熟悉IgE在I型超敏反應(yīng)中的作用和臨床意義

第七單元

超敏反應(yīng)性疾病的免疫學(xué)檢測實驗一血清IgE的檢測一、血清總IgE的檢測實驗?zāi)康?.掌握ELISA雙抗體夾心法測定血清總IgE的方法。2.熟悉IgE在I型超敏反應(yīng)中的作用和臨床意義。EEEE洗滌待測抗原包被抗體酶標抗體實驗原理ELISA雙抗體夾心法實驗材料1.羊抗人IgE抗體、HRP標記的羊抗人IgE抗體、IgE校準品、TMB（四甲基聯(lián)苯胺）。2.標本：待測血清。3.包被緩沖液、洗滌緩沖液、反應(yīng)終止液（2mol/LH2SO4）等。4.酶標板、微量加樣器、酶標儀、溫箱等。1.包被羊抗人IgE抗體

（4℃過夜，洗滌）

2.封閉（0.5%的小牛血清或牛血清清蛋白）3.加樣（梯度稀釋的IgE校準品、待測血清、陽性對照、陰性對照、空白對照

）

4.37℃溫育2h，洗滌5.加入工作濃度的HRP標記的羊抗人IgE

6.37℃溫育2h，洗滌

EEEE操作步驟8.加入終止液，終止反應(yīng)

9.492nm波長測各孔吸光度值（A值）7.加入底物，37℃溫育15分鐘注意事項1.包被抗體量、酶標抗體的加入量等可影響測定結(jié)果，需預(yù)先摸索最佳條件。2.洗滌要徹底，必要時可加大洗滌液的濃度。3.結(jié)果判斷須在10分鐘內(nèi)完成。4.IgE含量與吸光度值在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，如果樣品的測定結(jié)果超出此范圍，應(yīng)對樣品進行適當?shù)南♂專箻悠分蠭gE的濃度在線性范圍內(nèi)再行測定。結(jié)果分析

以IgE校準品的參考含量（IU/ml）為橫坐標，以對應(yīng)A值為縱坐標，繪制標準曲線。根據(jù)待測樣品的A值，在標準曲線中查出稀釋后樣品中IgE的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為原樣品中IgE的濃度。1IU=2.4ng。臨床意義

血清總IgE水平一般用國際單位（IU）或ng表示，1IU＝2.4ng，相當于WHO標準凍干血清制劑0.00928mg內(nèi)所含的IgE量。正常人群IgE水平受環(huán)境、種族、遺傳、年齡、檢測方法及取樣標準等因素的影響，以致各家報道的正常值相差甚遠。嬰兒臍帶血IgE水平小于0.5IU/ml，出生后隨年齡增長而逐漸升高，12歲時達成人水平。成人血清IgE水平約在20～200IU/ml之間，一般認為大于333IU/ml（800ng/ml）時為異常升高。IgE升高相關(guān)的常見疾病有：過敏性哮喘、季節(jié)性過敏性鼻炎、特應(yīng)性皮炎、藥物性間質(zhì)性肺炎、支氣管肺曲菌病、麻風(fēng)、類天皰瘡及某些寄生蟲感染等。上述疾病時IgE升高的程度并不一致，在過敏性支氣管肺曲菌病時最為顯著，其值可達5000～20000ng/ml，除了此病和特應(yīng)性皮炎以及在花粉季節(jié)之外，任何血清總IgE水平大于5000ng/ml的患者均應(yīng)考慮寄生蟲感染的可能性。

思考題1.ELISA雙抗體夾心法定量測定血清總IgE的原理及應(yīng)注意的問題有哪些？2.測定血清總IgE的臨床意義？二、血清特異性IgE的檢測實驗?zāi)康?.掌握斑點酶免疫印跡法檢測sIgE的原理和方法。2.熟悉sIgE在I型超敏反應(yīng)中的作用和臨床意義。

