熒光顯示細(xì)胞器和細(xì)胞凋亡

關(guān)于熒光顯示細(xì)胞器和細(xì)胞凋亡第1頁(yè)，共25頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)54分，星期六膜相結(jié)構(gòu)細(xì)胞膜核被膜線粒體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)高爾基體溶酶體過(guò)氧化物酶體非膜相結(jié)構(gòu)細(xì)胞骨架微管微絲中間纖維核骨架，核纖層細(xì)胞結(jié)構(gòu)染色質(zhì)，染色體，核仁，核糖體第2頁(yè)，共25頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)54分，星期六4人一組細(xì)胞核的熒光顯示P60-62線粒體的熒光標(biāo)記P70內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的熒光標(biāo)記P64-67細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察第3頁(yè)，共25頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)54分，星期六常用熒光染料的激發(fā)及發(fā)射波長(zhǎng)

FluorescentDye

Excitation（激發(fā)頻譜，nm）

Emission（發(fā)射頻譜，nm）

Cy2TM

489

506

GFP(RedShifted)

488

507

YO-PROTM-1

491

509

YOYOTM-1

491

509

Calcein

494

517

FITC

494

518

FluorXTM

494

519

AlexaTM488

490

520

Rhodamine110

496

520

ABI,5-FAM

494

522

OregonGreenTM500

503

522

OregonGreenTM488

496

524

RlboGreenTM

500

525

RhodamineGreenTM

502

527

Rhodamine123

507

529

MagnesiumGreenTM

506

531

CalciumGreenTM

506

533

TO-PROTM-1

514

533

TOTO?-1

514

533

ABI,JOE

520

548第4頁(yè)，共25頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)54分，星期六FluorescentDye

Excitation（激發(fā)頻譜，nm）

Emission（發(fā)射頻譜，nm）BODIPY?530/550

530

550

Dil

549

565

BODIPY?TMR

542

568

BODIPY?558/568

558

568

BODIPY?564/570

564

570

Cy3TM

550

570

TRITC

547

572

MagnesiumOrangeTM

550

575

Phycoerythrin,R&B

565

575

RhodaminePhalloidin

550

575

CalciumOrangeTM

549

576

PyroninY

555

580

RhodamineB

555

580

RhodamineRedTM

570

590

Cy3.5TM

581

596

ABI,ROX

588

608

CalciumCrimsonTM

590

615第5頁(yè)，共25頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)54分，星期六FluorescentDye

Excitation（激發(fā)頻譜，nm）

Emission（發(fā)射頻譜，nm）

TexasRed?

595

615

NileRed

549

628

YO-PROTM-3

612

631

YOYOTM-3

612

631

R-Phycocyanin

618

642

C-Phycocyanin

620

648

TO-PROTM-3

642

660

TOTO?-3

642

660

DiDDilC'(5)

644

665

Cy5TM

649

670

Thiadicarbocyanine

651

671

Cy5.5

675

694第6頁(yè)，共25頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)54分，星期六1.細(xì)胞核的熒光顯示P60-62

吖啶橙（AcridineOrange)

吖啶衍生物之一，它既可嵌入DNA雙鏈間與雙鏈DNA結(jié)合，經(jīng)藍(lán)光激發(fā)后發(fā)出亮綠色熒光，又可以靜電堆積的方式與單鏈DNA或RNA的磷酸根結(jié)合，藍(lán)光激發(fā)下發(fā)出橘紅色熒光，從而清晰的顯示DNA,RNA。異染色質(zhì)（核內(nèi)深染）和常染色質(zhì)（核內(nèi)淺染）第7頁(yè)，共25頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)54分，星期六實(shí)驗(yàn)方法:P621.將生長(zhǎng)有培養(yǎng)細(xì)胞的蓋玻片（注意細(xì)胞面向上）置于一次性小培養(yǎng)皿內(nèi)，加入95％乙醇固定15－30分鐘，取出自然干燥；2.加入1％醋酸酸化30秒；3.在蓋玻片標(biāo)本上滴加0.01％吖啶橙染液，染色5－10分鐘；4.去染液，用磷酸緩沖液沖洗1分鐘；5.用1/10氯化鈣分化30秒－3分鐘；6.用PBS漂洗玻片3次，每次數(shù)秒；7.臨時(shí)封片：滴1－2滴PBS于載玻片上，將含細(xì)胞的蓋玻片反扣其上，置熒光顯微鏡下用100X物鏡觀察。第8頁(yè)，共25頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)54分，星期六細(xì)胞核呈綠色（DNA),細(xì)胞質(zhì)呈橙紅色。第9頁(yè)，共25頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)54分，星期六2.線粒體的熒光標(biāo)記P70羅丹明123－－特異性的線粒體熒光染料,是膜電位敏感的陽(yáng)離子熒光素，活細(xì)胞線粒體具有大量質(zhì)子積累造成的外正內(nèi)負(fù)跨膜電位，吸引染料并將它保持在線粒體中,經(jīng)藍(lán)光激發(fā),呈現(xiàn)黃綠色熒光.可作為線粒體膜電位的靈敏指示.羅丹明123結(jié)構(gòu)式第10頁(yè)，共25頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)54分，星期六電子傳遞和氧化磷酸化的偶聯(lián)第11頁(yè)，共25頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)54分，星期六實(shí)驗(yàn)方法:P71取出已培養(yǎng)好細(xì)胞的蓋玻片，用PBS(+)沖洗3次，每次漂洗浸泡2--3分鐘，2.加入羅丹明123標(biāo)記液，37℃培養(yǎng)箱孵育15分鐘，3.吸去標(biāo)記液，PBS液洗3次，每次3--5分鐘，4.臨時(shí)封片：滴1－2滴緩沖液于載玻片上，將含細(xì)胞的蓋玻片反扣其上，置熒光顯微鏡下用100X物鏡觀察。第12頁(yè)，共25頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)54分，星期六細(xì)胞核附近發(fā)綠色熒光的圓形或短桿狀顆粒即為線粒體第13頁(yè)，共25頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)54分，星期六3.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的熒光標(biāo)記P64-671.材料培養(yǎng)細(xì)胞爬片2.試劑儲(chǔ)存液：0.5mg/mLDIO-C6(3)存儲(chǔ)液，4℃避光，標(biāo)記液：2.5ug/mLDIO-C6(3)，

