生物藥物成分的提取純化技術(shù)

第七章生物藥物成分的提取純化技術(shù)學(xué)習(xí)要點(diǎn)掌握幾種基本的細(xì)胞破碎操作技術(shù)掌握超濾分離的操作技術(shù)掌握幾種常用的沉淀分離操作技術(shù)掌握離子交換色譜的操作技術(shù)第一部分必備知識(shí)生物制藥過(guò)程中，產(chǎn)物的分離純化有如下特點(diǎn)：1、生物藥物的有效成分在生物材料中濃度很低，有的只達(dá)到萬(wàn)分之一，甚至百萬(wàn)分之一，因此，分離操作步驟多，不易獲得高收率。2、雜質(zhì)的含量相對(duì)比較高，雜質(zhì)的種類繁多，各種雜質(zhì)的形狀、大小、分子量和理化性質(zhì)都各不相同，沒(méi)有固定的去除方法;3、生產(chǎn)中得到的大多數(shù)目的藥物都是具有生物活性的物質(zhì)，對(duì)熱、酸、堿、重金屬及pH變化和各種理化因素都比較敏感，容易變性、鈍化或破壞，分離過(guò)程中必須十分小心地保護(hù)這些化合物的生理活性；4、生物制藥的分離鈍化的過(guò)程中，加工條件（溫度、pH、離子強(qiáng)度）對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量影響較大。產(chǎn)物的初級(jí)分離階段和純化精制階段分離純化初期，由于粗品中的成分復(fù)雜，目的物濃度較低，與目的物理化性質(zhì)相似的雜質(zhì)多，所以不宜選擇分辨能力較高的純化技術(shù)，采用萃取、沉淀、吸附等一些分辨力低的方法較為有利。精制階段，可采用高選擇性的分離技術(shù)，如各種色譜技術(shù)、超濾技術(shù)等，將目的物與雜質(zhì)分開(kāi)，使產(chǎn)物純度達(dá)到要求。第二部分操作技術(shù)

