有機(jī)溶劑沉淀法制備大豆脲酶

3/3實(shí)驗(yàn)三有機(jī)溶劑積淀法制備大豆脲酶一、實(shí)驗(yàn)原理脲酶（）廣泛存在于微生物和動、植物組織中，1926年，SumnerJ曾用32％的丙酮溶液從刀豆粉中提取脲酶，并獲得了卻晶。該酶相對分子質(zhì)量為483000，由6個亞基組成，等電點(diǎn)4.9,溶于水和稀緩沖液，粗酶較牢固，純酶不太牢固，結(jié)晶酶在低溫下可牢固1年以上。本實(shí)驗(yàn)用乙醇或丙酮從大豆種子中提取脲酶，并用有機(jī)溶劑和等電點(diǎn)結(jié)合法制備該酶。二、實(shí)驗(yàn)步驟1.提取1）稱取5g人造浮石，置小燒杯中，用2％乙酸浸泡兩次，傾去酸，加蒸餾水屢次沖刷至中性，瀝干備用。2）稱取10g新鮮大豆粉，置入錐形瓶中，加上述人造浮石，加50mL32％丙酮溶液，在冰浴中連續(xù)搖動4min～5min,4層紗布過濾，采集濾液。3）將濾渣重新置于錐形瓶中，另加10mL32％丙酮，再提取一次。4層紗布過濾，濾液在4℃，3500r·min-l條件下離心8min～10niln，小心傾出上清液，計量體積。取lmL酶液保存，供測酶活力和蛋白質(zhì)用。2.積淀脲酶在32％的丙酮中可以遲緩齊聚而積淀，但當(dāng)酶液在等電點(diǎn)周邊時，積淀生成更快。故：（1）將提取的酶液置冰浴中，在遲緩攪拌下，用點(diǎn)滴管逐滴滴加2％醋酸，其實(shí)不停用精巧pH試紙檢測pH變化，察看產(chǎn)生污濁的現(xiàn)象，直至pH4.9左右。置4℃低溫下過夜，可析出積淀。2）將積淀物仔細(xì)轉(zhuǎn)入預(yù)冷的離心管，3500：·而n一，離心10～。上清液回收丙酮；積淀即為脈酶粗品。風(fēng)干后，稱重，計算酶的收得率。1/33.重結(jié)晶1）將所得粗酶溶于少量蒸餾水中，吸取0.2mL～0.4mL用于測定酶活力和蛋白質(zhì)，此即粗酶的活力。2）酶溶液在冰浴中冷至2℃～4℃，攪拌下遲緩滴入等體積64％的預(yù)冷丙酮溶液，保持低溫條件下讓其遲緩析出結(jié)晶，需要較長的時間，可獲得較好的正方形晶體。若是將溶液調(diào)至等電點(diǎn)結(jié)晶，則結(jié)晶速度較快，但晶形不夠規(guī)整。結(jié)晶干燥后低溫保存。三、結(jié)果計算酶收得率（%)=（酶干重＋酶干重x測酶活留取液體體積／酶液整體積）÷樣品重×100%酶的比活力［U·mg-1，(pr.)]＝總活力／總蛋白質(zhì)報告試驗(yàn)結(jié)果及察看到的有關(guān)現(xiàn)象記錄。酶制備記錄表以下：整體積步驟(l）提取液(2）粗酶(3）結(jié)晶酶收得率-1-1U·ml總活力(U)mgml·總蛋白質(zhì)（mg)U·mg-1(pr.)(%)（ml）酶活力蛋白質(zhì)比活力四、儀器與試劑1.家用磨粉機(jī)、冰浴設(shè)備、離心計、5mL、10mL、50mL離心管、1.5mL塑料離心管及其余常例儀器：2/32.新鮮大豆或大豆粉；3.人造移石（專用于吸附氨Permutin顆粒狀人造浮石）;4.