茶樹育種學(xué)第七章-生物技術(shù)在茶樹育種中的應(yīng)用課件

第七章：生物技術(shù)在茶樹育種中的應(yīng)用生物技術(shù)是以生命科學(xué)為基礎(chǔ)，利用生物體的特性和功能，設(shè)計、構(gòu)建、培育具有預(yù)期性狀的新品種、新物種、新品系，以及與工程原理相結(jié)合，進行加工生產(chǎn)，為社會提供商品和服務(wù)的綜合技術(shù)體系。目前用于茶樹育種的現(xiàn)代生物技術(shù)有組織培養(yǎng)和營養(yǎng)繁殖技術(shù)、花粉（藥）培養(yǎng)和單倍體培育技術(shù)、原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細胞雜交技術(shù)、分子標(biāo)記技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)等。第七章：生物技術(shù)在茶樹育種中的應(yīng)用生物技術(shù)是以生命科學(xué)為基礎(chǔ)1第一節(jié)：組織與器官培養(yǎng)一、組織與器官培養(yǎng)的概念和應(yīng)用（一）組織與器官培養(yǎng)的概念將離體的植物體各種結(jié)構(gòu)（如原生質(zhì)體、細胞、組織、器官以及幼小植株）在無菌的人工環(huán)境中使其生長發(fā)育，以獲得再生的完整植株或生產(chǎn)具有經(jīng)濟價值的其他生物產(chǎn)品的一種技術(shù)。（二）組織與器官培養(yǎng)的類型1、胚胎培育。指以胚及具有胚的器官作為外植體，在離體培養(yǎng)條件下，使其再生完整植株的技術(shù)。第一節(jié)：組織與器官培養(yǎng)一、組織與器官培養(yǎng)的概念和應(yīng)用22、（狹義）組織培養(yǎng)。指以植物各部分的組織（如分生組織、表皮組織等）作為外植體的離體培養(yǎng)技術(shù)。3、器官培養(yǎng)。指以植物的某一器官的全部或部分器官原基作為外植體的離體培養(yǎng)技術(shù)。4、花粉與花藥培養(yǎng)。指用未成熟的花粉或花藥作為外植體的離體培養(yǎng)技術(shù)。5、細胞培養(yǎng)。指以能保持較好分散性的單細胞或很小的細胞團作為外植體的離體培養(yǎng)技術(shù)。6、原生質(zhì)體培養(yǎng)。指以除去細胞壁而獲得的原生質(zhì)體作為外植體的離體培養(yǎng)技術(shù)。2、（狹義）組織培養(yǎng)。指以植物各部分的組織（如分生組織、表皮3（三）組織與器官培養(yǎng)在育種中的應(yīng)用1、擴大變異范圍。2、克服遠緣雜交的一些障礙。3、獲得體細胞雜種。4、倍性控制。5、快速無性繁殖。6、獲得脫毒苗。7、種質(zhì)資源的保存。8、作為外源基因轉(zhuǎn)化的受體系統(tǒng)。（三）組織與器官培養(yǎng)在育種中的應(yīng)用4二、培養(yǎng)的步驟與方法植物組織與器官培養(yǎng)的過程：無菌培養(yǎng)的建立→營養(yǎng)繁殖體的增殖→再分化→試管苗移栽大田。（一）無菌培養(yǎng)的建立1、取材（外植體）。注意取材時間、部位、消毒等技術(shù)環(huán)節(jié)。⑴未成熟胚及相關(guān)材料的取材和滅菌。⑵莖尖及相關(guān)材料的取材。⑶葉片取材。注意消除多酚類氧化而產(chǎn)生的褐變。二、培養(yǎng)的步驟與方法52、構(gòu)建培養(yǎng)基。培養(yǎng)基由營養(yǎng)成分和生長成分構(gòu)成，前者主要提供外植體發(fā)育所需的元素，后者主要是調(diào)節(jié)外植體的生長發(fā)育。構(gòu)建培養(yǎng)基應(yīng)注意兩點：①必須保證外植體能夠生存。②盡可能使外植體較快生長發(fā)育。最常用的培養(yǎng)基是MS培養(yǎng)基。（二）營養(yǎng)繁殖體的增殖營養(yǎng)繁殖體的增殖是指愈傷組織的增殖。外植體接種到培養(yǎng)基后，經(jīng)過脫分化作用，形成一團分生細胞（愈傷組織），這團細胞不斷分裂使?fàn)I養(yǎng)繁殖體增殖。2、構(gòu)建培養(yǎng)基。培養(yǎng)基由營養(yǎng)成分和生長成分構(gòu)成，前者主要提供6（三）再分化（通過調(diào)節(jié)激素種類及比例）1、誘導(dǎo)腋芽發(fā)生。