轉(zhuǎn)基因動物與動物生物反應器課件

第9章轉(zhuǎn)基因動物

與動物生物反應器TransgenicAnimal＆AnimalBioreactor第9章轉(zhuǎn)基因動物

與動物生物反應器TransgenicA1學習須知主要內(nèi)容：動物轉(zhuǎn)基因技術及其應用重點：常用的轉(zhuǎn)基因動物培育技術學習須知主要內(nèi)容：動物轉(zhuǎn)基因技術及其應用2章節(jié)內(nèi)容前言9.1轉(zhuǎn)基因動物的培育技術9.2轉(zhuǎn)基因動物的應用9.3動物乳腺生物反應器章節(jié)內(nèi)容前言3轉(zhuǎn)基因動物

TransgenicAnimal轉(zhuǎn)基因動物

TransgenicAnimal4前言在基因組內(nèi)穩(wěn)定地整合了以實驗方法導入的外源基因，并且外源基因可以穩(wěn)定地遺傳給后代的遺傳工程動物?；蛘呤侵附柚蚬こ碳夹g把外源基因?qū)胧荏w動物的染色體內(nèi)，外源基因可在受體內(nèi)穩(wěn)定遺傳的動物。前言在基因組內(nèi)穩(wěn)定地整合了以實驗方法導入的外源基因，并5轉(zhuǎn)基因動物的研究歷史：1974年，美國學者Jaenisch首次應用顯微鏡注射法獲得轉(zhuǎn)基因小鼠。

1981年，美國科學家成功地將外源基因?qū)雱游锱咛?，?chuàng)立了轉(zhuǎn)基因動物技術。1982年獲得轉(zhuǎn)基因小鼠。

1987年，世界上第一只商業(yè)化轉(zhuǎn)基因綿羊在英國著名的羅斯林研究所誕生。這只轉(zhuǎn)基因母羊的乳汁中可以分泌α—抗胰蛋白酶，含量高達30毫克/升。

1989年，意大利學者用精子作為載體轉(zhuǎn)移目的基因，成功地獲得了純系轉(zhuǎn)基因小鼠。

1997年10月，英國羅斯林研究所（Roslin）宣布已成功克隆出3只攜帶有人凝血因子Ⅸ基因轉(zhuǎn)染綿羊。

1999年2月，上海遺傳研究所宣布轉(zhuǎn)基因試管?！疤咸稀闭Q生，其體內(nèi)被檢測到帶有人的血清白蛋白基因，這項成果被評為當年“中國十大科技進展”之一。轉(zhuǎn)基因動物的研究歷史：1974年，美國學者Jaenisch首69.1轉(zhuǎn)基因動物的培育技術常用的轉(zhuǎn)基因動物培育技術有：9.1.1基因顯微注射法9.1.2逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法9.1.3胚胎干細胞介入法9.1.4精子載體導入法9.1.5YAC介導法9.1.6細胞核移植技術9.1轉(zhuǎn)基因動物的培育技術常用的轉(zhuǎn)基因動物培育技術有：79.1.1基因顯微注射法原理通過顯微注射儀把外源基因直接注射到受精卵的雄性原核內(nèi)部，并使之整合到基因組DNA中，獲得轉(zhuǎn)基因動物。9.1.1基因顯微注射法原理89.1.1基因顯微注射法以轉(zhuǎn)基因小鼠的培育為例：1.目的基因的制備與純化；2.卵供體母鼠和假孕母鼠的準備；3.供體母鼠超數(shù)排卵處理；4.供體母鼠與公鼠交配；5.受精卵采集；6.目的基因顯微注射；7.受精卵移植；8.目的基因表達鑒定和檢測；9.建立遺傳基因小鼠近交系。9.1.1基因顯微注射法以轉(zhuǎn)基因小鼠的培育為例：91.目的基因的制備與純化；目的基因的來源：內(nèi)切酶的酶切片段；cDNA;人工合成基因片段；PCR擴增特異片段。1.目的基因的制備與純化；目的基因的來源：102.卵供體母鼠和假孕母鼠的準備；將輸精管結扎后絕育的雄鼠交配可育雌鼠，剌激雌鼠產(chǎn)生一系列一系列妊娠變化反應而得到假孕母鼠，做為受精卵轉(zhuǎn)基因后的養(yǎng)母。2.卵供體母鼠和假孕母鼠的準備；將輸精管結扎后絕育的雄鼠交113.供體母鼠超數(shù)排卵處理；向可育雌鼠注射孕馬血清取絨毛膜促性腺激素（PMSG）以及人絨毛膜促性腺激素(HCG)促使其超排卵。3.供體母鼠超數(shù)排卵處理；向可育雌鼠注射孕馬血清取絨毛膜促性124.供體母鼠與公鼠交配；超排卵處理后，供體母鼠與可育雄鼠交配。4.供體母鼠與公鼠交配；超排卵處理后，供體母鼠與可育雄鼠交135.受精卵采集；交配次日，剖腹從供體母鼠的輸卵管內(nèi)收集受精卵，CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)液保存?zhèn)溆谩?.受精卵采集；交配次日，剖腹從供體母鼠的輸卵管內(nèi)收集受精146.目的基因顯微注射；用顯微注射裝置將目的基因溶液導入受精卵雄性原核內(nèi)。6.目的基因顯微注射；用顯微注射裝置將目的基因溶液導入受精15顯微注射的機理受精卵1個小時之內(nèi)，精子與卵子各自形成自己的原核，不融合，隨著時間的推移，雄原核開始膨大。注射針要插入雄原核內(nèi)。首先將受精卵置于培養(yǎng)基的液滴內(nèi)，用吸持針找到受精卵并吸持住，調(diào)整雄原核的位置。將注射針裝好DNA溶液，通過調(diào)節(jié)注射管，慢慢將DNA溶液注射進入雄原核內(nèi)。顯微注射的機理受精卵1個小時之內(nèi)，精子與卵子各自形成自己的原167.受精卵移植將已轉(zhuǎn)入基因的受精卵先體外培育，從單細胞到桑葚胚階段，自假孕母鼠的背部植入其輸卵管內(nèi)，使胚胎在養(yǎng)母體內(nèi)發(fā)育成熟。7.受精卵移植將已轉(zhuǎn)入基因的受精卵先體外培育，從單細胞到桑178.目的基因表達鑒定和檢測①幼鼠發(fā)生斷乳后自尾部提取DNA，與目的基因探針作分子雜交（southern），鑒定外源基因是否整合，有整合的鼠稱為首建鼠（founder）（半合子：目的基因整合在二倍體動物的其中一條染色體上

