尋找更佳的蛋白質(zhì)工程策略

尋找更佳的蛋白質(zhì)工程策略RomasJKazlauskas&UweTBornscheuer摘要:如今的蛋白質(zhì)改進策略涉及多種不同的隨機誘變與篩選方法與合理設(shè)計的結(jié)合。為了取得進一步的進展，即讓后續(xù)的蛋白質(zhì)工程問題更易于解決，蛋白質(zhì)工程師們必須以鉆研的眼光來比對這些策略并將其中效率較低的剔除。蛋白質(zhì)工程描述了改變現(xiàn)存蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)使其性能改善的過程。這是一項重要的增進我們對蛋白質(zhì)如何活動及其進化史基本認識的技術(shù)，也是提高酶在制藥，綠色化學(xué)和生物燃料應(yīng)用方面性能的關(guān)鍵方法。蛋白質(zhì)工程已經(jīng)早就很多工業(yè)上的成果。由Genencor（來自美國加利福尼亞州南舊金山）設(shè)計的蛋白酶可以耐受洗衣粉中的漂白劑并幫助我們清洗衣物。Codexis（來自美國加利福尼亞州紅木市）因為合成作為醫(yī)藥中間體的酶的工程而獲得了2006年的綠色化學(xué)獎。Verenium（來自美國馬薩諸塞州劍橋）設(shè)計了能幫助原油采收和纖維素乙醇制造的酶。Metabolix（來自美國馬薩諸塞州劍橋）開發(fā)了多元酯類的生物合成酶。在蛋白質(zhì)工程的進程中，有幾點必須預(yù)先計劃進策略。即找尋某一能帶來益處的個體或選擇一個特定的策略來解決某一非常清楚的特定問題。然而，總體格局也許不那么簡單?，F(xiàn)今的蛋白質(zhì)工程策略之間大相徑庭并且其依靠的設(shè)想時有矛盾。采取不同策略的部分原因僅僅是為了繞開蛋白質(zhì)工程專利，不過很大一部分歸結(jié)于方法之間比較研究的缺失。做這樣一個比較能夠促進未來的蛋白質(zhì)工程發(fā)展，就像人們能夠從成功與失敗中汲取教訓(xùn)一樣。兩代以前，有機合成中面臨著類似的問題。通過鑒賞分子結(jié)構(gòu)與構(gòu)象分析以及利用定量的方法來研究反應(yīng)，在有機化學(xué)中可以合成復(fù)雜的分子。不過有機合成并不系統(tǒng)，在對待綜合問題上也沒有一個總體策略。這些問題以合成天然產(chǎn)物為目標(biāo)。此類目標(biāo)所引入的精確性在于需要獲得的不僅僅是任何復(fù)雜分子，更是那些可以在自然中發(fā)現(xiàn)的化合物。這些合成方面的努力和相關(guān)方法的發(fā)展使我們對有機合成原理產(chǎn)生了有系統(tǒng)，有組織的理解。例如，Woodward和Eschenmoser的維生素B12合成給出了新的合成策略組合，關(guān)于生源論的假設(shè)以及軌道對稱守恒原理。這些思路的發(fā)展使得后續(xù)復(fù)雜的合成變得更加簡單而有效。在這篇評論中，我們的意見是——是時候從總體上思考蛋白質(zhì)工程了。同時，我們提出兩項建議來推動此領(lǐng)域的發(fā)展。作者信息：RomasJ.Kazlauskas供職于美利堅合眾國，明尼蘇達州圣保羅市，明尼蘇達大學(xué)生物技術(shù)研究所，生物化學(xué)，分子生物學(xué)和生物物理學(xué)系；UweT.Bornscheuer供職于德意志聯(lián)邦共和國格賴夫斯瓦爾德市，格賴夫斯瓦爾德大學(xué)，生物化學(xué)研究所生物技術(shù)與酶催化系電子郵件地址rjk@或uwe.bornscheuer@uni-greifswald.de

圖一蛋白質(zhì)工程方法隨酶改變程度不同與合理設(shè)計可用之信息量的多寡而大相徑庭。圖中的ProSAR為蛋白質(zhì)構(gòu)效關(guān)系，3D指三維，QM\MM分別指量子力學(xué)和分子力學(xué)。始為域互換同源重組含的變?量改增翊或:成少環(huán)藪同時多個或