2、誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽。3、誘導(dǎo)體細胞胚發(fā)生。4、誘導(dǎo)根的發(fā)生。5、幼苗的馴化鍛煉。（四）試管苗移栽大田。主要克服組織失水和病菌感染，保證移栽成活率。（三）再分化（通過調(diào)節(jié)激素種類及比例）7三、茶樹組織與器官培養(yǎng)的概況早在20世紀(jì)60年代末，英國劍橋大學(xué)化學(xué)系開始了茶樹幼莖切塊培養(yǎng)，用以研究茶樹咖啡堿合成途徑。此后，各國研究人員也開始了對茶樹組織與器官培養(yǎng)的研究，并取得了一些成果。莫典義和黃雁萍（1981）通過種胚培養(yǎng)獲得完整植株；中村順行（1985）培養(yǎng)子胚獲得完整植株；劉德華（1990）培養(yǎng)子葉柄獲得完整植株；土井芳憲培養(yǎng)莖切段獲得完整植株；王毅軍（1994）以茶樹葉片為外植體，培養(yǎng)出完整的植株。盡管有很多成功的報道，但茶樹是多年生木本植物，多酚類含量高，到目前為止，茶樹組織和細胞培養(yǎng)技術(shù)平臺還沒有完善，還有很多技術(shù)障礙需要克服。三、茶樹組織與器官培養(yǎng)的概況8第二節(jié)：花粉和花藥培養(yǎng)與單倍體育種一、單倍體在植物育種上的作用1、單倍體植物的概念凡具有配子染色體數(shù)的植物稱為單倍體植物。2、單倍體在植物育種上的作用⑴單倍體染色體加倍可獲得純合二倍體，這對常規(guī)雜交育種有極為重要意義。⑵有利于克服遠緣雜交的不實性，培育出穩(wěn)定的遠緣雜種新類型。⑶與誘變育種相結(jié)合可加速育種進程。⑷作為外源基因轉(zhuǎn)化的受體系統(tǒng)。第二節(jié)：花粉和花藥培養(yǎng)與單倍體育種一、單倍體在植物育種上的作9二、花粉和花藥培養(yǎng)技術(shù)（一）花藥培養(yǎng)1、取材。關(guān)鍵是選取花粉處于一定發(fā)育期的花藥。用醋酸洋紅染色壓片法鏡檢確定花粉的發(fā)育時期，當(dāng)大多數(shù)細胞處在單核中、晚期時，是花藥培養(yǎng)取材的最佳時期。2、滅菌。3、建立培養(yǎng)基并接種。在接種時注意徹底除去花絲部分和盡量避免損傷花藥。4、脫分化和繁殖增殖。藥室內(nèi)側(cè)分裂形成原胚多細胞團，再經(jīng)球型胚、心臟型胚、魚雷型胚等發(fā)育階段，最后以胚狀體形式突出于花藥壁，再將胚狀體細胞轉(zhuǎn)移到另一培養(yǎng)基培養(yǎng)、增殖。二、花粉和花藥培養(yǎng)技術(shù)105、再分化并形成幼苗。將增殖了的胚狀體細胞（愈傷組織）轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，分化出不定芽和根，最后形成單倍體試管苗。6、移栽。通過更換培養(yǎng)基，逐漸降低滲透壓和生長素含量，直到幼苗的根、莖、葉生長都較正常和健壯時，移出進行沙培或土培。（二）花粉培養(yǎng)由于在花藥培養(yǎng)中所獲得的植株不只是來源于花粉，也來源于花藥壁、絨氈層等不同部位的體細胞，結(jié)果造成所獲得植株群體常常是一個既有單倍體，又有二倍體、甚至多倍體的混合群體，給以后的鑒定和利用帶來一定困難。花粉培養(yǎng)則可以完全排除花藥組織的干擾，使誘導(dǎo)形成的植株全部來源于單倍體的花粉，從而可省略對其鑒定的程序或可以直接利用。但花粉培養(yǎng)所要求的技術(shù)要比花藥培養(yǎng)5、再分化并形成幼苗。將增殖了的胚狀體細胞（愈傷組織）轉(zhuǎn)移到11復(fù)雜，許多不明因素有待研究。花粉培養(yǎng)的全過程除了材料的選擇和滅菌與花藥培養(yǎng)基本相同外，還包括花粉的分離和培養(yǎng)兩個步驟?；ǚ鄣姆蛛x常用自然散落法，培養(yǎng)常用淺層液體培養(yǎng)法。（三）影響花藥及花粉培養(yǎng)的因素1、供體植株的基因型。一般地說，性狀優(yōu)良、生活力強的親本的雜交后代的花藥及花粉比較容易誘導(dǎo)形成單倍體植株。復(fù)雜，許多不明因素有待研究。122、培養(yǎng)基。培養(yǎng)基不僅影響到外植體能否生存，還影響到其生長速度和能否分化成完整的植株。主要的影響因素有：①營養(yǎng)成分。