實驗原理

斑點酶免疫印跡法：用NC膜作為固相支持物，檢測區(qū)的不同區(qū)域包被有特異性的過敏原，質(zhì)控區(qū)包被有兔抗鼠Ig抗體。檢測時將稀釋的病人血清加入反應(yīng)槽內(nèi)，血清中的sIgE與NC膜上的相應(yīng)過敏原結(jié)合。通過洗滌去掉未結(jié)合的游離物質(zhì)，再加入酶標記的抗人IgE抗體，此抗體會與檢測區(qū)NC膜上的sIgE結(jié)合，同時會與質(zhì)控區(qū)上的兔抗鼠Ig抗體結(jié)合。如標本中無sIgE，酶標抗體不能結(jié)合在檢測區(qū)相應(yīng)過敏原區(qū)帶上。通過洗滌去掉未結(jié)合的標記物，然后加入底物顯色。通過顯色區(qū)帶確定血清中含有哪種sIgE，進而判斷待檢者對哪種過敏原過敏。實驗材料1.檢測條包被有特異性過敏原的NC膜2.堿性磷酸酶標記的抗人IgE3.標本稀釋液4.堿性磷酸酶底物5.濃縮洗液（10X）洗液按照1:10倍稀釋6.標本待測血清用標本稀釋液按照1:10倍稀釋。稀釋好的洗液將檢測條要充分浸透，放在搖床上搖10分鐘倒掉洗液，加入稀釋好的測試者血清，放于搖床室溫反應(yīng)1.5小時倒掉小槽中的血清，依次加入洗液，震蕩10分鐘，重復(fù)三次

每槽加入堿性磷酸酶標記的抗人IgE，放于搖床上室溫反應(yīng)30分鐘將堿性磷酸酶標記的抗人IgE倒掉，用洗液洗三次，每次10分鐘

加入堿性磷酸酶底物，放于搖床，避光反應(yīng)約10分鐘去掉底物溶液，用純水洗三次，每次5分鐘操作步驟將檢測條放在干燥紙上，等檢測條完全干燥后判定檢測結(jié)果

注意事項1.不同批次的組分不可混用，且只能在效期內(nèi)使用。2.檢測標本只限于人血清、血漿。3.如果樣本在3天內(nèi)檢測，可以保存在2~8℃，否則應(yīng)冷凍保存，避免反復(fù)凍溶。4.如果標本含有不溶物，離心去除。溶血、渾濁或含有疊氮鈉的標本不可用。5.加樣器槍頭不可混用，避免交叉污染。結(jié)果分析通過顯色區(qū)帶確定血清中含有哪種sIgE，進而判斷待檢者對哪種過敏原過敏。臨床意義

slgE測定是體外檢測變應(yīng)原的重要手段，主要用于Ⅰ型超敏反應(yīng)的診斷。該檢測條包被有多種特異性過敏原，通過檢測血漿（血清）中過敏原slgE，篩查待檢者對何種過敏原過敏，為臨床進行脫敏治療奠定基礎(chǔ)。小結(jié)和討論1.人類I型超敏反應(yīng)可表現(xiàn)為全身性超敏反應(yīng)和局部性超敏反應(yīng)兩種。

2.在5類免疫球蛋白中，IgE是血清中含量最低，半衰期最短，分解率最高，對熱最不穩(wěn)定的Ig。而在I型超敏反應(yīng)患者體內(nèi)，IgE含量顯著增高。

3.血清總IgE的含量是由各種抗原IgE的總和決定。正常人血清IgE含量極微，約0.1～0.9mg/L水平。臨床上一般采用敏感性較高、穩(wěn)定性較好的化學(xué)發(fā)光免疫測定法、酶聯(lián)免疫測定法進行檢測。

思考題1.測定血清sIgE的方法有哪些？各有何優(yōu)缺點？2.測定血清sIgE的臨床意義？實驗二紅細胞表面不完全抗體的檢測一、直接Coombs試驗（試管法

）

實驗?zāi)康?.掌握直接Coombs試驗的原理和操作方法。2.熟悉Coombs試驗的臨床意義。＋患者紅細胞Coombs試劑檢測紅細胞上不完全抗體實驗原理

實驗材料1.診斷試劑抗球蛋白試劑；2.待測患者紅細胞；3.生理鹽水、小試管、吸管、離心機等。操作步驟用生理鹽水配5%紅細胞懸液取潔凈小試管2支，1管加1滴5%紅細胞懸液，另一管加生理鹽水作對照

在生理鹽水和5%紅細胞懸液中分別加入診斷試劑一滴，使其混勻，室溫稍待片刻1000r離心1min或3000r離心15s。

取出試管先以肉眼觀察有無溶血，再輕輕搖動試管，如有凝集，則為陽性結(jié)果；如無凝集，應(yīng)在室溫延長15~30min的反應(yīng)時間，再離心看結(jié)果。注意事項1.每次試驗均須設(shè)陰、陽性對照，如陰性對照發(fā)生自凝，實驗無效。2.受檢血標本必須新鮮。3.洗滌后的紅細胞和器材都不能殘留有血漿蛋白，以免出現(xiàn)假陰性。4.操作過程中動作輕柔，特別是觀察反應(yīng)結(jié)果時，應(yīng)輕輕搖動試管，不可用力過大。5.判定結(jié)果時，溶血與凝集有同樣意義。6.試驗后應(yīng)將玻片即時放入消毒缸內(nèi)。結(jié)果分析