第一節(jié)細(xì)胞破碎技術(shù)實(shí)踐中選擇破碎方法的原則是：最佳破碎方法與最佳破碎條件相結(jié)合，以達(dá)到高的產(chǎn)物釋放率；與后面的分離純化相結(jié)合考慮，便于產(chǎn)物的提??；低能耗，降低成本。細(xì)胞的破碎方法很多，有物理方法、化學(xué)方法、生物方法等。一物理方法反復(fù)凍融法：置-15~-20℃冰箱內(nèi)凍結(jié)，再置于室溫下，如此反復(fù)凍融幾次。動(dòng)物性材料急熱驟冷法：投入沸水浴中，在90℃左右?guī)追昼?，立即置于冰浴中迅速冷卻。細(xì)菌及病菌材料超聲波破碎法：為防止有效成分的變性，常在冰水或有外部冷卻條件的容器中進(jìn)行。微生物材料碾磨法：為提高碾磨效率，常加入細(xì)砂、石英粉或氧化鋁等。適宜實(shí)驗(yàn)室使用組織搗碎法：為了防止發(fā)熱和升溫過(guò)高引起有效成分的變性，通常轉(zhuǎn)10~20s，停10~20s。一般用于動(dòng)物組織、植物肉質(zhì)種子、柔嫩的葉芽等高壓勻漿破碎法：利用高壓迫使細(xì)胞懸液高速通過(guò)針形閥，通過(guò)突然減壓和高速?zèng)_擊特制撞擊環(huán)，達(dá)到細(xì)胞破碎的目的。細(xì)菌和部分酵母菌細(xì)胞高速攪拌珠磨法：將玻璃小珠與細(xì)胞懸液一起高速攪拌，帶動(dòng)玻璃小球撞擊細(xì)胞，使細(xì)胞破碎的方法。酵母菌和膠束狀微生物菌體二、化學(xué)方法酸堿法：用酸或堿處理微生物細(xì)胞可以溶解細(xì)胞壁使胞內(nèi)產(chǎn)物溶出。大規(guī)模破碎中可與考慮用堿來(lái)溶解細(xì)胞。表面活性劑處理法：利用表面活性劑處理細(xì)胞，可增大細(xì)胞壁通透性，使細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)物容易釋放出來(lái)。三、生物學(xué)方法自溶法：注意水解酶不僅可以使細(xì)胞壁和細(xì)胞膜破壞，同時(shí)也可能會(huì)把某些需要提取的有效成分分解。酶解法：利用酶先將細(xì)胞壁分解，再釋放內(nèi)含物。第二節(jié)沉淀分離技術(shù)應(yīng)用的分離技術(shù)時(shí)考慮以下幾個(gè)因素采用的沉淀技術(shù)對(duì)目的物的分離有高的選擇性；采用的分離條件不會(huì)破壞目的物的結(jié)構(gòu)或活性；加入溶液中的沉淀劑容易獲得，在后續(xù)的加工中容易去除；殘留的沉淀劑對(duì)人體無(wú)害；沉淀劑對(duì)環(huán)境的污染小，易回收。一、鹽析沉淀技術(shù)1.鹽析操作最常用的是硫酸銨：價(jià)格便宜；溶解度大、尤其是在低溫時(shí)仍有相當(dāng)高的溶解度；分離效果好；不易引起變性，有穩(wěn)定蛋白質(zhì)和酶的作用；廢液不污染環(huán)境。2.脫鹽操作透析時(shí)，注意防止透析袋外的液體進(jìn)入透析袋，引起膨脹。為加快透析速度，應(yīng)不斷的更換透析液，因透析所需時(shí)間較長(zhǎng)，為防止酶或蛋白質(zhì)變性，所以最好在低溫中進(jìn)行。透析常用于脫除鹽、少量有機(jī)溶劑、生物小分子雜質(zhì)和濃縮樣品等。二、等電點(diǎn)沉淀技術(shù)蛋白質(zhì)、酶、氨基酸、核酸等都是兩性電解質(zhì)，當(dāng)溶液在某一pH值時(shí)，這些生物大分子的所帶的正負(fù)電荷相等而呈電中性，此時(shí)溶液的pH值稱為等電點(diǎn)。等電點(diǎn)技術(shù)是利用這些生物大分子在其等電點(diǎn)的溶液中，溶解度最低，易發(fā)生沉淀，從而實(shí)現(xiàn)分離的方法。三、有機(jī)溶劑沉淀技術(shù)有機(jī)溶劑沉淀技術(shù)時(shí)在含有溶質(zhì)的水溶液中加入一定量親水的有機(jī)溶劑，降低溶質(zhì)的溶解度，使其沉淀析出。四、有機(jī)高聚合物沉淀技術(shù)有機(jī)高聚物沉淀技術(shù)是用有機(jī)高聚物作沉淀劑。五、結(jié)晶技術(shù)溶質(zhì)以固體形式從溶液中分出，析出物為無(wú)定形固體時(shí)稱為沉淀技術(shù)，析出物為晶體時(shí)則稱為結(jié)晶技術(shù)；它們共同的特征都是溶質(zhì)從液相中析出，形成固相。第三節(jié)萃取分離技術(shù)萃取技術(shù)是利用目標(biāo)藥物在互不相溶的溶劑之間分配系數(shù)不同而得以純化或濃縮的技術(shù)。一、溶劑萃取技術(shù)：是利用目的物在兩種互不相溶的溶液中的溶解度不同，使其從一種溶液轉(zhuǎn)移到另一種溶液中去，以達(dá)到濃縮和提純的目的。二、雙水相萃取技術(shù)：將兩種不同水溶性的高聚物溶液混合，當(dāng)高聚物的濃度達(dá)到一定值時(shí)，體系會(huì)自然地分成不相溶的兩相，這就是雙水相體系。三、超臨界萃取技術(shù)它以超臨界流體作為萃取劑，在超臨界狀態(tài)下，從物料中萃取待分離的組分，然后借助壓力、溫度的改變使超臨界流體變成普通氣體，被萃取物質(zhì)則完全或基本析出，從而達(dá)到分離提純的目的，所以在超臨界流體萃取過(guò)程是由萃取和分離組合而成的。最為常用的是CO2：臨界溫度為接近常溫，適于分離對(duì)熱敏感物質(zhì)；臨界壓力容易達(dá)到；可以滲入原料，提取完全；選擇性好；無(wú)毒，不易殘存在提取物中；化學(xué)穩(wěn)定性高；價(jià)格低廉，可以重復(fù)使用。超臨界為超臨界流體，是介于氣液之間的一種既非氣態(tài)又非液態(tài)的物態(tài)，這種物質(zhì)只能在其溫度和壓力超過(guò)臨界點(diǎn)時(shí)才能存在。超臨界流體的密度較大，與液體相仿，而它的粘度又較接近于氣體。因此超臨界流體是一種十分理想的萃取劑。物質(zhì)是以氣、液和固3種形式存在，在不同的壓力和溫度下可以相的轉(zhuǎn)換。在溫度高于某一數(shù)值時(shí)，任何大的壓力均不能使該純物質(zhì)由氣相轉(zhuǎn)化為液相，此時(shí)的溫度即被稱之為臨界溫度Tc；而在臨界溫度下，氣體能被液化的最低壓力稱為臨界壓力Pc。當(dāng)物質(zhì)所處的溫度高于臨界溫度，壓力大于臨界壓力時(shí)，該物質(zhì)處于超臨界狀態(tài)。在壓溫圖中，高于臨界溫度和臨界壓力的區(qū)域就稱為超臨界區(qū)，如果流體被加熱或被壓縮至其臨界溫度（Tc）和臨界壓力（Pc）以上狀態(tài)時(shí)，向該狀態(tài)氣體加壓，氣體不會(huì)液化，只是密度增大，具有類似液體性質(zhì)，同時(shí)還保留有氣體性能，這種狀態(tài)的流體稱為超臨界流體。超臨界萃取的技術(shù)原理超臨界CO2流體萃?。⊿FE）分離過(guò)程的原理是利用超臨界流體的溶解能力與其密度的關(guān)系，即利用壓力和溫度對(duì)超臨界流體溶解能力的影響而進(jìn)行的。在超臨界狀態(tài)下，將超臨界流體與待分離的物質(zhì)接觸，使其有選擇性地把極性大小、沸點(diǎn)高低和分子量大小的成分依次萃取出來(lái)。當(dāng)然，對(duì)應(yīng)各壓力范圍所得到的萃取物不可能是單一的，但可以控制條件得到最佳比例的混合成分，然后借助減壓、升溫的方法使超臨界流體變成普通氣體，被萃取物質(zhì)則完全或基本析出，從而達(dá)到分離提純的目的，所以超臨界CO2流體萃取過(guò)程是由萃取和分離過(guò)程組合而成的。第四節(jié)過(guò)濾與超過(guò)濾技術(shù)超濾技術(shù)是一種膜分離技術(shù)。膜分離技術(shù)是在一定的壓力下，使小分子溶質(zhì)和溶劑穿過(guò)一定孔徑的特制的薄膜，而使大分子溶質(zhì)不能透過(guò)，留在膜的一邊，從而使大分子物質(zhì)得到部分純化的技術(shù)。超濾技術(shù)分為：微孔過(guò)濾、超濾和反滲透三種。一、過(guò)濾技術(shù)過(guò)濾技術(shù)是指在外力的作用下，懸浮液中的液體通過(guò)多孔介質(zhì)的孔道而固體顆粒被截留下來(lái)，從而實(shí)現(xiàn)固、液分離的技術(shù)。過(guò)濾操作所處理的懸浮液稱為濾漿，所用的多孔物質(zhì)稱為過(guò)濾介質(zhì)，通過(guò)介質(zhì)孔道的液體稱為濾液，被截留的物質(zhì)稱為濾餅或?yàn)V渣。二、超濾技術(shù)超濾是一種加壓膜分離技術(shù)，是流體在一定的壓力下，經(jīng)過(guò)特制的一定孔徑的薄膜時(shí)，溶劑、無(wú)機(jī)鹽和小分子溶質(zhì)可以通過(guò)，而大分子物質(zhì)則被截留，使其在原液中的濃度逐漸提高，從而實(shí)現(xiàn)了大小分子間分離、濃縮和純化的目的。超濾技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單；速度快，一次處理可完成濃縮和精制工作；操作條件溫和；回收率高；對(duì)被處理物理的影響小等。第五節(jié)