主要是無機鹽和有機成分（如氨基酸、酵母提取液等），為外植體的生長發(fā)育提供碳源、氮源、微量元素等。②PH值。一般要求PH值在5。5~7之間。③蔗糖濃度。蔗糖濃度影響到培養(yǎng)基的滲透壓。一般地說，開始培養(yǎng)時，蔗糖濃度要高些，以后逐步降低。2、培養(yǎng)基。培養(yǎng)基不僅影響到外植體能否生存，還影響到其生長速13④激素。激素的種類及濃度對花藥及花粉的分化起著決定性作用。一般情況下。當(dāng)生長素與細胞激動素的比值高時，有利長根；比值低時，有利長芽，比值適中時，繼續(xù)長愈傷組織。3、小孢子發(fā)育階段。只有具一定發(fā)育階段的小孢子，才對外界刺激較為敏感。多數(shù)植物以單核期，特別是單核期的中后期比較敏感。4、供體植株的生理狀態(tài)及培養(yǎng)前的預(yù)處理。預(yù)處理有低溫處理、高溫處理、離心處理、減壓處理、滲透壓處理、碳源饑餓處理、二氧化碳處理等。④激素。激素的種類及濃度對花藥及花粉的分化起著決定性作用。一14三、單倍體植株的染色體加倍單倍體植株只有經(jīng)過染色體加倍，使之成為純合的二倍體可育植株，才能給育種工作者提供可選擇的材料。目前單倍體植株的染色體加倍主要有以下三種途徑：1、自然加倍。2、人工誘導(dǎo)加倍。主要用秋水仙堿處理。3、從愈傷組織再生二倍體植株。即利用單倍性細胞的不穩(wěn)定特性，通過對單倍體植株的莖、葉等組織的再培養(yǎng)，可獲得較高比例的加倍植株。三、單倍體植株的染色體加倍15四、單倍體植株及純合二倍體植株的鑒定。一般是取植株根尖進行細胞學(xué)觀察，將根尖用卡諾固定液固定，鐵礬蘇木精染色，制成石蠟切片或者涂片，在光學(xué)顯微鏡下可觀察到染色體數(shù)目。5、茶樹花藥及花粉培養(yǎng)的成就。據(jù)報道，前蘇聯(lián)、印度、日本和我國的研究人員都對茶樹花藥及花粉培養(yǎng)進行了研究，最有影響的是陳振光等人（1981）用茶樹花藥培養(yǎng)，誘導(dǎo)出完整的試管苗和植株。四、單倍體植株及純合二倍體植株的鑒定。一般是取植株根尖進行細16第三節(jié)：細胞培養(yǎng)及其突變體篩選一、單細胞培養(yǎng)單細胞培養(yǎng)是指從植株組織器官或愈傷組織游離出單細胞，在無菌條件下，使其再生完整植株的技術(shù)。（一）分離細胞的方法1、物理方法。先將植物組織器官等外植體接種到固體培養(yǎng)基上，讓其形成質(zhì)地松散的愈傷組織，再經(jīng)過振蕩、過濾、離心、沉淀而得到分散的細胞或細胞團。2、酶法（果膠酶和纖維素酶）。第三節(jié)：細胞培養(yǎng)及其突變體篩選一、單細胞培養(yǎng)17（二）單細胞培養(yǎng)方法1、液體淺層培養(yǎng)。2、微滴培養(yǎng)。3、平板培養(yǎng)。4、看護培養(yǎng)。5、條件培養(yǎng)。（三）培養(yǎng)細胞的密度及活力的測定1、起始培養(yǎng)的細胞密度。起始培養(yǎng)的細胞密度通常以1萬至1億個/毫升為宜。2、細胞活力的測定。測定方法主要有染色法，（二）單細胞培養(yǎng)方法18包括瑩光素雙醋酸鹽染色法和酚藏花紅染色法。3、植板率的測定。植板率的含義是每個平板接種細胞總數(shù)形成細胞團的百分率。即：植板率=（每平板形成的細胞團數(shù)÷每平板接種的細胞總數(shù)）×100%；其中，每平板接種的細胞總數(shù)=每毫升培養(yǎng)液中的細胞數(shù)目×該平板細胞培養(yǎng)液的毫升數(shù)。包括瑩光素雙醋酸鹽染色法和酚藏花紅染色法。19二、細胞突變體篩選（一）細胞突變體篩選的意義1、可在小規(guī)模的實驗室中同時對大量細胞進行選擇，節(jié)省人力、物力，而且不受環(huán)境條件的影響。2、篩選獲得的突變體不會出現(xiàn)嵌合體，遺傳穩(wěn)定，易鑒定。（二）細胞突變體篩選的一般技術(shù)1、細胞材料的選擇。要從再生能力強、染色體數(shù)目穩(wěn)定性好、生長速度快的親本細胞系中進行選擇。另外，如果篩選突變體的目的是為獲得能經(jīng)有性生殖傳代的植物，那么就應(yīng)避免使用非整倍二、細胞突變體篩選20體的細胞作為選擇的材料。2、誘發(fā)突變的方法①物理方法，如用紫外線、放射線處理。②化學(xué)方法，即使用化學(xué)誘變劑，如甲基磺酸乙酯（ＥＭＳ）和5-溴去氧尿嘧啶核苷等多種有機物以及一些簡單無機化合物．