連續(xù)時替換增減氨基酸同譜化鐺配PCR技術(shù)氨基酸序列同源模型機理及動力學(xué)結(jié)合過渡態(tài)類似過渡態(tài)的QMWIM物的3D結(jié)構(gòu)模型（包括動態(tài)）所需的信息量A含的變?量改增翊或:成少環(huán)藪同時多個或

連續(xù)時替換增減氨基酸同譜化現(xiàn)今的策略蛋白質(zhì)工程包含三步：選擇蛋白質(zhì)的變化方式（即設(shè)計策略，如合理設(shè)計還是隨機化），實現(xiàn)這些變化（突變形成），并評估這些變異蛋白的改進性能（過篩并挑選）。在其中的每一步，選擇不同的策略能導(dǎo)致不同的優(yōu)缺點。例如，存在著一個折衷的方案決定致力于合理設(shè)計還是篩選。極端情況下，對一已透徹了解的酶，始于X射線晶體結(jié)構(gòu)的合理設(shè)計能促進對某些氨基酸替換的限制性篩選。通過使底物結(jié)合部位的按需放縮，此法已提升了磷酸三酯酶的對映選擇性。在另一極端，強有力的篩選方法可以完全排除合理設(shè)計的步驟。通過選擇，已經(jīng)從一個完全隨機，但數(shù)量巨大（多達1013個變體）的庫中鑒定出具有RNA連接酶活性的蛋白變體。下文中，我們重點關(guān)注如今使用的一些主要考慮對象與策略。（另見專欄1）選擇最佳的氨基酸替換位點創(chuàng)建變異蛋白通常包含單個氨基酸的取代，同樣也包括插入額外氨基酸，刪除氨基酸以及改變末端位置（環(huán)狀排列）。這些變化可以針對整個蛋白或是最有希望產(chǎn)生改進的部位。

一個常見的蛋白質(zhì)工程目標(biāo)是提高酶的熱穩(wěn)定性?；诮Y(jié)構(gòu)的方法有一個基本假設(shè)就是：更為剛性的酶在高溫下具有更好的穩(wěn)定性。酶的X射線品體結(jié)構(gòu)被用來設(shè)計特定的使酶穩(wěn)定的作用結(jié)構(gòu)諸如二硫鍵或鹽橋，通過引進脯氨酸和去除甘氨酸來穩(wěn)定環(huán)狀區(qū)域或通過B一因子實驗確定目標(biāo)蛋白的最具可塑性區(qū)域并在此集中誘發(fā)突變?；谶M化與生物信息學(xué)的方法的基本假設(shè)是：保守的氨基酸最有助于穩(wěn)定。設(shè)計策略是對相關(guān)序列進行比較并調(diào)節(jié)目標(biāo)蛋白至相似的共有序列。（每個位點上出現(xiàn)頻率最高的氨基酸）專欄1成功的蛋白質(zhì)工程所需方法與畛摘要最隹方法的14擇?［決于諸如信息強度（三堆給構(gòu)已知）,誘變方法，舞查與14擇工具的范圍.蛋白麋工程師們用了許多不同策庵來馥進，其中起碼大部分最終能產(chǎn)出改良產(chǎn)物"變化位置結(jié)構(gòu)類型的變化?整個蛋白?替換（最常見）:?選定區(qū)域■?剔除或插入皆活性部位,環(huán)映排列在可塑部位,同源重組基于結(jié)構(gòu)建模確定的位點舜選方法基于序列比對確定的位點?選擇培養(yǎng)（最大犀）誘變方莎?昌通量篩選?直先穩(wěn)定蛋白質(zhì)？-.,底物類似而或真實底物?單一替換?真實反應(yīng)條件或簡化之篩選條件錯配PCR飽和誘變限制性氨基酸替換基因漂變庫?徹底篩查或基于庫的部分篩查?多重替換通過基因合成添加特殊變化氨基酸替換的逐步累積取多部位同時誘變幾部也同時誘變并重復(fù)數(shù)次選擇如何引入氨基酸替換一旦變換的位置確定，研究者們將選擇如何引入單一替換，抑或更可能的多重替換。對單一替換來說，研究者們可以利用位點飽和誘變或是錯配PCR技術(shù)。位點飽和誘變將使選定位置替換成所有十九個可能的氨基酸。而錯配PCR傾向于替換平均數(shù)僅為六個的可能氨基酸。許多突變需要更換密碼子中的兩個核苷酸，不太可能使用錯配PCR。其基本假設(shè)是，要么只有幾個解決方案存在（在這種情況下應(yīng)該選擇一個更完整的庫），或者存在許多解決方案（在這種情況下，應(yīng)該選擇一個不完整的，但更易于制造的庫）。