生理鹽水對照不應(yīng)發(fā)生凝集，為均勻渾濁的乳狀液。在紅細胞懸液中，如紅細胞凝集成片狀，邊緣皺褶如花邊狀或邊緣松散為陽性。如與對照相同，為陰性。

臨床意義

直接Coombs試驗用于檢測患者紅細胞上不完全抗體，Coombs試驗陽性可見于自身免疫性溶血性貧血、冷凝集素綜合征、藥物誘發(fā)的免疫性溶血性貧血、新生兒同種免疫性溶血病、某些高球蛋白血癥患者，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕、惡性腫瘤等。

思考題

直接Coombs試驗的原理及臨床意義？二、間接Coombs試驗（微柱凝膠法

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實驗?zāi)康?.掌握間接Coombs試驗的原理和操作方法。2.熟悉Coombs試驗的臨床意義?；颊哐灏屑t細胞致敏紅細胞Coombs試劑檢測血清中的抗紅細胞抗體實驗原理實驗材料1.微柱凝膠卡內(nèi)含抗球蛋白試劑；2.篩選紅細胞一般由2~3人份O型紅細胞組成一套試劑3.待測患者血清；4.生理鹽水、小試管、吸管、試管架、離心機、溫箱等。操作步驟撕開微柱凝膠卡密封紙，標記加1%篩選紅細胞50μl及受檢者血清25μl37℃孵育15min離心機離心10min，1000r/min

觀察結(jié)果，如紅細胞懸浮在反應(yīng)管頂部或凝膠中，則為陽性結(jié)果；反之，如紅細胞沉于凝膠底部（管底尖部），則為陰性結(jié)果。

注意事項1.反應(yīng)卡封口有損壞，管中干涸或有氣泡時，不可使用。使用前必須清楚標記試劑卡,一定要空離心一次后備用。2.不要將試劑卡長期保存4℃，在此溫度下，試劑卡中液體蒸發(fā)凝集于封口鋁箔下，膠易干涸，應(yīng)將試劑卡保存在18~22℃。3.細胞濃度為0.8%~1%，濃度過高或過低，均可減弱凝集強度。4.纖維蛋白可吸附部分紅細胞，導(dǎo)致假陽性結(jié)果。5.細菌污染、不適宜儲存或過期都能使試劑失效。6.須設(shè)陰、陽性對照。7.微柱凝膠管中出現(xiàn)溶血現(xiàn)象，特別提示為紅細胞抗原抗體陽性反應(yīng)，也不排除其它原因所致溶血，對此標本一定要認真分析。結(jié)果分析

-100%的紅細胞沉在微管的底部+/-100%的紅細胞沉在微管的下端1/3之內(nèi)1+80%的紅細胞沉在微管的下端2/3之內(nèi)2+80%的紅細胞沉在微管的上端2/3之內(nèi)3+80%的紅細胞沉在微管的上端1/3之內(nèi)4+凝集的細胞全部處于微管的頂部d.p.雙群Hemo.溶血反應(yīng)格局及判斷標準

臨床意義

間接Coombs試驗用于檢測患者游離血清中的不完全抗體。此實驗多用于檢測母體Rh（D）抗體，以便及早發(fā)現(xiàn)和避免新生兒溶血癥的發(fā)生，亦可對紅細胞不相容的輸血所產(chǎn)生的血型抗體進行檢測。小結(jié)和討論1.檢測抗紅細胞不完全抗體的常用方法為抗球蛋白試驗，又稱為Coombs試驗，直接Coombs試驗用于檢測患者紅細胞上不完全抗體；間接Coombs試驗用于檢測患者游離血清中的不完全抗體。2.Coombs試驗陽性可見于自身免疫性溶血性貧血、冷凝集素綜合征、藥物誘發(fā)的免疫性溶血性貧血、新生兒同種免疫性溶血病、某些高球蛋白血癥患者，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕、惡性腫瘤等。

思考題

1.新生兒溶血癥發(fā)生的機制是什么？

2.微柱凝膠免疫試驗可能出現(xiàn)的結(jié)果有哪些，試分析原因？實驗三循環(huán)免疫復(fù)合物的檢測

實驗?zāi)康?.掌握PEG比濁法檢測循環(huán)免疫復(fù)合物的原理和方法。2.熟悉循環(huán)免疫復(fù)合物檢測的臨床意義。

實驗原理

本試驗是檢測抗原非特異性循環(huán)免疫復(fù)合物的一種方法。PEG是環(huán)氧乙烷和水的多聚物，為一種不帶電荷的直鏈大分子多糖。終濃度為3%～4%的PEG能相對選擇性地沉淀CIC。用分光光度計測定濁度，反應(yīng)沉淀物含量。