泡沫分離技術(shù)泡沫分離技術(shù)是根據(jù)表面吸附的原理，借助鼓泡使溶液中的目的物聚集在氣-液界面，隨氣泡上浮至溶液主體上方，形成泡沫層，將泡沫和液相主體分開(kāi)，從而濃縮目的成分的分離技術(shù)。泡沫分離技術(shù)特別適合于低含量的產(chǎn)品，具有分辨率高、富集率高、運(yùn)行成本低、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)。第六節(jié)干燥技術(shù)干燥是將潮濕的固體、半固體或濃縮液中的水分蒸發(fā)除去的過(guò)程，通常是生物活性藥物成品化前的最后的加工過(guò)程，因此操作的好壞直接影響到產(chǎn)品的質(zhì)量。一、噴霧干燥技術(shù)是將一定濃度的液態(tài)物料噴射成極細(xì)的霧狀液滴，并與一定流速的干燥介質(zhì)充分接觸，在很短時(shí)間內(nèi)霧滴中水分揮發(fā)，得到粉狀或顆粒制品。其特點(diǎn)是：干燥時(shí)間極短，避免產(chǎn)品活性的破壞，適用于熱敏性物料的干燥；產(chǎn)品質(zhì)量好，易溶解；操作控制方便，適于連續(xù)化、自動(dòng)化、大型化生產(chǎn)；在密閉系統(tǒng)中進(jìn)行干燥，不受污染，產(chǎn)品衛(wèi)生狀況好。二、真空冷凍干燥真空冷凍干燥技術(shù)簡(jiǎn)稱凍干技術(shù)，此技術(shù)是將待干燥物料在低溫下冷凍，使其所含的水分結(jié)冰，然后在真空環(huán)境下加熱，讓水分由固態(tài)升華為氣態(tài)并移走，使物料得以干燥。（1）預(yù)凍過(guò)程：速率必須適當(dāng)。（2）升華過(guò)程：物品在真空條件下吸熱，冰晶就會(huì)升華成水蒸氣而從表面逸出。（3）干燥過(guò)程：干燥可減少制品凍干后回潮。第七節(jié)色譜分離技術(shù)文獻(xiàn)綜述目標(biāo)物研究進(jìn)展生物藥物制備方案設(shè)計(jì)線路簡(jiǎn)介研究目的材料選擇細(xì)胞破碎建立分析方法預(yù)備實(shí)驗(yàn)固液分離濃縮色譜分離脫鹽凍干產(chǎn)品分析沉降離心過(guò)濾機(jī)械法、物理法化學(xué)法、生物法沉淀、吸附、超濾離心濃縮吸附色譜離子交換色譜凝膠色譜親和色譜疏水色譜逆流色譜提取溶劑萃取水相萃取溶解性能溶液穩(wěn)定性固體穩(wěn)定性物理性質(zhì)化學(xué)性質(zhì)生物活性、酶活力、比活組成和純度分析分子量、pI其它理化性質(zhì)分析透析、凝膠過(guò)濾冷凍干燥