）；②檢測：通過northern(RNA)andwestern(Pr)雜交在轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)水平上檢測表達。8.目的基因表達鑒定和檢測①幼鼠發(fā)生斷乳后自尾部提取DNA189.建立遺傳基因小鼠近交系。首建鼠(半合子)與正常的野生型小鼠雜交，檢測后代的整合率，取后代有50%機率帶有整合基因的小鼠(陽性)，近親繁殖，再通過同一窩的陽性雌雄小鼠(兄妹)交配，在基因的同源重組作用下，最終得到純合子小鼠。9.建立遺傳基因小鼠近交系。首建鼠(半合子)與正常的野生型19轉(zhuǎn)基因動物與動物生物反應器課件20轉(zhuǎn)基因動物的一般制備過程轉(zhuǎn)基因動物的一般制備過程21轉(zhuǎn)基因動物的一般制備過程（續(xù)）轉(zhuǎn)基因動物的一般制備過程（續(xù)）22轉(zhuǎn)基因動物的一般制備過程轉(zhuǎn)基因動物的一般制備過程23顯微注射法優(yōu)點：外源基因的導入整合效率較高，不需要載體，直接轉(zhuǎn)移目的基因，目的基因的長度可>100Kb。它可以直接獲得純系，實驗周期短。顯微注射法不足點：外源基因整合的效率低，不能控制整合的位點，外源基因隨機結合或隨機插入位點，有插入突變的風險，而且整合的拷貝數(shù)未知，方法較復雜，技術性強，設備昂貴等，基因穩(wěn)定耗時較長，效率低。顯微注射法優(yōu)點：24轉(zhuǎn)基因動物與動物生物反應器課件259.1.2逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法1.原理：將目的基因重組到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體上，制成高濃度的病毒顆粒，人為感染著床前或著床后的胚胎，也可以直接將胚胎與能釋放逆轉(zhuǎn)錄病毒的單層培養(yǎng)細胞共孵育以達到感染的目的，通過病毒將外源目的基因插入整合到宿主基因組DNA中去。9.1.2逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法1.原理：262.流程（1）構建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體；（2）包裝細胞；（3）重組病毒感染早期胚胎；2.流程（1）構建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體；27（1）構建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體步驟：病毒DNA提取；病毒DNA克隆到載體；外源目的基因克隆到載體。（1）構建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體步驟：28（2）包裝細胞包裝細胞是通過基因工程技術對細胞進行修飾，使其產(chǎn)生病毒結構基因所編碼的蛋白，為逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包裝成為重組病毒提供全面的病毒蛋白，同時，該包裝細胞并不能轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生編碼完整病毒的基因組RNA。載體轉(zhuǎn)染包裝細胞，逆轉(zhuǎn)錄酶催化下，載體DNA轉(zhuǎn)錄為RNA，包裝細胞表達產(chǎn)生病毒蛋白，此RNA和病毒蛋白組裝為具有感染性的重組病毒顆粒（位于包裝細胞內(nèi)）。（2）包裝細胞包裝細胞是通過基因工程技術對細胞進行修飾，使其29轉(zhuǎn)基因動物與動物生物反應器課件30（3）重組病毒感染早期胚胎；程序：取出受精卵；去除卵外的透明帶；包裝細胞（含重組病毒）與受精卵共培養(yǎng)(轉(zhuǎn)染)