③突變細胞的選擇方法Ａ、直接選擇。如在培養(yǎng)基中某些重金屬離子，若能生存，說明是耐高濃度重金屬離子的突變體細胞。Ｂ、間接選擇。如在培養(yǎng)基中加入羥基脯氨酸，可選擇耐旱性突變細胞。體的細胞作為選擇的材料。21（三）突變性狀的遺傳基礎(chǔ)及其穩(wěn)定性鑒定讓細胞或組織在沒有選擇劑的培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)幾代，如果仍能表現(xiàn)選擇出來的變異性狀的，便可基本確定為突變細胞或組織。也可用再生的植株開花結(jié)實后所獲得的發(fā)芽種子或用種子長成的植株為材料，進一步誘導(dǎo)其形成愈傷組織，將這些愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有選擇劑的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，如果仍能表現(xiàn)變異性狀的，即可認為這些再生植株為變異植株。（三）突變性狀的遺傳基礎(chǔ)及其穩(wěn)定性鑒定22（四）農(nóng)業(yè)上有用性狀的突變體離體篩選１、抗病性篩選。常用活菌選擇劑和病菌毒素選擇劑進行篩選。２、對除草劑抗性的篩選。３、對溫度的抗耐性的篩選。（四）農(nóng)業(yè)上有用性狀的突變體離體篩選23第四節(jié)：原生質(zhì)體培養(yǎng)與體細胞雜交一、原生質(zhì)體和體細胞雜交的概念１、原生質(zhì)體：植株原生質(zhì)體是指除去細胞壁由質(zhì)膜包裹著的具有生活力的植株裸細胞。２、體細胞雜交：指使不同植物的原生質(zhì)體相互融合形成雜種細胞，再經(jīng)過人工培養(yǎng)誘導(dǎo)雜種細胞分化形成植株的過程。二、原生質(zhì)體的分離（一）分離原生質(zhì)體的材料。常用葉肉組織、無菌苗的子葉以及由植物組織器官形成的愈傷組織及懸浮細胞。第四節(jié)：原生質(zhì)體培養(yǎng)與體細胞雜交一、原生質(zhì)體和體細胞雜交的概24（二）原生質(zhì)體的分離１、材料的預(yù)處理。目的使游離的原生質(zhì)體能適應(yīng)新的培養(yǎng)條件。⑴預(yù)培養(yǎng)。⑵暗處理。⑶藥物或添加劑處理。⑷萎焉處理。⑸更新培養(yǎng)基。２、原生質(zhì)體的分離。常用酶法分離。３、原生質(zhì)體活力的檢測：把原生質(zhì)體放入略微（二）原生質(zhì)體的分離25降低滲透壓的培養(yǎng)基中，那些在分離時縮小體型又能恢復(fù)原狀的原生質(zhì)體是具有活力的。二、原生質(zhì)體的培養(yǎng)（一）培養(yǎng)基本及培養(yǎng)條件除選擇適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基外，還應(yīng)注意以下問題：１、植物激素。２原生質(zhì)體的密度。一般采用1千個/毫升以上的密度。３、光照和溫度。降低滲透壓的培養(yǎng)基中，那些在分離時縮小體型又能恢復(fù)原狀的原生26（二）原生質(zhì)體的培養(yǎng)方法。常用液體淺層培養(yǎng)和平板培養(yǎng)兩種方法。（三）原生質(zhì)體的培養(yǎng)過程體積增大→細胞壁再生→細胞分裂→愈傷組織→再分化→幼苗。三、原生質(zhì)體的融合（一）原生質(zhì)體的融合的類型１、自發(fā)融合。指植物組織和細胞在用酶分離原生質(zhì)體過程中，同種原生質(zhì)體自然融合，形成同核體。（二）原生質(zhì)體的培養(yǎng)方法。常用液體淺層培養(yǎng)和平板培養(yǎng)兩種方法27２、誘導(dǎo)融合。指分離原生質(zhì)體以后，通過加入誘導(dǎo)劑或其它方法促進不同親本的異種原生質(zhì)體之間發(fā)生融合的過程。異種原生質(zhì)體之間能否真正融合，在很大程度上處決原生質(zhì)體之間的親緣關(guān)系和生理狀態(tài)。（二）誘導(dǎo)融合的方法１、物理方法。有離心法、振動法、電刺激法。常用后者。2、化學(xué)方法。⑴高PH高鈣法。２、誘導(dǎo)融合。指分離原生質(zhì)體以后，通過加入誘導(dǎo)劑或其它方法促28⑵多聚化合物法。常用聚乙二醇（PEG）。