一、原材料選擇的原則：

原料有效成分含量高、來(lái)源豐富、產(chǎn)地較近、雜質(zhì)含量少、成本低。

生物藥物提取、分離、純化技術(shù)基礎(chǔ)

生物材料的選擇：

1．生物活性物質(zhì)存在部位：胞內(nèi)、胞外、胞漿、質(zhì)膜、器膜、周質(zhì)

2．生物材料的采集與質(zhì)控（1）品種鑒定；（2）防止污染與感染；（3）選擇富集目的物材料；（4）冷凍保存

二、生物藥物常用的提取方法與優(yōu)化

（一）幾種常用提取方法

1．酸、堿、鹽水溶液提取方法

2．表面活性劑提取方法與反膠束提取方法

3．有機(jī)溶劑提取

4.雙水相萃取法

5．超臨界萃取法

（二）提取方法與優(yōu)化

1.溶劑選擇

2.選擇添加劑①保護(hù)劑；②酶抑制劑

3.提取條件①溫度；②pH；③鹽；④表面活性劑三．濃縮與干燥1.濃縮方法：①鹽析；②有機(jī)溶劑沉淀；③高分子脫水④超濾；⑤真空濃縮或薄膜濃縮；

2.干燥：①低溫真空干燥；②噴霧干燥；③冷凍干燥

四、分離純化1.生化制藥工藝中分離純化特點(diǎn):