；轉(zhuǎn)染后的胚胎移植到假孕母鼠體內(nèi)；轉(zhuǎn)基因仔鼠的篩選鑒定（3）重組病毒感染早期胚胎；程序：31逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法的優(yōu)缺點優(yōu)點：感染效率高；缺點：被導入的外源基因大小受限；感染后引起的安全性存在不確定性。逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法的優(yōu)缺點優(yōu)點：329.1.3胚胎干細胞介導法1.原理外源DNA導入體外培養(yǎng)的ES細胞，把轉(zhuǎn)基因的ES細胞注入受體囊胚并使其分化，再將此囊胚移植到假孕動物體內(nèi)，產(chǎn)生子代，子代再經(jīng)過全同胞兄妹交配，獲得轉(zhuǎn)基因純合體。9.1.3胚胎干細胞介導法1.原理33流程分離培養(yǎng)ES細胞；外源基因?qū)隕S細胞；囊胚期胚胎獲得；通過顯微操作，把ES細胞注射到胚胎的囊胚腔，形成嵌合體；轉(zhuǎn)基因胚胎移植到假孕母鼠體內(nèi)；產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠。流程分離培養(yǎng)ES細胞；34轉(zhuǎn)基因動物與動物生物反應器課件35轉(zhuǎn)基因動物與動物生物反應器課件36胚胎干細胞介導法的優(yōu)缺點優(yōu)點：在將胚胎干細胞植入胚胎前，可以在體外選擇特殊的基因型；用外源DNA轉(zhuǎn)染以后，胚胎干細胞可以被克隆，繼而可以篩選含有整合外源DNA的細胞用于細胞融合，由此可以得到很多遺傳上相同的轉(zhuǎn)基因動物。缺點：許多嵌合體轉(zhuǎn)基因動物生殖細胞內(nèi)不含有轉(zhuǎn)基因。

胚胎干細胞介導法的優(yōu)缺點優(yōu)點：379.1.4精子載體導入法1.原理：將成熟的精子與外源DNA進行預培養(yǎng)之后，使攜帶外源DNA的精子與卵子結合為受精卵，并使外源DNA整合于合子的染色體中。2.精子攜帶DNA主要是通過三種途徑來完成，即將外源DNA與精子共孵育、電穿孔導入法和脂質(zhì)體傳染法

9.1.4精子載體導入法1.原理：38程序外源基因?qū)刖?；轉(zhuǎn)基因精子與卵子結合（通過人工受精，體外受精等）；受精卵移植到假孕動物體內(nèi)，產(chǎn)生子代，子代再經(jīng)過全同胞兄妹交配，獲得轉(zhuǎn)基因純合體。程序外源基因?qū)刖樱?9精子介導方法的優(yōu)缺點優(yōu)點：方法簡單、方便，成本小，依靠生理受精過程，免去了原核的損傷。缺點：成功率不高,效果不穩(wěn)定。精子介導方法的優(yōu)缺點優(yōu)點：409.1.5酵母人工染色體(YAC)介導法ES細胞轉(zhuǎn)染YAC后體外篩選，所得陽性ES細胞囊胚腔注射；YAC的原核顯微注射兩種途徑。9.1.5酵母人工染色體(YAC)介導法41利用YAC轉(zhuǎn)基因動物研究的優(yōu)勢在于保證巨大基因的完整性及所有順式因子的完整并與結構基因的位置關系不變，且較大的外源基因片段在轉(zhuǎn)基因動物研究時整合率提高，便于研究。利用YAC轉(zhuǎn)基因動物研究的優(yōu)勢在于保證巨大基因的完整性及所有429.1.6細胞核移植技術1.原理轉(zhuǎn)基因技術與核移植技術結合。9.1.6細胞核移植技術1.原理432.程序外源基因轉(zhuǎn)染動物細胞；篩選整合有外源基因的體細胞作為核供體；轉(zhuǎn)基因供體核移植到去核卵母細胞；被激活的轉(zhuǎn)基因卵母細胞體外培養(yǎng)至囊胚；囊胚移植到假孕母體，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因幼子。2.程序外源基因轉(zhuǎn)染動物細胞；443.該技術的優(yōu)缺點優(yōu)點：后代全為轉(zhuǎn)基因個體，遺傳背景和遺傳穩(wěn)定性一致；僅需一代即可建立轉(zhuǎn)基因群體，節(jié)約時間和物力。缺點：技術不夠完善，成功率低；后代可能出現(xiàn)老化現(xiàn)象。3.該技術的優(yōu)缺點優(yōu)點：后代全為轉(zhuǎn)基因個體，遺傳背景和遺傳459.2轉(zhuǎn)基因動物的應用2.1在基礎理論方面的應用2.1.1可以對基因的結構和功能進行研究2.1.2可以進行組織表達特異性研究2.1.3還可以研究發(fā)育過程的特異性表達。將不同的外源基因轉(zhuǎn)入宿主動物受精卵或早期胚胎干細胞，可觀察研究目的基因在胚胎不同發(fā)育階段的特異性表達、閉關及調(diào)控機理。9.2轉(zhuǎn)基因動物的應用2.1在基礎理論方面的應用462.2在畜牧獸醫(yī)中的應用

