(cè)試劑是通過在硝酸纖維素膜（NC）試紙條上產(chǎn)生可見的條帶來檢測(cè)抗原的一種“免疫-層析”試劑。染色標(biāo)記抗體與瘧原蟲抗原結(jié)合，復(fù)合物由試劑條檢測(cè)線上的抗體捕獲后，形成一條可見的條帶（檢測(cè)線）。檢測(cè)的第一步是將溶血?jiǎng)┡c血液混合，破壞血紅細(xì)胞釋放瘧原蟲蛋白，便于與標(biāo)記抗體靶蛋白結(jié)合；然后將血液與標(biāo)記抗體的混合液置于硝酸纖維試紙條上，并通過毛細(xì)管作用和緩沖液/清洗劑推力，使混合液在試紙條上移動(dòng)并通過檢測(cè)線與對(duì)照線。4.將吸血后的毛細(xì)管豎立于凹槽2中，捏出全部血液并與凹槽中稀釋液混勻約1分鐘。血膜的制作（取血時(shí)間）采血時(shí)間現(xiàn)癥病人和流調(diào)普查時(shí)可不考慮取血時(shí)機(jī)。但在診斷或需要某期瘧原蟲作標(biāo)本時(shí)，則應(yīng)掌握適宜的取血時(shí)機(jī)。瘧疾典型的臨床表現(xiàn)分前驅(qū)期、發(fā)冷（寒戰(zhàn)）期、發(fā)熱期、出汗期和間歇期五期。

間日瘧在前驅(qū)期相當(dāng)于肝內(nèi)期瘧原蟲發(fā)育，因原蟲密度太低，鏡檢多為陰性。發(fā)冷（寒戰(zhàn)）期相當(dāng)于紅內(nèi)期成熟裂殖體漲破紅細(xì)胞期，鏡檢多為裂殖體和環(huán)狀體。發(fā)熱期，外周血中以環(huán)狀體（小滋養(yǎng)體）為主，也可見到裂殖體；出汗期因原蟲密度太低，鏡檢多為陰性。發(fā)作后數(shù)小時(shí)（h），間歇期外周血中以大滋養(yǎng)體為主，形態(tài)較易辯認(rèn)，為診斷的有利時(shí)機(jī)；發(fā)作36-48h，可檢出裂殖體；發(fā)作1-2次后，配子體出現(xiàn)較多。惡性瘧較理想的取血時(shí)間是在發(fā)作后至20h內(nèi)取血，初發(fā)患者退熱后常查不到原蟲。末梢血血檢到惡性瘧原蟲配子體，是在末梢血出現(xiàn)環(huán)狀體之后的10天左右。取血部位和血量采血部位和取血方法：耳垂或無名指（嬰幼兒母趾或足跟），通常在耳垂取血，先用75%酒精棉球消毒取血部位，待酒精干后，用左手拇指和食指緊捏耳垂上方或無名指指尖，右手持消毒針迅速刺入皮膚，不宜過深或過淺。然后用右手中指輕輕擠壓出血。厚血膜血量約一粒大米（即火柴頭）大小。

血膜的制作（涂片操作）涂制厚、薄血膜的位置通常將厚、薄血膜涂在一張載玻片上。方法是將載片分為6等分，第1、2格備貼標(biāo)簽及編號(hào)用；厚血膜涂在第3格中央，薄血膜涂在第4格前緣至第6格中部。作為標(biāo)本的血片每張玻片涂厚、薄血膜各1個(gè)；門診和發(fā)熱病人血片每片1人，涂2個(gè)厚血膜1個(gè)薄血膜，以防血膜脫落而影響檢查；

標(biāo)本片發(fā)熱病人血片標(biāo)簽熟練工作者的推片姿勢(shì)厚血膜的制作厚血膜

用推片的左下角，從取血部位刮?、偌s4～5微升血量（相當(dāng)于火柴頭大?。?，使血滴與平置的載玻片接觸，再由里向外一個(gè)方向旋轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)2～4圈，涂成②直徑0.8～1cm大小圓形厚血膜(厚血膜的厚度以一個(gè)油鏡視野內(nèi)可見到5～10個(gè)自細(xì)胞為宜)，③厚血膜的位置，位于玻片右1/3處[中央偏右（或6等份中的與貼標(biāo)簽的1、2份相鄰的第3份中部）]

。④厚血膜外觀：圓形厚薄均勻，無劃痕。過厚易于脫落，過薄達(dá)不到檢出率的要求，以油鏡視野5-10個(gè)WBC為宜。標(biāo)準(zhǔn)的瘧疾厚薄血膜位置各種不同的瘧疾血片涂制法：標(biāo)準(zhǔn)血片（1人）門診發(fā)熱病人血片（1人）居民普查血片（2人）血膜的制作血膜編號(hào)