舉例，Carretal利用細菌的突變株（類似于錯配PCR）來尋找具有更高對映選擇性的胺氧化酶變體。另一例，DeSantis和同事利用位點飽和誘變來尋找對阿托伐他?。⑵胀祝冀笛帯担┑暮铣芍虚g體有著更高對映選擇性的腈水解酶的變體。變體包含一個A190H替代，這需要兩個密碼子堿基變化一一從丙氨酸的GCN密碼子變?yōu)榻M氨酸的CA[T/C]密碼子——將可能無法使用錯配PCR技術(shù)。氨基酸的多重替換引入了額外的選擇。階梯式的逐步替換將錯過任何協(xié)助互動，同時能創(chuàng)建一個其中大部分變體不活躍的呈幕級增大的庫。Arnold和同事們偏愛單一氨基酸替換的階梯式累積，因為這和自然演化機制更相像。每一步鑒定出的變體都比前一個更好一些。這種方法假設(shè)在每階段都至少有一條通路去改進。對5個位點的氨基酸替換，有120條可能的路徑。Weinreich和同事們嘗試了所有120條路徑來尋找一種改進型的P-內(nèi)酰胺酶，然后發(fā)現(xiàn)在每個階段僅有18條路徑改善了對P-內(nèi)酰胺的抗性。同樣的，在每一步僅有8條路徑增加了一種環(huán)氧化物水解酶的對映選擇性（如果包含一個中性突變的化將有55條路徑）。這些測試中得出的悲觀結(jié)論是：在每一步選擇最好的單一突變的結(jié)果是很有可能走入死胡同。樂觀結(jié)論是：有相當(dāng)多的路徑通往某個特殊變體，所以在每階段選擇幾個突變，我們將得到最好的五個替換氨基酸。使幾個位點同時突變的理由是為了避免走入死胡同和尋找協(xié)同效應(yīng)，并非在于更高的篩選成本。例如，Whittle和Shanklin在去飽和酶的活性部位的六個位點同時替換（理論上可能變種數(shù)達108）。為了篩查如此大數(shù)目的變種，他們使用了只有那些底物特異性發(fā)生改變了的變種才能生長的基質(zhì)。臨近氨基酸間協(xié)同作用更易于產(chǎn)生，因此聯(lián)合活性部位飽和測試（CASTing）是條捷徑。它選擇在線性序列上相近的兩個氨基酸，只需一個誘變引物。這種同時突變法將環(huán)氧化物酶的對映選擇性從4.6增加到了115,而使用錯配PCR的單一突變法僅僅將其增加到了7.4。這兩種方法均需篩選達20000種的變種。另一個處理同時突變的途徑是通過消除重復(fù)的密碼子來降低庫的大小。大多數(shù)飽和突變使用NNK（N指A、T、G或C，K指G或T）的密碼子，這將產(chǎn)生32種可能的密碼子編碼20種氨基酸，其中12個密碼子是重復(fù)的。當(dāng)三個氨基酸同時突變，按NNK的排布可以列出32768個密碼子，不過僅有8000個不同的蛋白質(zhì)。其中一種可能是NDT序列（D代表G，A或T），將生成編碼12個不同氨基酸的12個密碼子。三點同時突變能列出1728種可能的蛋白質(zhì)類型或者說變異密碼子。這種方法消除了重復(fù)，但省略了八種可替換用氨基酸。從每個庫中篩選同一個環(huán)氧化物水解酶的轉(zhuǎn)化體5000個（NNK庫的不完全篩選，NDT庫的完全篩選），發(fā)現(xiàn)在每個庫中都具有對映選擇性＞100的變體。另一種降低庫的大小的途徑是剔除折疊或不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)。做此類排除的一個策略是模仿第二個主要的生物進化機制：遺傳漂變。遺傳漂變指的是維持正常的前提下隨機變化的積累。中性突變庫是保持原有功能的變種集合。Arnold和Tawfik兩組均為P450單加氧酶系和對氧磷酶系創(chuàng)建了此庫。通過篩選這些更小的庫，他們發(fā)現(xiàn)了諸如底物范圍擴大或活性輕微增加的新性能。此方法依托的假設(shè)是：多重替換的大多數(shù)變種是不穩(wěn)定的。通過篩選這些維持了原有功能的蛋白質(zhì)，可以確保它們?nèi)匀徽_折疊。