2.2.1應用于動物抗病育種轉(zhuǎn)基因技術可以用于動物抗病育種，不僅可以加速改良的進程，使選擇的效率提高，改良的機會增多，并且不會受到有性繁殖的限制.2.2.2應用于動物生產(chǎn)通過轉(zhuǎn)基因技術，可以促進動物生長、提高畜產(chǎn)品產(chǎn)量、改善品質(zhì)。2.2在畜牧獸醫(yī)中的應用

2.2.1應用472.3在醫(yī)學領域中的應用

2.3.l建立診斷和治療人類疾病的動物模型。目前，遺傳學家可以通過精確地失活某些基因或增強某些基因的表達來制作各種各樣的研究人類疾病的動物模型，也可以為研究諸如AIDS這樣的疾病提供合適的動物模型。2.3.2用于生產(chǎn)藥用蛋白

目前，把轉(zhuǎn)基因動物當作生物反應器來生產(chǎn)藥用蛋白已經(jīng)受到國際社會的極大關注。2.3.3生產(chǎn)可用于人體器官移植的動物器官2.3.4借助轉(zhuǎn)基因動物模型開展人類疾病的基因治療。2.3在醫(yī)學領域中的應用

2.3.l建立診斷489.2.7轉(zhuǎn)基因的應用

存在的問題及展望

3.l轉(zhuǎn)基因表達水平低，許多轉(zhuǎn)基因的表達強烈地位受著其宿主染色體上整合位點的影響，大部分轉(zhuǎn)基因表達水平極低，極少部分基因表達水平過高。

3.2難以控制轉(zhuǎn)基因在宿主基因組中的行為，轉(zhuǎn)基因隨機整合于動物的基因組中，可能會引起宿生細胞染色體的插入突變，還會造成插入位點的基因片段丟失，插入位點周圍序列的倍增及基因的轉(zhuǎn)移，也可能激活正常狀態(tài)下處于關閉狀態(tài)的基因。

3.3難以全面掌握基因的表達和所受的調(diào)控。不了解哪些基因控制多數(shù)生理過程，不了解基因表達的發(fā)育控制和組織特異性控制的機制。

3.4制作轉(zhuǎn)基因動物的效率低，這是目前幾乎所有從事轉(zhuǎn)基因動物研究的實驗室都面臨的問題，也是制約著這項技術廣泛應用的關鍵。

3.5對傳統(tǒng)倫理是一種挑戰(zhàn)，對人類的生存有一定的負面作用等。

9.2.7轉(zhuǎn)基因的應用

存在的問題及展望3.l轉(zhuǎn)基因表49外源基因整合方式基因隨機插入；基因剔除；基因替換；后二者合稱基因打靶。外源基因整合方式基因隨機插入；50基因隨機插入外源基因插入時,需要限制性核酸內(nèi)切酶去切宿主的基因,而限制性核酸內(nèi)切酶可以識別特定的核酸序列并在特定的位點切開,而宿主的基因里又不止一段這樣的核酸序列,所以會切出多個切段出來,所以是隨機的?；螂S機插入外源基因插入時,需要限制性核酸內(nèi)切酶去切宿主的基51基因剔除（geneknock-out），是指對一個結構已知但功能未知的基因，從分子水平上設計實驗，將該基因去除，或用其它順序相近基因取代，然后從整體觀察實驗動物，推測相應基因的功能。基因剔除（geneknock-out），是指對一個結構已知52基因敲除的基本程序打靶載體的構建打靶載體導入ES細胞：重組置換基因敲除ES細胞注射入胚泡胚泡植入假孕小鼠的子宮中嵌合體的雜交育種基因敲除的基本程序打靶載體的構建53轉(zhuǎn)基因動物與動物生物反應器課件54基因替換（基因敲入）（geneknockin）是利用基因同源重組，將有功能的外源基因（基因組原先不存在、或已失活的基因），轉(zhuǎn)入受體細胞，與基因組中的同源序列進行同源重組，進而插入到基因組中，在細胞內(nèi)獲得表達的技術?；蛱鎿Q（基因敲入）（geneknockin）是利用基因559.3動物乳腺生物反應器將所需目的基因構建入載體，加上適當?shù)恼{(diào)控序列，轉(zhuǎn)入動物胚胎細胞，使轉(zhuǎn)基因動物分泌的乳汁中含有所需要藥用蛋白。生物反應器：目的基因可在器官組織中表達的轉(zhuǎn)基因生物。按照器官分為：乳腺，膀胱，血液等生物反應器。9.3動物乳腺生物反應器將所需目的基因構建入載體，加上適當569.3.1動物乳腺生物反應器的制備1.構建表達載體；2.選擇目的基因；3.重組基因構建；4.重組基因轉(zhuǎn)導受精卵；5.轉(zhuǎn)基因胚胎移植；6.轉(zhuǎn)基因子代母畜及乳腺分泌物的鑒定。9.3.1動物乳腺生物反應器的制備1.構建表達載體；579.3.2動物乳腺生物反應器的優(yōu)點1.產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定；2.成本低；3.研發(fā)周期短；4.環(huán)保，無污染；5.效益高9.3.2動物乳腺生物反應器的優(yōu)點1.產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定；589.3.3動物乳腺生物反應器的應用1.改良奶源品質(zhì)目前，已克隆并用作構建載體的乳蛋白基因主要有-乳球蛋白（BLG）基因、s1-酪蛋白基因、-酪蛋白基因、乳清酸蛋白（WAP）以及乳清蛋白基因。