PEG是相鄰原生質(zhì)體表面間的分子橋，有很強的凝聚作用，當(dāng)PEG分子被高鈣、高PH洗脫時，可能引起原生質(zhì)體表面電荷的紊亂和再分布，從而促進融合。四、原生質(zhì)體融合體的發(fā)育及雜種細胞的篩選（一）原生質(zhì)融合體的生長發(fā)育1、異核體的壁再生。2、異核體的核融合。異核體的核能否融合。在很大程度上取決于原生質(zhì)體之間的親緣關(guān)系，親緣關(guān)系近的原生質(zhì)體在細胞減數(shù)分裂時能同步分裂⑵多聚化合物法。常用聚乙二醇（PEG）。29而使核融合。3、融合細胞的增殖。4、愈傷組織的器官分化，形成幼苗。（二）雜種細胞的篩選在細胞水平上進行雜種細胞的篩選，目的是雜種細胞提供良好的生長環(huán)境，以保護和促進其生長發(fā)育。篩選的方法有很多。如培養(yǎng)基促進異核體的選擇方法；葉綠素缺失互補選擇法；生化突變體互補選擇法；雙突變系選擇法；瑩光標(biāo)記選擇法等。這些方法有一定效果，也有一定局限性。而使核融合。30五、體細胞雜種植株的鑒定1、形態(tài)學(xué)鑒定。即根據(jù)植株的表現(xiàn)型特征來鑒定體細胞雜種。2、細胞學(xué)鑒定。即根據(jù)細胞中染色體數(shù)目、大小、與形態(tài)來鑒定細胞雜種。3、生化鑒定。即利用親本的某些生物化學(xué)特性在雜種中的表達來鑒別體細胞雜種。4、DNA檢測鑒定。即應(yīng)用分子檢測技術(shù)，從分子水平來鑒定體細胞雜種。五、體細胞雜種植株的鑒定31思考題：1、什么是體細胞雜交？簡述體細胞雜交的步驟。2、體細胞雜種植株的鑒定方法有哪些？各有什么特點？3、什么是單倍體植物？單倍體茶樹對于茶樹育種來說有何意義？4、成熟和完善的組織和器官培養(yǎng)體系對育種有何意義？目前利用組織和器官培養(yǎng)體系進行茶樹育種有何困難？5、影響茶樹花藥培養(yǎng)的主要因素有哪些？思考題：32第七章：生物技術(shù)在茶樹育種中的應(yīng)用生物技術(shù)是以生命科學(xué)為基礎(chǔ)，利用生物體的特性和功能，設(shè)計、構(gòu)建、培育具有預(yù)期性狀的新品種、新物種、新品系，以及與工程原理相結(jié)合，進行加工生產(chǎn)，為社會提供商品和服務(wù)的綜合技術(shù)體系。目前用于茶樹育種的現(xiàn)代生物技術(shù)有組織培養(yǎng)和營養(yǎng)繁殖技術(shù)、花粉（藥）培養(yǎng)和單倍體培育技術(shù)、原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細胞雜交技術(shù)、分子標(biāo)記技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)等。第七章：生物技術(shù)在茶樹育種中的應(yīng)用生物技術(shù)是以生命科學(xué)為基礎(chǔ)33第一節(jié)：組織與器官培養(yǎng)一、組織與器官培養(yǎng)的概念和應(yīng)用（一）組織與器官培養(yǎng)的概念將離體的植物體各種結(jié)構(gòu)（如原生質(zhì)體、細胞、組織、器官以及幼小植株）在無菌的人工環(huán)境中使其生長發(fā)育，以獲得再生的完整植株或生產(chǎn)具有經(jīng)濟價值的其他生物產(chǎn)品的一種技術(shù)。（二）組織與器官培養(yǎng)的類型1、胚胎培育。指以胚及具有胚的器官作為外植體，在離體培養(yǎng)條件下，使其再生完整植株的技術(shù)。第一節(jié)：組織與器官培養(yǎng)一、組織與器官培養(yǎng)的概念和應(yīng)用342、（狹義）組織培養(yǎng)。指以植物各部分的組織（如分生組織、表皮組織等）作為外植體的離體培養(yǎng)技術(shù)。3、器官培養(yǎng)。指以植物的某一器官的全部或部分器官原基作為外植體的離體培養(yǎng)技術(shù)。4、花粉與花藥培養(yǎng)。指用未成熟的花粉或花藥作為外植體的離體培養(yǎng)技術(shù)。5、細胞培養(yǎng)。指以能保持較好分散性的單細胞或很小的細胞團作為外植體的離體培養(yǎng)技術(shù)。6、原生質(zhì)體培養(yǎng)。指以除去細胞壁而獲得的原生質(zhì)體作為外植體的離體培養(yǎng)技術(shù)。2、（狹義）組織培養(yǎng)。