第三種處理這些多重替換帶來的數(shù)目極大的變種的方法是一種叫做ProSAR的統(tǒng)計方法，即蛋白質(zhì)構(gòu)效關(guān)系。這種方法與生物進化間沒有對應(yīng)，它并不直接發(fā)現(xiàn)“擊球點”，而是找到氨基酸替換對功能改進的貢獻。蛋白質(zhì)變體平均包含十個替換點，而許多變體具相同的替換點。即使某個特定變異性能差，與其他具有相同替換的變種的統(tǒng)計對比會顯示出此突變有益與否。在下一輪過程中結(jié)合有益突變，除去有害突變并進行更多的替換測試。這種方法特別適用于快速引入數(shù)個替換點。運用這種方法，Codexis小組設(shè)計了一種用來合成阿托伐他汀側(cè)鏈的鹵代醇脫鹵素酶，他們替換了35個氨基酸，使酶擁有了4000倍于之前的生產(chǎn)能力的同時無損于它的立體選擇性。選擇篩查策略篩查策略種類非常廣泛。其中一些涉及耗時的篩選程序比如產(chǎn)業(yè)條件下的合成，且只能篩查10到100個變種。反之高通量篩選方法諸如熒光激活細胞分選可以篩查上億，數(shù)十億或更多的變種。很明顯，如果可以只篩查一小部分，那就沒有理由創(chuàng)建一個龐大的庫。因此，有時會發(fā)生的情況是：由于缺乏合適的篩選或選擇策略，研究人員只能測試極少數(shù)突變體，并為此錯過最佳的解決方案。哪種策略最棒？我們認為，能花最少力氣達成目標(biāo)的方法才是最棒的蛋白質(zhì)工程策略。此標(biāo)準(zhǔn)顯示純粹的合理設(shè)計或純粹的隨機突變均非最佳選擇。在選定位點替換所有19個可能氨基酸并進行篩選的工作量通常小于通過合理計算推出哪個氨基酸最佳。反之，蛋白的可能結(jié)構(gòu)變化數(shù)是個天文數(shù)字，因此隨機突變法也需要限制變化數(shù)量的策略。一個尚未解決的挑戰(zhàn)是這些新的催化反應(yīng)很少足夠有效率到能進行實際應(yīng)用。不過到底在我們的理解中缺少了什么才使得催化活動程度無法繼續(xù)增加尚不得而知。如此，第二個最佳策略標(biāo)準(zhǔn)是選擇那些幫助我們更快達到下一個目標(biāo)的策略，也即我們能從中學(xué)到東西的策略。例如，使用錯配PCR來使蛋白變異引入了一個或兩個氨基酸的替換。經(jīng)篩查找出改進變體后，變異位點的位置（即“熱點”）便暗示了進一步努力的方向在何處。額外的計算機模擬可能會就改善的運作方式產(chǎn)生一個工作假設(shè)，相比之下，利用DNA改組使蛋白變異將創(chuàng)建含有不同的起始蛋白片段的蛋白質(zhì)碎片。盡管通過篩查辨認出了這些變體中的那些具有改進性能，這些變體也是如此多變以至于很難剖析改進為何產(chǎn)生以及下一步如何做。這種差異是為何錯配PCR繼續(xù)在蛋白質(zhì)工程中被廣泛應(yīng)用而DNA改組不是的原因之一。鑒別最佳的蛋白質(zhì)工程策略將幫助整個領(lǐng)域從兩條途徑向前發(fā)展。首先，它將使蛋白質(zhì)工程加速。上述策略均經(jīng)論證是成功的，倘若有許多解決辦法，使用任何策略最終都將達到目的。那么究竟哪些戰(zhàn)略能找到更好的解決方案，或者用更少的努力找到同樣的解決方案呢？批判性的比較策略將允許蛋白質(zhì)工程師確定需要最小努力的方法。第二種鑒別最佳策略的途徑是測試每個策略的基本假設(shè)。每種策略都有關(guān)于蛋白質(zhì)如何折疊，進化和催化反應(yīng)的假設(shè)。這些假設(shè)中的每一個都有一兩項的成功支持，而在蛋白質(zhì)工程中更廣泛地使用它們可以測試出哪些是更普遍真實的，哪些是最重要的。在給出了改善某個酶的實際目標(biāo)后，更多的研究者將精力集中在達成目標(biāo)而非測試各種方法的基礎(chǔ)假設(shè)上。