實驗材料1.pH8.40.1mol/L硼酸鹽緩沖液（BB）硼砂4.29g、硼酸3.40g，蒸餾水加至1000ml，溶解后用G3或G4號玻璃濾器過濾；2.PEG-NaF稀釋液PEG600040.0g、NaF10.0g、BB加至1000ml，溶解后用G3或G4號玻璃濾器過濾；3.待檢血清、微量加樣器、試管、吸管及橡皮滴頭等；4.分光光度計。加入物測試管對照管BB（ml）—2.0PEG-NaF稀釋液（ml）2.0—待檢血清（ml）0.20.237℃水浴60min分光光度計測A495nm值

操作步驟

注意事項1.4%PEG能沉淀較小的CIC，2%PEG只能沉淀較大的CIC，但濃度大于5%，PEG選擇性沉淀CIC的特性即行消失，導(dǎo)致假陽性的出現(xiàn)。2.應(yīng)注意實驗溫度變化對結(jié)果的影響，離心速度與時間也應(yīng)嚴格掌握。3.低密度脂蛋白可引起濁度增加，故應(yīng)空腹采血。4.高γ球蛋白血癥以及血清標本反復(fù)凍融，均易造成假陽性。

結(jié)果分析待檢血清濁度值=（測定管吸光度-對照管吸光度）×100，以大于正常人濁度值均值加2個標準差為CIC陽性。參考值：正常人血清CIC的A值為4.3±2.0，以≥8.3為免疫復(fù)合物陽性。

臨床意義

循環(huán)免疫復(fù)合物（Circulationimmunecomplex，CIC）又稱可溶性免疫復(fù)合物，分子量為50萬～100萬，沉降系數(shù)8.8～19S，它不易被吞噬細胞吞噬，又不能經(jīng)腎小球排出，可較長時間在血液中循環(huán)，一旦大量循環(huán)免疫復(fù)合物沉積于組織中，則引起組織損傷及相關(guān)的免疫復(fù)合物病。CIC陽性常見于：1.部分自身免疫性疾病，如SLE，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等；2.膜增殖性腎炎，鏈球菌感染后腎炎；3.傳染病，如慢性乙型肝炎，瘧疾，麻風(fēng)等；4.惡性腫瘤。小結(jié)和討論1.循環(huán)免疫復(fù)合物的檢測有助于輔助診斷某些免疫復(fù)合物疾病，如血清病、SLE、慢性活動性肝炎時，CIC往往較高；此外，對CIC的動態(tài)檢測有助于監(jiān)視某些疾病的發(fā)展，協(xié)助判斷療效和預(yù)后；有助于探討研究III型變態(tài)反應(yīng)疾病的發(fā)病機制。2.此法快速簡便，但特異性較差，僅適于篩選。CIC檢測方法較多，原理各不相同，結(jié)果也不盡一樣，因此最好采用多種方法同時進行，以提高陽性檢出率。由于在病理狀態(tài)下往往是單一種類抗原抗體復(fù)合物增高，這種增高只有達到影響總CIC水平才能被檢出，所以有時檢測抗原特異性CIC更為重要。思考題

循環(huán)免疫復(fù)合物檢測的臨床意義？病案討論超敏反應(yīng)性疾病實驗?zāi)康?/p>

通過病案討論、提出問題、應(yīng)用免疫學(xué)技術(shù)檢測有關(guān)免疫學(xué)指標，將免疫學(xué)技術(shù)應(yīng)用于臨床實踐，對臨床疾病做出診斷或醫(yī)療建議，進而對有關(guān)問題產(chǎn)生深入研究的學(xué)習(xí)動機。病案討論一

患者王X，女28歲。因上呼吸道感染前來我院就診。按醫(yī)囑作青霉素皮試陰性，給靜滴青霉素800萬U加5%GNS250ml?；颊呱衔?點左右開始輸液，約1點40分左右輸液畢，無任何不適反應(yīng)，下午3點左右患者感覺全身不適，似有好多蟲子、螞蟻在身上爬，全身緊困，隨即出現(xiàn)心慌等不適前來復(fù)診。一般尚可，痛苦面容，測BP100/70mmHg、P128次/分、心電監(jiān)護提示頻繁室早、R30次/分、明顯缺氧癥。遵醫(yī)囑給肌注腎上腺素1ml，5%GNS250ml，地塞米松10mg靜滴；第二組10%GNS250ml，利多卡因100mg，給氧等處理后癥狀仍無明顯改善轉(zhuǎn)入入院治療，入院后給抗過敏、抗心律失常治療，一周后病人自覺癥狀消失，痊愈出院。