2003年，Brophy等通過共轉(zhuǎn)染和嘌呤霉素篩選向牛胎兒成纖維細胞引入-s蛋白基因和-酪蛋白基因的多量拷貝，而后進行核移植生產(chǎn)出了8頭轉(zhuǎn)基因奶牛，其產(chǎn)奶中酪蛋白總量較普通奶高30%。這種奶的蛋白和鈣含量提高，熱穩(wěn)定性增強而乳糜顆粒變小，其營養(yǎng)價值更高，也更適于奶酪生產(chǎn)

9.3.3動物乳腺生物反應器的應用1.改良奶源品質(zhì)592.生產(chǎn)藥用蛋白重組人抗凝血酶：世界上第一個動物乳腺生物反映器重組蛋白藥物。主要成分-重組人抗凝血酶，具有抑制血液中凝血酶活性，預防和治療急慢性血栓血塞形成，對治療抗凝血酶缺失癥有顯著效果。據(jù)美國權威機構預測，到2010年，轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)的重組蛋白產(chǎn)品銷售額將達到350億美元，生產(chǎn)的藥物將占整個基因工程藥物種類的90%以上。2.生產(chǎn)藥用蛋白重組人抗凝血酶：世界上第一個動物乳腺生物反609.3.4動物乳腺生物反應器存在的問題1.外源基因在動物體內(nèi)的位點整合問題；2.乳蛋白基因表達組織特異性問題；3.目的蛋白的翻譯后修飾問題；4.轉(zhuǎn)基因表達產(chǎn)物的分離和純化問題；5.轉(zhuǎn)基因的技術與方法問題；6.倫理道德問題。9.3.4動物乳腺生物反應器存在的問題1.外源基因在動物體61思考題課后。Theendofthischapter.

思考題課后。62第9章轉(zhuǎn)基因動物

與動物生物反應器TransgenicAnimal＆AnimalBioreactor第9章轉(zhuǎn)基因動物

與動物生物反應器TransgenicA63學習須知主要內(nèi)容：動物轉(zhuǎn)基因技術及其應用重點：常用的轉(zhuǎn)基因動物培育技術學習須知主要內(nèi)容：動物轉(zhuǎn)基因技術及其應用64章節(jié)內(nèi)容前言9.1轉(zhuǎn)基因動物的培育技術9.2轉(zhuǎn)基因動物的應用9.3動物乳腺生物反應器章節(jié)內(nèi)容前言65轉(zhuǎn)基因動物

TransgenicAnimal轉(zhuǎn)基因動物

TransgenicAnimal66前言在基因組內(nèi)穩(wěn)定地整合了以實驗方法導入的外源基因，并且外源基因可以穩(wěn)定地遺傳給后代的遺傳工程動物。或者是指借助基因工程技術把外源基因?qū)胧荏w動物的染色體內(nèi)，外源基因可在受體內(nèi)穩(wěn)定遺傳的動物。前言在基因組內(nèi)穩(wěn)定地整合了以實驗方法導入的外源基因，并67轉(zhuǎn)基因動物的研究歷史：1974年，美國學者Jaenisch首次應用顯微鏡注射法獲得轉(zhuǎn)基因小鼠。

1981年，美國科學家成功地將外源基因?qū)雱游锱咛?，?chuàng)立了轉(zhuǎn)基因動物技術。1982年獲得轉(zhuǎn)基因小鼠。

1987年，世界上第一只商業(yè)化轉(zhuǎn)基因綿羊在英國著名的羅斯林研究所誕生。這只轉(zhuǎn)基因母羊的乳汁中可以分泌α—抗胰蛋白酶，含量高達30毫克/升。