指以植物各部分的組織（如分生組織、表皮35（三）組織與器官培養(yǎng)在育種中的應(yīng)用1、擴大變異范圍。2、克服遠緣雜交的一些障礙。3、獲得體細胞雜種。4、倍性控制。5、快速無性繁殖。6、獲得脫毒苗。7、種質(zhì)資源的保存。8、作為外源基因轉(zhuǎn)化的受體系統(tǒng)。（三）組織與器官培養(yǎng)在育種中的應(yīng)用36二、培養(yǎng)的步驟與方法植物組織與器官培養(yǎng)的過程：無菌培養(yǎng)的建立→營養(yǎng)繁殖體的增殖→再分化→試管苗移栽大田。（一）無菌培養(yǎng)的建立1、取材（外植體）。注意取材時間、部位、消毒等技術(shù)環(huán)節(jié)。⑴未成熟胚及相關(guān)材料的取材和滅菌。⑵莖尖及相關(guān)材料的取材。⑶葉片取材。注意消除多酚類氧化而產(chǎn)生的褐變。二、培養(yǎng)的步驟與方法372、構(gòu)建培養(yǎng)基。培養(yǎng)基由營養(yǎng)成分和生長成分構(gòu)成，前者主要提供外植體發(fā)育所需的元素，后者主要是調(diào)節(jié)外植體的生長發(fā)育。構(gòu)建培養(yǎng)基應(yīng)注意兩點：①必須保證外植體能夠生存。②盡可能使外植體較快生長發(fā)育。最常用的培養(yǎng)基是MS培養(yǎng)基。（二）營養(yǎng)繁殖體的增殖營養(yǎng)繁殖體的增殖是指愈傷組織的增殖。外植體接種到培養(yǎng)基后，經(jīng)過脫分化作用，形成一團分生細胞（愈傷組織），這團細胞不斷分裂使?fàn)I養(yǎng)繁殖體增殖。2、構(gòu)建培養(yǎng)基。培養(yǎng)基由營養(yǎng)成分和生長成分構(gòu)成，前者主要提供38（三）再分化（通過調(diào)節(jié)激素種類及比例）1、誘導(dǎo)腋芽發(fā)生。2、誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽。3、誘導(dǎo)體細胞胚發(fā)生。4、誘導(dǎo)根的發(fā)生。5、幼苗的馴化鍛煉。（四）試管苗移栽大田。主要克服組織失水和病菌感染，保證移栽成活率。（三）再分化（通過調(diào)節(jié)激素種類及比例）39三、茶樹組織與器官培養(yǎng)的概況早在20世紀(jì)60年代末，英國劍橋大學(xué)化學(xué)系開始了茶樹幼莖切塊培養(yǎng)，用以研究茶樹咖啡堿合成途徑。此后，各國研究人員也開始了對茶樹組織與器官培養(yǎng)的研究，并取得了一些成果。莫典義和黃雁萍（1981）通過種胚培養(yǎng)獲得完整植株；中村順行（1985）培養(yǎng)子胚獲得完整植株；劉德華（1990）培養(yǎng)子葉柄獲得完整植株；土井芳憲培養(yǎng)莖切段獲得完整植株；王毅軍（1994）以茶樹葉片為外植體，培養(yǎng)出完整的植株。盡管有很多成功的報道，但茶樹是多年生木本植物，多酚類含量高，到目前為止，茶樹組織和細胞培養(yǎng)技術(shù)平臺還沒有完善，還有很多技術(shù)障礙需要克服。三、茶樹組織與器官培養(yǎng)的概況40第二節(jié)：花粉和花藥培養(yǎng)與單倍體育種一、單倍體在植物育種上的作用1、單倍體植物的概念凡具有配子染色體數(shù)的植物稱為單倍體植物。2、單倍體在植物育種上的作用⑴單倍體染色體加倍可獲得純合二倍體，這對常規(guī)雜交育種有極為重要意義。⑵有利于克服遠緣雜交的不實性，培育出穩(wěn)定的遠緣雜種新類型。⑶與誘變育種相結(jié)合可加速育種進程。⑷作為外源基因轉(zhuǎn)化的受體系統(tǒng)。第二節(jié)：花粉和花藥培養(yǎng)與單倍體育種一、單倍體在植物育種上的作41二、花粉和花藥培養(yǎng)技術(shù)（一）花藥培養(yǎng)1、取材。關(guān)鍵是選取花粉處于一定發(fā)育期的花藥。用醋酸洋紅染色壓片法鏡檢確定花粉的發(fā)育時期，當(dāng)大多數(shù)細胞處在單核中、晚期時，是花藥培養(yǎng)取材的最佳時期。2、滅菌。3、建立培養(yǎng)基并接種。在接種時注意徹底除去花絲部分和盡量避免損傷花藥。4、脫分化和繁殖增殖。藥室內(nèi)側(cè)分裂形成原胚多細胞團，再經(jīng)球型胚、心臟型胚、魚雷型胚等發(fā)育階段，最后以胚狀體形式突出于花藥壁，再將胚狀體細胞轉(zhuǎn)移到另一培養(yǎng)基培養(yǎng)、增殖。