血膜制成后，立即在玻片面上寫上受檢者的號(hào)碼，以防差錯(cuò)；待薄血膜干后再用鉛筆于薄血膜中寫上血片種類的代號(hào)和受檢者的個(gè)人編號(hào)，依次順序插入標(biāo)本盒內(nèi)。染液的種類及染色原理注意：蛋白質(zhì)和氨基酸都是兩性電解質(zhì)，要求染液的pH值7.0-7.2較好。

染液偏酸時(shí)，所帶的正電荷增加，易于伊紅結(jié)合，使紅細(xì)胞和瘧原蟲的核染成鮮紅色，而淋巴細(xì)胞和原蟲的胞漿著色較差；反之，當(dāng)染液偏堿時(shí)，紅細(xì)胞和嗜伊紅白細(xì)胞的顆粒等被染成紫藍(lán)色，不易觀察。姬氏染液母液配置方法

取姬氏粉0.5克置于研缽中，加25ml甘油充分研磨，倒入60或100ml帶有玻塞的有色玻瓶中。在研缽中加少量甲醇，洗去甘油濃液混入瓶?jī)?nèi)，至25ml甲醇洗凈缽中甘油染液為止，塞緊瓶塞，充分搖勻，置于55—60℃水浴中或溫箱內(nèi)24h或室溫內(nèi)3—5天，多加搖動(dòng)，即成原液。姬氏染液是目前較優(yōu)良的血膜染劑，即使在炎熱天氣中，亦可經(jīng)久不變。材料：1、姬氏粉0.5克2、甘油25ml3、甲醇25ml

注意事項(xiàng)：1.高純度試劑。2.所用器皿絕對(duì)無水（伊紅在水溶液內(nèi)遇到美藍(lán)或天青即可互相化合而產(chǎn)生沉淀，從而失去染色力）。3.邊加邊磨，充分研磨；整個(gè)染色液配制時(shí)間不能少于5個(gè)小時(shí)。

操作1（快染）

配制5%染液，（每張血片約需染液2ml）：量筒內(nèi)量2ml緩沖液或新鮮涼開水，直接滴加吉氏原液7滴，混勻，滴入待染標(biāo)本的厚薄血膜上，染色10min，清水細(xì)緩沖洗，晾干鏡檢。（一般配制5%-10%，染色時(shí)間短，一定掌握好時(shí)間。）操作2(慢染)配制3%染液：在染色量筒內(nèi)量2ml蒸餾水或新鮮涼開水，再滴加吉氏原液4滴，混勻，滴入待染標(biāo)本上，染色30~40min。清水細(xì)緩沖洗，晾干鏡檢。（一般配制2.5%-3%染液，染色效果穩(wěn)定。）吉氏染液濃度門診染色血片制作與染色注意事項(xiàng)

●使用前載玻片一定要清潔，否則會(huì)影響血片制作和鏡檢結(jié)果?！窈裱じ稍飼r(shí)勿加熱，加熱會(huì)使原蟲變形，影響鏡檢結(jié)果?！衽渲媚敢簳r(shí)過濾可除去雜質(zhì)顆粒，有助于提高鏡檢質(zhì)量。●固定薄血膜時(shí)勿將甲醇觸碰到厚血膜?！駴_洗染液時(shí)，水流輕緩，勿沖走厚血膜。薄血膜中常見的血液成分中性粒細(xì)胞嗜酸性粒細(xì)胞血小板單核細(xì)胞淋巴細(xì)胞紅細(xì)胞薄血膜瘧原蟲形態(tài)間日瘧環(huán)狀體感染的紅細(xì)胞：脹大不明顯，基本正常。蟲體大?。狠^大，約為紅細(xì)胞直徑1/3。胞漿：環(huán)狀，淺藍(lán)色。核：紅色，一個(gè)，偶有二個(gè)。瘧色素：無。

約占寄生紅細(xì)胞的1/3，很少見到一個(gè)紅細(xì)胞寄生2個(gè)環(huán)狀體和一個(gè)環(huán)狀體有2個(gè)核。薄血膜瘧原蟲形態(tài)

惡性瘧環(huán)狀體感染的紅細(xì)胞：大小正常,顏色較深。蟲體大?。狠^小，約為紅細(xì)胞直徑1/5-1/6。胞漿：藍(lán)色，環(huán)狀纖細(xì),有時(shí)位于紅細(xì)胞的邊緣。常見多個(gè)原蟲同寄生于一紅細(xì)胞的現(xiàn)象。核：紅色一個(gè),常有二個(gè)。瘧色素：無。惡性瘧原蟲--環(huán)狀體環(huán)纖細(xì),約為RBC直徑的1/6，RBC不脹大核1個(gè)，但2個(gè)常見，紅細(xì)胞常含2個(gè)以上原蟲薄血膜間日瘧大滋養(yǎng)體形態(tài)感染的紅細(xì)胞：脹大褪色，出現(xiàn)形狀大小相等、分布均勻、數(shù)目較多、鮮紅色的薛氏小點(diǎn)。蟲體大小：較大。胞漿：不規(guī)則，淺藍(lán)色，出現(xiàn)阿米巴偽足，有空泡。核：紅色，一個(gè)。瘧色素：有，細(xì)小桿狀，黃褐色，分布不均勻。間日瘧大滋養(yǎng)體

