DNA甲基化檢測技術應用與技術比較

DNADNADNA蛋白甲基化的聯合作用機制、RNADNA從醫(yī)學領域擴展到動植物爭論當中，同時在爭論方法上也取得了很大的突破。現在用于DNA的方法或許有十多種，從應用上來分，大致可以分成兩類：全基因組甲基化分析及特異位點甲基化檢測。下面，我們就這兩大類檢測技術進展分析比較，以便于在實際的科研工作中進展選擇。一、全基因組甲基化檢測技術基于芯片平臺的全基因組甲基化篩選芯片平臺作為目前比較成熟的篩選工具，已經在很多領域DNA相應的產品供給，其中應用最為廣泛的就AgilentIlluminaAgilentHumanCpGIslandMicroarrayKit，InfiniumHumanMethylation27BeadChipInfiniumHumanMethylation450KBeadChipRocheNimbleGenAffymetrixNimbleGen產。不同的芯片平臺，各自的試驗過程也是不一樣的。安捷倫DNA〔MeDIP〕技術。將基因組DNA分成兩份，一份用來做MeDIP，Cy5Cy3Cy5/Cy3例顯示出該區(qū)域的甲基化程度。eArray以進展芯片的定制。在甲基化領域同樣適用。AgilentMeDIPIlluminaInfiniumGoldenGate術卻做得到。IlluminaInfiniumSNP檢測，承受的是單堿基延長的原理。分析利用兩個位點特異的探針檢測這些序列差異的位點，一個探針是為甲基化位點(M磁珠類型)設計的，而另一個是為未甲基化位點(U堿基延長摻入了一個標記的ddNTP，它隨后被熒光試劑染色。通過計算甲基化與未甲基化位點的熒光信號比例，可確定檢測位點的甲基化水平。IlluminaInfiniumHumanMethylation27BeadChip27,578CpG領域有廣泛的應用，除了和腫瘤相關的甲基化篩選之外，也能用于其他疾病相關甲基化檢測。因此對這款產品，爭論者賜予了很高的評價，目前此InfiniumHumanMethylation450BeadChip45CpGCpGCpGCpG腫瘤和正常組織中差異表達的甲基化位點等等。它的高覆蓋度、高通量以及低價格，讓它成為進展全基因甲基化篩選的有力武器。相比之下，VeraCode，它以以矩陣微珠芯片(SentrixArrayMatrix(SAM)〕48384CpG。首先，將亞硫酸氫鹽處理的基因組DNAoligooligoUColigoPCRPCRCpGIlluminaCpG基于高通量測序平臺的甲基化圖譜分析隨著二代測序技術的告知進展，測序本錢大幅度下降，使得真正實現全基因組甲基化分析的爭論成為可能。隨著人類甲基化圖譜繪制成功，已經間續(xù)有多個物種的甲DNA法，如亞硫酸氫鹽轉化與高通量測序相結合，可以實現單堿基精度的甲基化圖譜的構建。此外將成熟的MeDIP技術與二代測序相結合，可以快速有效地查找基因組上的甲基化區(qū)域，從而比較不同細胞、組織、甚至疾病DNA該技術也特別適用于大樣本量的疾病表觀爭論。第三代測序技術的消滅，更是讓甲基化的直接測定成為可PacificBiosciences子實時(SMRTDNA成果發(fā)表在《NatureMethods》雜志上。二、特異位點甲基化檢測技術應用比較1PCR〔MS-PCR〕DNADNACpGC轉變?yōu)閁，假設有甲基化則PCR，即可CpG甲基化。因此依據目的基因修飾前后的轉變，就可以相應MU這種方法靈敏度高，無需特別儀器，因此經濟有用，是目前應用最為廣泛的檢測方法。不過也存在確定的局限性，DNA要。另外，亞硫酸氫鹽處理也格外關鍵，假設處理不完全則可能導致假陽性的消滅。PCR(BSP)DNA程如下：經過亞硫酸氫鹽處理后，設計引物進展PCRPCRCpG甲基化。這種方法牢靠，且準確度高，能明確目的片段中CpG測序，其結果準確但要求克隆時所挑克隆較多，操作繁瑣，不易大批量操作。另外，甲基化程度的定量依靠于挑選克隆的數目，因此這種方法只能算得上是一種半定量的技術方法。BSPMSPPCR本的篩選。甲基化敏感性高區(qū)分率熔解曲線分析(MS-HRM)通過熔解曲線分析可以將單堿基序列的差異轉變成熔解曲DNADNA通過熔解曲線分析來覺察。使用該方法進展甲基化分析僅需一對引物，相對簡潔，不過這種方法對儀器的要求頗HRMPCRPCR化狀況進展分析，并不能明確每個CpG點的甲基化狀態(tài)。因此這種技術適用于大量樣本的檢測，CPG點的準確檢測及甲基化程度的準確定量。聯合亞硫酸氫鈉的限制性內切酶分析法〔COBRA〕這種方法是將亞硫酸氫鹽處理與酶切相結合來進展甲基化檢測。DNA樣本經亞硫酸氫鹽處理后，利用PCR擴增。擴增產物純化后用限制性內切酶〔BstUI〕C(5mCG5mCG)，則PCR擴增后保存為CGCG，BstUI能夠識別并進展切割；假設待測序列中，C未發(fā)生甲基化，則PCR后轉變?yōu)門GTG，BstUI識別位點喪失，不能進展切割。這樣酶切產物再經電泳分別、探針雜交、掃描定量后即可計算出原樣本中甲基化的比例。這種方法最大的優(yōu)點就是相對簡潔，可進展快速定量，且需要的樣本量少。然而，它的局限性也格外明顯，只能獲得特別酶切位點的甲基化狀況，且陰性結果并不能排解樣品DNA中存在甲基化的可能。熒光定量法〔Methyligh〕MSPMSP利用熒光染料進展定量。TaqMan?探針法的應用使得該技術具有更高的準確性。其原理與SNPDNA甲基化位點上會存在單堿基的差異，依據這種差PCR，就能夠檢測甲基化的差異。這種方法最大的優(yōu)勢在于其高敏感性和較高PCRTaqMan?探針訂購費用較高，適用于少數位點大量樣本篩選。焦磷酸測序(Pyrosequencing)隨著技術的不斷改進，現在認為焦磷酸測序技術〔Pyrosequencing〕是甲基化檢測的金標準。焦磷酸測序作為一種的序列分析技術，能夠快速地檢測甲基化的頻率，對樣品中的甲基化位點進展定性及定量檢測，為甲基化爭論供給了的途徑。在序列延長過程CTC-T比例。因此，不同位點的甲基化變異就能被準確檢測，并給出準確的甲基化程度的數據。QIAGEN供給三種焦磷酸測序儀器，通量由低到高，適合不同的應用。PyroMarkQ2424PyroMarkQ96ID上進展。在考慮處處理成百上千個樣品所需的大量試劑時，運行通量最大化可能會使試驗本錢變得很高。而PyroMarkQ96MD裝有一臺高度靈敏的光檢測攝像頭，可以在削減試劑量DNA的推出，對于我們實際爭論供給了更有效的檢測手段。雖然焦磷酸測序可以進展單個位點甲基化程度的準確定量，但是目前來看，測序的片段長度還比較短，只有一百bp60bp。以上是對幾種常用的特異位點甲基化檢測方法進展