二、花粉和花藥培養(yǎng)技術(shù)425、再分化并形成幼苗。將增殖了的胚狀體細胞（愈傷組織）轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，分化出不定芽和根，最后形成單倍體試管苗。6、移栽。通過更換培養(yǎng)基，逐漸降低滲透壓和生長素含量，直到幼苗的根、莖、葉生長都較正常和健壯時，移出進行沙培或土培。（二）花粉培養(yǎng)由于在花藥培養(yǎng)中所獲得的植株不只是來源于花粉，也來源于花藥壁、絨氈層等不同部位的體細胞，結(jié)果造成所獲得植株群體常常是一個既有單倍體，又有二倍體、甚至多倍體的混合群體，給以后的鑒定和利用帶來一定困難。花粉培養(yǎng)則可以完全排除花藥組織的干擾，使誘導(dǎo)形成的植株全部來源于單倍體的花粉，從而可省略對其鑒定的程序或可以直接利用。但花粉培養(yǎng)所要求的技術(shù)要比花藥培養(yǎng)5、再分化并形成幼苗。將增殖了的胚狀體細胞（愈傷組織）轉(zhuǎn)移到43復(fù)雜，許多不明因素有待研究?；ǚ叟囵B(yǎng)的全過程除了材料的選擇和滅菌與花藥培養(yǎng)基本相同外，還包括花粉的分離和培養(yǎng)兩個步驟?；ǚ鄣姆蛛x常用自然散落法，培養(yǎng)常用淺層液體培養(yǎng)法。（三）影響花藥及花粉培養(yǎng)的因素1、供體植株的基因型。一般地說，性狀優(yōu)良、生活力強的親本的雜交后代的花藥及花粉比較容易誘導(dǎo)形成單倍體植株。復(fù)雜，許多不明因素有待研究。442、培養(yǎng)基。培養(yǎng)基不僅影響到外植體能否生存，還影響到其生長速度和能否分化成完整的植株。主要的影響因素有：①營養(yǎng)成分。主要是無機鹽和有機成分（如氨基酸、酵母提取液等），為外植體的生長發(fā)育提供碳源、氮源、微量元素等。②PH值。一般要求PH值在5。5~7之間。③蔗糖濃度。蔗糖濃度影響到培養(yǎng)基的滲透壓。一般地說，開始培養(yǎng)時，蔗糖濃度要高些，以后逐步降低。2、培養(yǎng)基。培養(yǎng)基不僅影響到外植體能否生存，還影響到其生長速45④激素。激素的種類及濃度對花藥及花粉的分化起著決定性作用。一般情況下。當(dāng)生長素與細胞激動素的比值高時，有利長根；比值低時，有利長芽，比值適中時，繼續(xù)長愈傷組織。3、小孢子發(fā)育階段。只有具一定發(fā)育階段的小孢子，才對外界刺激較為敏感。多數(shù)植物以單核期，特別是單核期的中后期比較敏感。4、供體植株的生理狀態(tài)及培養(yǎng)前的預(yù)處理。預(yù)處理有低溫處理、高溫處理、離心處理、減壓處理、滲透壓處理、碳源饑餓處理、二氧化碳處理等。④激素。激素的種類及濃度對花藥及花粉的分化起著決定性作用。一46三、單倍體植株的染色體加倍單倍體植株只有經(jīng)過染色體加倍，使之成為純合的二倍體可育植株，才能給育種工作者提供可選擇的材料。目前單倍體植株的染色體加倍主要有以下三種途徑：1、自然加倍。2、人工誘導(dǎo)加倍。主要用秋水仙堿處理。3、從愈傷組織再生二倍體植株。即利用單倍性細胞的不穩(wěn)定特性，通過對單倍體植株的莖、葉等組織的再培養(yǎng)，可獲得較高比例的加倍植株。三、單倍體植株的染色體加倍47四、單倍體植株及純合二倍體植株的鑒定。一般是取植株根尖進行細胞學(xué)觀察，將根尖用卡諾固定液固定，鐵礬蘇木精染色，制成石蠟切片或者涂片，在光學(xué)顯微鏡下可觀察到染色體數(shù)目。5、茶樹花藥及花粉培養(yǎng)的成就。據(jù)報道，前蘇聯(lián)、印度、日本和我國的研究人員都對茶樹花藥及花粉培養(yǎng)進行了研究，最有影響的是陳振光等人（1981）用茶樹花藥培養(yǎng)，誘導(dǎo)出完整的試管苗和植株。四、單倍體植株及純合二倍體植株的鑒定。一般是取植株根尖進行細48第三節(jié)：細胞培養(yǎng)及其突變體篩選一、單細胞培養(yǎng)單細胞培養(yǎng)是指從植株組織器官或愈傷組織游離出單細胞，在無菌條件下，使其再生完整植株的技術(shù)。（一）分離細胞的方法1、物理方法。先將植物組織器官等外植體接種到固體培養(yǎng)基上，讓其形成質(zhì)地松散的愈傷組織，再經(jīng)過振蕩、過濾、離心、沉淀而得到分散的細胞或細胞團。2、酶法（果膠酶和纖維素酶）。