(1)生物材料組成復(fù)雜

(2)目的物含量低

(3)易變性、失活

(4)分離方法有很大經(jīng)驗(yàn)成分

(5)步驟多，逐級(jí)分離

(6)產(chǎn)品驗(yàn)證與化學(xué)上純度概念不完全相同2.分離純化原理

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(1)根據(jù)分子形狀與分子大小

(2)根據(jù)電荷差異

(3)根據(jù)分子極性與溶解度大小

(4)根據(jù)吸附特性

(5)根據(jù)生物配基特性3.選擇原則（1）粗品分離：大處理量,相對(duì)低分辨率鹽析，分級(jí)沉淀，萃取，超濾（2）精制：高分辨率多種色譜層析法,親和層析，HPLC，F(xiàn)PLC，電泳或等電聚焦五、生物制藥下游技術(shù)的特點(diǎn)1、培養(yǎng)液（或發(fā)酵液）中所含欲分離的生物藥物濃度很低，雜質(zhì)含量高，需進(jìn)行多步分離操作。2、穩(wěn)定性較差，加熱、pH、有機(jī)溶劑等可引起失活或分解。3、生物變異性大4、注意生物安全問(wèn)題生物藥物的分離純化原則在分離純化的設(shè)計(jì)中需要考慮的因素：1、抑制宿主細(xì)胞或分泌產(chǎn)物中相應(yīng)的酶活性，防止其消化降解待提純產(chǎn)物。2、使目標(biāo)產(chǎn)物成分有較高的純度，降低對(duì)人體有害的非目標(biāo)成分的含量。3、保證生物藥物的安全、有效。注意每個(gè)生產(chǎn)環(huán)節(jié)的時(shí)效性，對(duì)每一步驟的質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)控。4、盡可能優(yōu)化分離純化工藝，減少分離步驟，降低生產(chǎn)成本。生物藥物的分離純化1、溶劑與試劑2、pH3、添加物4、分離純化前準(zhǔn)備分離純化的基本工藝流程預(yù)處理→細(xì)胞破碎與碎片處理→可溶性雜質(zhì)的去除→分離純化分離純化單元操作的特點(diǎn)1、各種技術(shù)相互交叉，新型的分離純化方法不斷涌現(xiàn)2、注重新材料的研制3、分離純化設(shè)備推陳出新，發(fā)展迅速分離純化方法的選擇1、初步分離純化方法的選擇2、多種分離純化方法交替使用第四部分知識(shí)與能力測(cè)試1、組織搗碎法如何防止因發(fā)熱和升溫過(guò)高引起的有效成分的變性？答：為了防止發(fā)熱和升溫過(guò)高引起有效成分的變性，通常轉(zhuǎn)10~20s，停10~20s。2、選擇細(xì)胞破碎方法的原則是什么？答：最佳破碎方法與最佳破碎條件相結(jié)合，以達(dá)到高的產(chǎn)物釋放率；與后面的分離純化相結(jié)合考慮，便于產(chǎn)物的提?。坏湍芎?，降低成本。細(xì)胞的破碎方法很多，有物理方法、化學(xué)方法、生物方法等。3、板框過(guò)濾的操作由哪幾部分組成？答：板框過(guò)濾機(jī)的操作是間歇的，每個(gè)操作循環(huán)由裝合、過(guò)濾、洗滌、卸渣、整理五個(gè)階段組成。4、為什么進(jìn)行超濾前料液要進(jìn)行預(yù)處理？超濾膜如何清洗？答：超濾法中待處理的溶液如果含有較多的固體雜質(zhì)、膠體等，這些物質(zhì)極易黏附和沉淀在膜的表面