1989年，意大利學者用精子作為載體轉(zhuǎn)移目的基因，成功地獲得了純系轉(zhuǎn)基因小鼠。

1997年10月，英國羅斯林研究所（Roslin）宣布已成功克隆出3只攜帶有人凝血因子Ⅸ基因轉(zhuǎn)染綿羊。

1999年2月，上海遺傳研究所宣布轉(zhuǎn)基因試管?！疤咸稀闭Q生，其體內(nèi)被檢測到帶有人的血清白蛋白基因，這項成果被評為當年“中國十大科技進展”之一。轉(zhuǎn)基因動物的研究歷史：1974年，美國學者Jaenisch首689.1轉(zhuǎn)基因動物的培育技術常用的轉(zhuǎn)基因動物培育技術有：9.1.1基因顯微注射法9.1.2逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法9.1.3胚胎干細胞介入法9.1.4精子載體導入法9.1.5YAC介導法9.1.6細胞核移植技術9.1轉(zhuǎn)基因動物的培育技術常用的轉(zhuǎn)基因動物培育技術有：699.1.1基因顯微注射法原理通過顯微注射儀把外源基因直接注射到受精卵的雄性原核內(nèi)部，并使之整合到基因組DNA中，獲得轉(zhuǎn)基因動物。9.1.1基因顯微注射法原理709.1.1基因顯微注射法以轉(zhuǎn)基因小鼠的培育為例：1.目的基因的制備與純化；2.卵供體母鼠和假孕母鼠的準備；3.供體母鼠超數(shù)排卵處理；4.供體母鼠與公鼠交配；5.受精卵采集；6.目的基因顯微注射；7.受精卵移植；8.目的基因表達鑒定和檢測；9.建立遺傳基因小鼠近交系。9.1.1基因顯微注射法以轉(zhuǎn)基因小鼠的培育為例：711.目的基因的制備與純化；目的基因的來源：內(nèi)切酶的酶切片段；cDNA;人工合成基因片段；PCR擴增特異片段。1.目的基因的制備與純化；目的基因的來源：722.卵供體母鼠和假孕母鼠的準備；將輸精管結扎后絕育的雄鼠交配可育雌鼠，剌激雌鼠產(chǎn)生一系列一系列妊娠變化反應而得到假孕母鼠，做為受精卵轉(zhuǎn)基因后的養(yǎng)母。2.卵供體母鼠和假孕母鼠的準備；將輸精管結扎后絕育的雄鼠交733.供體母鼠超數(shù)排卵處理；向可育雌鼠注射孕馬血清取絨毛膜促性腺激素（PMSG）以及人絨毛膜促性腺激素(HCG)促使其超排卵。3.供體母鼠超數(shù)排卵處理；向可育雌鼠注射孕馬血清取絨毛膜促性744.供體母鼠與公鼠交配；超排卵處理后，供體母鼠與可育雄鼠交配。4.供體母鼠與公鼠交配；超排卵處理后，供體母鼠與可育雄鼠交755.受精卵采集；交配次日，剖腹從供體母鼠的輸卵管內(nèi)收集受精卵，CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)液保存?zhèn)溆谩?.受精卵采集；交配次日，剖腹從供體母鼠的輸卵管內(nèi)收集受精766.目的基因顯微注射；用顯微注射裝置將目的基因溶液導入受精卵雄性原核內(nèi)。6.目的基因顯微注射；用顯微注射裝置將目的基因溶液導入受精77顯微注射的機理受精卵1個小時之內(nèi)，精子與卵子各自形成自己的原核，不融合，隨著時間的推移，雄原核開始膨大。注射針要插入雄原核內(nèi)。首先將受精卵置于培養(yǎng)基的液滴內(nèi)，用吸持針找到受精卵并吸持住，調(diào)整雄原核的位置。將注射針裝好DNA溶液，通過調(diào)節(jié)注射管，慢慢將DNA溶液注射進入雄原核內(nèi)。顯微注射的機理受精卵1個小時之內(nèi)，精子與卵子各自形成自己的原787.受精卵移植將已轉(zhuǎn)入基因的受精卵先體外培育，從單細胞到桑葚胚階段，自假孕母鼠的背部植入其輸卵管內(nèi)，使胚胎在養(yǎng)母體內(nèi)發(fā)育成熟。7.受精卵移植將已轉(zhuǎn)入基因的受精卵先體外培育，從單細胞到桑798.目的基因表達鑒定和檢測①幼鼠發(fā)生斷乳后自尾部提取DNA，與目的基因探針作分子雜交（southern），鑒定外源基因是否整合，有整合的鼠稱為首建鼠（founder）（半合子：目的基因整合在二倍體動物的其中一條染色體上