第三節(jié)：細胞培養(yǎng)及其突變體篩選一、單細胞培養(yǎng)49（二）單細胞培養(yǎng)方法1、液體淺層培養(yǎng)。2、微滴培養(yǎng)。3、平板培養(yǎng)。4、看護培養(yǎng)。5、條件培養(yǎng)。（三）培養(yǎng)細胞的密度及活力的測定1、起始培養(yǎng)的細胞密度。起始培養(yǎng)的細胞密度通常以1萬至1億個/毫升為宜。2、細胞活力的測定。測定方法主要有染色法，（二）單細胞培養(yǎng)方法50包括瑩光素雙醋酸鹽染色法和酚藏花紅染色法。3、植板率的測定。植板率的含義是每個平板接種細胞總數(shù)形成細胞團的百分率。即：植板率=（每平板形成的細胞團數(shù)÷每平板接種的細胞總數(shù)）×100%；其中，每平板接種的細胞總數(shù)=每毫升培養(yǎng)液中的細胞數(shù)目×該平板細胞培養(yǎng)液的毫升數(shù)。包括瑩光素雙醋酸鹽染色法和酚藏花紅染色法。51二、細胞突變體篩選（一）細胞突變體篩選的意義1、可在小規(guī)模的實驗室中同時對大量細胞進行選擇，節(jié)省人力、物力，而且不受環(huán)境條件的影響。2、篩選獲得的突變體不會出現(xiàn)嵌合體，遺傳穩(wěn)定，易鑒定。（二）細胞突變體篩選的一般技術(shù)1、細胞材料的選擇。要從再生能力強、染色體數(shù)目穩(wěn)定性好、生長速度快的親本細胞系中進行選擇。另外，如果篩選突變體的目的是為獲得能經(jīng)有性生殖傳代的植物，那么就應(yīng)避免使用非整倍二、細胞突變體篩選52體的細胞作為選擇的材料。2、誘發(fā)突變的方法①物理方法，如用紫外線、放射線處理。②化學(xué)方法，即使用化學(xué)誘變劑，如甲基磺酸乙酯（ＥＭＳ）和5-溴去氧尿嘧啶核苷等多種有機物以及一些簡單無機化合物．③突變細胞的選擇方法Ａ、直接選擇。如在培養(yǎng)基中某些重金屬離子，若能生存，說明是耐高濃度重金屬離子的突變體細胞。Ｂ、間接選擇。如在培養(yǎng)基中加入羥基脯氨酸，可選擇耐旱性突變細胞。體的細胞作為選擇的材料。53（三）突變性狀的遺傳基礎(chǔ)及其穩(wěn)定性鑒定讓細胞或組織在沒有選擇劑的培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)幾代，如果仍能表現(xiàn)選擇出來的變異性狀的，便可基本確定為突變細胞或組織。也可用再生的植株開花結(jié)實后所獲得的發(fā)芽種子或用種子長成的植株為材料，進一步誘導(dǎo)其形成愈傷組織，將這些愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有選擇劑的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，如果仍能表現(xiàn)變異性狀的，即可認為這些再生植株為變異植株。（三）突變性狀的遺傳基礎(chǔ)及其穩(wěn)定性鑒定54（四）農(nóng)業(yè)上有用性狀的突變體離體篩選１、抗病性篩選。常用活菌選擇劑和病菌毒素選擇劑進行篩選。２、對除草劑抗性的篩選。３、對溫度的抗耐性的篩選。（四）農(nóng)業(yè)上有用性狀的突變體離體篩選55第四節(jié)：原生質(zhì)體培養(yǎng)與體細胞雜交一、原生質(zhì)體和體細胞雜交的概念１、原生質(zhì)體：植株原生質(zhì)體是指除去細胞壁由質(zhì)膜包裹著的具有生活力的植株裸細胞。２、體細胞雜交：指使不同植物的原生質(zhì)體相互融合形成雜種細胞，再經(jīng)過人工培養(yǎng)誘導(dǎo)雜種細胞分化形成植株的過程。二、原生質(zhì)體的分離（一）分離原生質(zhì)體的材料。常用葉肉組織、無菌苗的子葉以及由植物組織器官形成的愈傷組織及懸浮細胞。第四節(jié)：原生質(zhì)體培養(yǎng)與體細胞雜交一、原生質(zhì)體和體細胞雜交的概56（二）原生質(zhì)體的分離１、材料的預(yù)處理。目的使游離的原生質(zhì)體能適應(yīng)新的培養(yǎng)條件。⑴預(yù)培養(yǎng)。⑵暗處理。⑶藥物或添加劑處理。⑷萎焉處理。⑸更新培養(yǎng)基。２、原生質(zhì)體的分離。常用酶法分離。３、原生質(zhì)體活力的檢測：把原生質(zhì)體放入略微（二）原生質(zhì)體的分離57降低滲透壓的培養(yǎng)基中，那些