問題：1.該患者有可能屬于哪型超敏反應(yīng)？2.如何進行免疫學(xué)診斷？病案討論二

第一胎足月兒，順產(chǎn)無窒息，體重3200克，生后母乳喂養(yǎng)。第2天出現(xiàn)黃疸，第3天加重，測總膽紅素18mg/dl，患兒精神較差，有貧血貌。體查：除黃疸外，無其他陽性體征。母親為Rh陰性血型，胎兒為Rh陽性血型。問題：1.如何進行診斷和鑒別診斷？

2.還須做哪些實驗室檢查？

病案討論三

患者何X，女，19歲，自3年前有間斷關(guān)節(jié)疼痛，曾服用解熱止痛的西藥無明顯好轉(zhuǎn)，半年前出現(xiàn)面部紅斑，發(fā)熱，關(guān)節(jié)疼痛加重，診斷為“系統(tǒng)性紅斑狼瘡”，應(yīng)用強的松及環(huán)磷酰胺等藥物治療，半年來面部紅斑時輕時重，就診時口服強的松每日15mg，面部蝶形紅斑呈暗紅色，雙手紅斑色鮮，自覺發(fā)熱，五心煩熱，體溫正常，口干咽燥，失眠盜汗，口腔潰瘍，脫發(fā)，疲乏，多關(guān)節(jié)疼痛，下肢皮下見數(shù)個紫斑，刷牙時偶有牙齦出血，腰部有酸痛感，飲食及二便正常，月經(jīng)量少，色淡，舌淡紅，苔薄黃，脈弦細，心肺無明顯陽性體征。初步判斷為III型超敏反應(yīng)?；炑t蛋白103g/L，血白細胞5.0×109/L，血小板60×109/L，尿蛋白+++，24小時尿蛋白定量3.0g，尿中紅細胞+，血沉34mm/h，肝腎功能正常，抗核抗體陽性，滴度為1:160，抗Sm抗體陽性，血免疫球蛋白系在正常范圍，補體C3稍低于正常。問題：試分析還須做哪些實驗室檢查以進一步明確診斷？病案討論四

女性，59歲，間斷咳嗽、咳痰5年，加重伴咯血2個月?；颊?年前受涼后低熱、咳嗽、咳白色粘痰，給予抗生素及祛痰治療，1個月后癥狀不見好轉(zhuǎn)，體重逐漸下降，后拍胸片診為“浸潤型肺結(jié)核”，肌注鏈霉素1個月，口服利福平、雷米封3個月，癥狀逐漸減輕，遂自行停藥，此后一直咳嗽，少量白痰，未再復(fù)查胸片。2個月前勞累后咳嗽加重，少量咯血伴低熱、盜汗、胸悶、乏力又來診。體查：兩上肺呼吸音稍減低，并聞及少量濕羅音，心叩不大，心率94次/分，律齊，無雜音。結(jié)核菌素皮試陽性。問題：1、該患者屬于哪一型超敏反應(yīng)？2、還須做哪些實驗室檢查？病案討論提示病案討論一：1.該患者屬于I型超敏反應(yīng)。2.免疫學(xué)診斷分為體內(nèi)檢測（如皮膚試驗）和體外IgE測定，詳見實驗一和臨床見習(xí)。病案討論二：1.診斷和鑒別診斷（1）生理性黃疸：生后2~3d出現(xiàn)，4~5d達到高峰，總膽紅素值12.9mg/dl，7~10d消退。本例特點：總膽紅素18mg/dl，超過峰值。（2）感染性黃疸：先天感染：查血“TORCH”

后天感染：有沒有感染病灶本例無癥狀、無感染病灶、母親無感染史，可排除感染性黃疸。因胎兒總膽紅素18mg/dl，精神較差，有貧血貌，母親為Rh陰性血型，胎兒為Rh陽性血型。是否為血型不合引起的新生兒溶血？2.實驗室檢查（1）血常規(guī)（2）Rh抗體檢測（3）直接Coombs試驗和間接Coombs試驗（須檢測母親血清中IgG抗體效價）病案討論三：實驗室檢查：1.血常規(guī)2.尿常規(guī)3.肝、腎功能、腹部B超4.ANA譜及其他免疫抗體檢查5.血清免疫球蛋白，補體C3、C4檢查6.循環(huán)免疫復(fù)合物檢測并結(jié)合局部免疫復(fù)合物的免疫組化檢測結(jié)果以明確病變是否與III型超敏