）；②檢測：通過northern(RNA)andwestern(Pr)雜交在轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)水平上檢測表達。8.目的基因表達鑒定和檢測①幼鼠發(fā)生斷乳后自尾部提取DNA809.建立遺傳基因小鼠近交系。首建鼠(半合子)與正常的野生型小鼠雜交，檢測后代的整合率，取后代有50%機率帶有整合基因的小鼠(陽性)，近親繁殖，再通過同一窩的陽性雌雄小鼠(兄妹)交配，在基因的同源重組作用下，最終得到純合子小鼠。9.建立遺傳基因小鼠近交系。首建鼠(半合子)與正常的野生型81轉(zhuǎn)基因動物與動物生物反應器課件82轉(zhuǎn)基因動物的一般制備過程轉(zhuǎn)基因動物的一般制備過程83轉(zhuǎn)基因動物的一般制備過程（續(xù)）轉(zhuǎn)基因動物的一般制備過程（續(xù)）84轉(zhuǎn)基因動物的一般制備過程轉(zhuǎn)基因動物的一般制備過程85顯微注射法優(yōu)點：外源基因的導入整合效率較高，不需要載體，直接轉(zhuǎn)移目的基因，目的基因的長度可>100Kb。它可以直接獲得純系，實驗周期短。顯微注射法不足點：外源基因整合的效率低，不能控制整合的位點，外源基因隨機結合或隨機插入位點，有插入突變的風險，而且整合的拷貝數(shù)未知，方法較復雜，技術性強，設備昂貴等，基因穩(wěn)定耗時較長，效率低。顯微注射法優(yōu)點：86轉(zhuǎn)基因動物與動物生物反應器課件879.1.2逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法1.原理：將目的基因重組到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體上，制成高濃度的病毒顆粒，人為感染著床前或著床后的胚胎，也可以直接將胚胎與能釋放逆轉(zhuǎn)錄病毒的單層培養(yǎng)細胞共孵育以達到感染的目的，通過病毒將外源目的基因插入整合到宿主基因組DNA中去。9.1.2逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法1.原理：882.流程（1）構建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體；（2）包裝細胞；（3）重組病毒感染早期胚胎；2.流程（1）構建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體；89（1）構建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體步驟：病毒DNA提?。徊《綝NA克隆到載體；外源目的基因克隆到載體。（1）構建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體步驟：90（2）包裝細胞包裝細胞是通過基因工程技術對細胞進行修飾，使其產(chǎn)生病毒結構基因所編碼的蛋白，為逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包裝成為重組病毒提供全面的病毒蛋白，同時，該包裝細胞并不能轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生編碼完整病毒的基因組RNA。載體轉(zhuǎn)染包裝細胞，逆轉(zhuǎn)錄酶催化下，載體DNA轉(zhuǎn)錄為RNA，包裝細胞表達產(chǎn)生病毒蛋白，此RNA和病毒蛋白組裝為具有感染性的重組病毒顆粒（位于包裝細胞內(nèi)）。（2）包裝細胞包裝細胞是通過基因工程技術對細胞進行修飾，使其91轉(zhuǎn)基因動物與動物生物反應器課件92（3）重組病毒感染早期胚胎；程序：取出受精卵；去除卵外的透明帶；包裝細胞（含重組病毒）與受精卵共培養(yǎng)(轉(zhuǎn)染)

；轉(zhuǎn)染后的胚胎移植到假孕母鼠體內(nèi)；轉(zhuǎn)基因仔鼠的篩選鑒定（3）重組病毒感染早期胚胎；程序：93逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法的優(yōu)缺點優(yōu)點：感染效率高；缺點：被導入的外源基因大小受限；感染后引起的安全性存在不確定性。逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法的優(yōu)缺點優(yōu)點：949.1.3胚胎干細胞介導法1.原理外源DNA導入體外培養(yǎng)的ES細胞，把轉(zhuǎn)基因的ES細胞注入受體囊胚并使其分化，再將此囊胚移植到假孕動物體內(nèi)，產(chǎn)生子代，子代再經(jīng)過全同胞兄妹交配，獲得轉(zhuǎn)基因純合體。9.1.3胚胎干細胞介導法1.原理95流程分離培養(yǎng)ES細胞；外源基因?qū)隕S細胞；囊胚期胚胎獲得；通過顯微操作，把ES細胞注射到胚胎的囊胚腔，形成嵌合體；轉(zhuǎn)基因胚胎移植到假孕母鼠體內(nèi)；產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠。流程分離培養(yǎng)ES細胞；96轉(zhuǎn)基因動物與動物生物反應器課件97轉(zhuǎn)基因動物與動物生物反應器課件98胚胎干細胞介導法的優(yōu)缺點優(yōu)點：在將胚胎干細胞植入胚胎前，可以在體外選擇特殊的基因型；用外源DNA轉(zhuǎn)染以后，胚胎干細胞可以被克隆，繼而可以篩選含有整合外源DNA的細胞用于細胞融合，由此可以得到很多遺傳上相同的轉(zhuǎn)基因動物。缺點：許多嵌合體轉(zhuǎn)基因動物生殖細胞內(nèi)不含有轉(zhuǎn)基因。

胚胎干細胞介導法的優(yōu)缺點優(yōu)點：999.1.4精子載體導入法1.原理：將成熟的精子與外源DNA進行預培養(yǎng)之后，使攜帶外源DNA的精子與卵子結合為受精卵，并使外源DNA整合于合子的染色體中。2.精子攜帶DNA主要是通過三種途徑來完成，即將外源DNA與精子共孵育、電穿孔導入法和脂質(zhì)體傳染法