對蛋白質(zhì)工程的提議為了在蛋白質(zhì)工程中取得更快進展，該領(lǐng)域需要對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)如何影響蛋白質(zhì)性質(zhì)有更好地理解并對許多蛋白質(zhì)工程方法進行更具批判性的評價。兩件事阻礙了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能間的關(guān)聯(lián)。首先，許多實驗涉及蛋白質(zhì)的多重替換，這隱藏了成功的原因。最終導(dǎo)致——這也是影響此領(lǐng)域成長的主要障礙一一下一個問題沒那么容易解決?？紤]到這些問題，我們提出兩個建議：所有蛋白質(zhì)工程方面的成功范例應(yīng)當(dāng)附有一份具有實驗支持的，有關(guān)成功的分子基礎(chǔ)方面的假說。新范例和新假設(shè)的累積將使后續(xù)的蛋白質(zhì)工程問題更加簡單。所有的蛋白質(zhì)工程方法應(yīng)被徹底評估和相對于其他方法進行定量比較。為了報告一個新成果，作者們應(yīng)當(dāng)定期提供包含改進性能變體比例以及這些改進的重要程度的信息。理論庫，實驗庫與被篩選的庫比例究竟有多大？所有這些相對于其他方法的對比情況怎樣？這些情況應(yīng)與同一實驗室中相同的問題比較，而不是依賴于文獻報道。計算方法也應(yīng)包含類似比較。下一步怎么走在未來，蛋白質(zhì)工程將隨著其原則的建立而邁向向合理設(shè)計。今日，有機合成仍充滿挑戰(zhàn)，不過規(guī)則已然確立——例如首先構(gòu)建碳框架，其次是在所有點控制立體化學(xué)結(jié)構(gòu)的操作功能組。化學(xué)家們知道在連續(xù)合成前使用匯集合成，并在可能的情況下避免保護基。確定哪些蛋白質(zhì)工程策略是最好的，以及突變?yōu)楹喂ぷ髂苁沟鞍踪|(zhì)工程加速發(fā)展。如果我們比較這些策略，未來的解決方案將更省力。某一策略占上風(fēng)似不可能，因為每個問題的目標(biāo)，可用信息量和蛋白質(zhì)的細節(jié)均不同。盡管如此，某些策略將會比其他的更好。比較還將確立蛋白質(zhì)工程的原則并加強我們對酶工作情況的理解。這一理解將使合理設(shè)計更加可靠，并加快通向解決方案的步伐。致謝U.T.B.和R.J.K.分別感謝德國研究基金會(DFG,theGermanResearchFoundation，地址GrantBo1862/4-1)和美國國家科學(xué)基金會(theUSNationalScienceFoundation,CHE-0616560)的經(jīng)濟支持。參考文獻Lutz,S.&Bornscheuer,U.T.(eds.).ProteinEngineeringHandbook(Wiley-VCH,Weinheim,2009).Estell,D.A.,Graycar,T.P.&Wells,J.A.J.Biol.Chem.260,6518-6521(1985).Fox,R.J.etal.Nat.Biotechnol.25,338-344(2007).Gray,K.A.,Zhao,L.&Emptage,M.Curr.Opin.Chem.Biol.10,141-146(2006).McCarthy,A.Chem.Biol.10,893-894(2003).Eschenmoser,A.&Wintner,C.E.Science196,1410-1420(1977).Woodward,R.B.PureAppl.Chem.33,145-177(1973).Chen-Goodspeed,M.,Sogorb,M.A.,Wu,F.&Raushel,F.M.Biochemistry40,1332-1339(2001).Seelig,B.&Szostak,J.W.Nature448,828-831(2007).Qian,Z.&Lutz,S.J.Am.Chem.Soc.127,13466-13467(2005).Morley,K.L.&Kazlauskas,R.J.T