蟲體不規(guī)則，較大；阿米巴樣空泡明顯；瘧色素細(xì)小，黃褐色。

間日瘧大滋養(yǎng)體惡性瘧大滋養(yǎng)體受感染紅細(xì)胞：大小正常，顏色較深，可出現(xiàn)較粗、大小不一、分布不勻、數(shù)目較少紅色茂氏小點(diǎn)。蟲體大?。狠^小。胞漿：藍(lán)色，圓形，堅(jiān)實(shí)，體積小。核：一個(gè)，紅色。瘧色素：較細(xì)的黑褐色顆粒，常集成塊。

惡性瘧大滋養(yǎng)體紅細(xì)胞：脹大，褪色，可有薛氏小點(diǎn)。胞漿：較不規(guī)則，空泡小或消失，淺藍(lán)色。核：紅色，分裂為二個(gè)以上。色素：黃褐色，分布不均勻。間日瘧未成熟裂殖體薄血膜瘧原蟲形態(tài)間日瘧未成熟裂殖體

惡性瘧未成熟裂殖體紅細(xì)胞：大小正常，顏色較深，可有茂氏小點(diǎn)。大?。狠^小。胞漿：規(guī)則，圓形或卵圓形，藍(lán)色。核：分裂為二個(gè)以上，紅色。色素：黃褐色顆粒，常集成黑褐色團(tuán)塊。間日瘧成熟裂殖體紅細(xì)胞：脹大，褪色，可見薛氏小點(diǎn)。大?。簜€(gè)體較大。胞漿和核：裂殖子12~24個(gè)，通常為16~18個(gè)，排列不規(guī)則，核紅色，胞漿淺藍(lán)色。瘧色素：黃褐色，常集于瘧原蟲的一邊。間日瘧裂殖體惡性瘧成熟裂殖體紅細(xì)胞：大小正常，顏色較深，可見茂氏小點(diǎn)。大小：蟲體較小。胞漿和核：裂殖子8~32個(gè)，通常為8~18個(gè)，排列不規(guī)則，核紅色，胞漿藍(lán)色。色素：黑褐色，集中于中央或一側(cè)。惡性瘧成熟裂殖體

裂殖子8～32個(gè)，通常8～18個(gè)，排列不規(guī)則瘧色素集中成團(tuán)塊狀蟲體占紅細(xì)胞體積的2/3至3/4薄血膜間日瘧雌（大）配子體形態(tài)形狀大?。簣A形或橢圓形，較大。胞漿：深藍(lán)色。核：一個(gè)，較小，深紅色，常偏于一邊，核周可見明顯不染色帶。瘧色素：黃褐色，均勻散在，數(shù)目較多。間日瘧原蟲雌配子體

間日瘧雄（?。┡渥芋w形態(tài)形狀大?。簣A形，蟲體較大。胞漿：淺藍(lán)色。核：一個(gè)，較大，疏松，位于中央，淺紅色，周圍有明顯不著色帶。瘧色素：黃褐色，散在分布。間日瘧原蟲雄配子體惡性瘧雌（大）配子體形態(tài)形狀：新月形，兩端稍尖。胞漿：深藍(lán)色。核：一個(gè)，較小，致密，深紅色，位于中央，核周可見透明不染色帶。瘧色素：黑褐色，密布于核的周圍。薄血膜惡性瘧雄（小）配子體形態(tài)形狀：臘腸形，兩端鈍圓。胞漿：淺藍(lán)色或淡紫紅色。核：一個(gè)，較大，疏松，位于中央，淺紅色，核周可見不染色帶。瘧色素：黑褐色，松散分布于核周圍。將（未）成熟雌配子體與成熟大滋養(yǎng)體

(核分裂前，剛要進(jìn)入裂殖體前期)的形態(tài)鑒別蟲體大小:幾乎充滿被寄生的紅細(xì)胞核:一個(gè)，較大且致密，周圍有一圈空白的不染色帶胞漿:邊緣清楚，不含空泡瘧色素:顆粒較多較粗，均勻散在蟲體大小:不超過被寄生紅細(xì)胞的3/4核:一個(gè)，延長(zhǎng)呈帶狀，周圍無明顯的不染色帶胞漿:邊緣不整齊，多有空泡瘧色素:顆粒較少較細(xì)，分布不均勻看完血片后，若為陽性，應(yīng)立即按血片編號(hào)登記原蟲的種、期，以防差錯(cuò)。為檢查后記錄結(jié)果方便起見，對(duì)瘧原蟲的種、期可使用英文字母縮寫作為代號(hào)：間日瘧：P．v(Plasmodiumvivax)惡性瘧：P．f(P．falciparum)三日瘧：P．m(P．malarae)