9.1.4精子載體導入法1.原理：100程序外源基因?qū)刖樱晦D(zhuǎn)基因精子與卵子結合（通過人工受精，體外受精等）；受精卵移植到假孕動物體內(nèi)，產(chǎn)生子代，子代再經(jīng)過全同胞兄妹交配，獲得轉(zhuǎn)基因純合體。程序外源基因?qū)刖樱?01精子介導方法的優(yōu)缺點優(yōu)點：方法簡單、方便，成本小，依靠生理受精過程，免去了原核的損傷。缺點：成功率不高,效果不穩(wěn)定。精子介導方法的優(yōu)缺點優(yōu)點：1029.1.5酵母人工染色體(YAC)介導法ES細胞轉(zhuǎn)染YAC后體外篩選，所得陽性ES細胞囊胚腔注射；YAC的原核顯微注射兩種途徑。9.1.5酵母人工染色體(YAC)介導法103利用YAC轉(zhuǎn)基因動物研究的優(yōu)勢在于保證巨大基因的完整性及所有順式因子的完整并與結構基因的位置關系不變，且較大的外源基因片段在轉(zhuǎn)基因動物研究時整合率提高，便于研究。利用YAC轉(zhuǎn)基因動物研究的優(yōu)勢在于保證巨大基因的完整性及所有1049.1.6細胞核移植技術1.原理轉(zhuǎn)基因技術與核移植技術結合。9.1.6細胞核移植技術1.原理1052.程序外源基因轉(zhuǎn)染動物細胞；篩選整合有外源基因的體細胞作為核供體；轉(zhuǎn)基因供體核移植到去核卵母細胞；被激活的轉(zhuǎn)基因卵母細胞體外培養(yǎng)至囊胚；囊胚移植到假孕母體，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因幼子。2.程序外源基因轉(zhuǎn)染動物細胞；1063.該技術的優(yōu)缺點優(yōu)點：后代全為轉(zhuǎn)基因個體，遺傳背景和遺傳穩(wěn)定性一致；僅需一代即可建立轉(zhuǎn)基因群體，節(jié)約時間和物力。缺點：技術不夠完善，成功率低；后代可能出現(xiàn)老化現(xiàn)象。3.該技術的優(yōu)缺點優(yōu)點：后代全為轉(zhuǎn)基因個體，遺傳背景和遺傳1079.2轉(zhuǎn)基因動物的應用2.1在基礎理論方面的應用2.1.1可以對基因的結構和功能進行研究2.1.2可以進行組織表達特異性研究2.1.3還可以研究發(fā)育過程的特異性表達。將不同的外源基因轉(zhuǎn)入宿主動物受精卵或早期胚胎干細胞，可觀察研究目的基因在胚胎不同發(fā)育階段的特異性表達、閉關及調(diào)控機理。9.2轉(zhuǎn)基因動物的應用2.1在基礎理論方面的應用1082.2在畜牧獸醫(yī)中的應用

2.2.1應用于動物抗病育種轉(zhuǎn)基因技術可以用于動物抗病育種，不僅可以加速改良的進程，使選擇的效率提高，改良的機會增多，并且不會受到有性繁殖的限制.2.2.2應用于動物生產(chǎn)通過轉(zhuǎn)基因技術，可以促進動物生長、提高畜產(chǎn)品產(chǎn)量、改善品質(zhì)。2.2在畜牧獸醫(yī)中的應用

2.2.1應用1092.3在醫(yī)學領域中的應用

2.3.l建立診斷和治療人類疾病的動物模型。目前，遺傳學家可以通過精確地失活某些基因或增強某些基因的表達來制作各種各樣的研究人類疾病的動物模型，也可以為研究諸如AIDS這樣的疾病提供合適的動物模型。2.3.2用于生產(chǎn)藥用蛋白

目前，把轉(zhuǎn)基因動物當作生物反應器來生產(chǎn)藥用蛋白已經(jīng)受到國際社會的極大關注。2.3.3生產(chǎn)可用于人體器官移植的動物器官2.3.4借助轉(zhuǎn)基因動物模型開展人類疾病的基因治療。2.3在醫(yī)學領域中的應用

2.3.l建立診斷1109.2.7轉(zhuǎn)基因的應用

存在的問題及展望

3.l轉(zhuǎn)基因表達水平低，許多轉(zhuǎn)基因的表達強烈地位受著其宿主染色體上整合位點的影響，大部分轉(zhuǎn)基因表達水平極低，極少部分基因表達水平過高。

3.2難以控制轉(zhuǎn)基因在宿主基因組中的行為，轉(zhuǎn)基因隨機整合于動物的基因組中，可能會引起宿生細胞染色體的插入突變，還會造成插入位點的基因片段丟失，插入位點周圍序列的倍增及基因的轉(zhuǎn)移，也可能激活正常狀態(tài)下處于關閉狀態(tài)的基因。

3.3難以全面掌握基因的表達和所受的調(diào)控。不了解哪些基因控制多數(shù)生理過程，不了解基因表達的發(fā)育控制和組織特異性控制的機制。

3.4制作轉(zhuǎn)基因動物的效率低，這是目前幾乎所有從事轉(zhuǎn)基因動物研究的實驗室都面臨的問題，也是制約著這項技術廣泛應用的關鍵。

3.5對傳統(tǒng)倫理是一種挑戰(zhàn)，對人類的生存有一定的負面作用等。

9.2.7轉(zhuǎn)基因的應用

存在的問題及展望3.l轉(zhuǎn)基因表111外源基因整合方式基因隨機插入；基因剔除；基因替換；后二者合稱基因打靶。外源基因整合方式基因隨機插入；112基因隨機插入外源基因插入時,需要限制性核酸內(nèi)切酶去切宿主的基因,而限制性核酸內(nèi)切酶可以識別特定的核酸序列并在特定的位點切開,而宿主的基因里又不止一段這樣的核酸序列,所以會切出多個切段出來,所以是隨機的?；螂S機插入外源基因插入時,需要限制性核