4℃避光。

0.5%戊二醛第14頁(yè)，共25頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)54分，星期六實(shí)驗(yàn)方法:P67取出已培養(yǎng)好細(xì)胞的蓋玻片，用0.5%戊二醛PBS溶液固定細(xì)胞10分鐘，2.吸去固定液，用PBS液洗3次，每次漂洗時(shí)浸泡

3--5分鐘2.滴加DIO-C6(3)熒光染液，室溫染色1分鐘，3.吸去標(biāo)記液，PBS液洗3次，每次5分鐘，4.臨時(shí)封片：滴1－2滴緩沖液于載玻片上，將含細(xì)胞的蓋玻片反扣其上，置熒光顯微鏡下用100X物鏡觀察。第15頁(yè)，共25頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)54分，星期六第16頁(yè)，共25頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)54分，星期六4.細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡（Apoptosis）又稱程序性細(xì)胞死亡（Programmedcelldeath簡(jiǎn)稱PCD），是由基因編程控制的細(xì)胞主動(dòng)參與的自殺過(guò)程，是一種生理性調(diào)節(jié)機(jī)制，與細(xì)胞壞死的死亡機(jī)制是完全不同。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞衰老自然死亡的主要方式之一，在機(jī)體中承擔(dān)著重要的調(diào)控作用。它不僅在維持細(xì)胞群體數(shù)量的穩(wěn)定、胚胎發(fā)育和免疫系統(tǒng)的克隆選擇方面，而且在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、抗腫瘤藥物的治療等方面均具有十分重要的作用。第17頁(yè)，共25頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)54分，星期六第18頁(yè)，共25頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)54分，星期六第19頁(yè)，共25頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)54分，星期六凋亡(Apoptosis)壞死(Necrosis)（1）定義：一種與遺傳機(jī)制有關(guān)的(即由基因調(diào)控的)主動(dòng)的、自發(fā)死亡的方式，無(wú)炎癥反應(yīng)。外在的致?lián)p傷因素作用達(dá)到一定強(qiáng)度，持續(xù)一定時(shí)間后所導(dǎo)致的細(xì)胞死亡（被動(dòng)），有炎癥反應(yīng)。（2）形態(tài)學(xué)觀察

細(xì)胞核：核濃縮、碎裂(染色質(zhì)濃縮→有規(guī)律性、斷裂成核碎片)，有新月形凋亡小體。細(xì)胞器：完整細(xì)胞膜：完好細(xì)胞體積：細(xì)胞濃縮在組織中：常呈單個(gè)細(xì)胞發(fā)生

核溶解(無(wú)規(guī)律的染色質(zhì)團(tuán)塊→溶解)無(wú)規(guī)律性。崩解尚失去完整性細(xì)胞腫脹常成群細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡與壞死的區(qū)別第20頁(yè)，共25頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)54分，星期六（3）、生物化學(xué)檢測(cè)核DNA有規(guī)律斷裂50～300kb/或180bp左右的片斷凝膠電泳：呈梯形條帶(ladder)DAPI螢光染色，片狀、顆粒狀核熒光。流式細(xì)胞儀檢測(cè)：可見(jiàn)亞G1峰(AP峰)

核基因表達(dá)：必須

DNA酶活性：必須蛋白激酶活性：必須細(xì)胞器環(huán)境：Na+/K+泵功能完好

DNA無(wú)規(guī)律地?cái)嗔褩l帶不清（smears）無(wú)顆?；蚱瑺詈藷晒獬霈F(xiàn)無(wú)此峰

——————

功能喪失第21頁(yè)，共25頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)54分，星期六

細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)觀察熒光顯微鏡觀察法－Hoechst33258染色法1.

材料：CHO細(xì)胞2.器材：細(xì)胞培養(yǎng)所需設(shè)備，熒光顯微鏡。

試劑(1)

細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑：放線菌素D5mg粉劑用1mLDMSO（二甲亞風(fēng)）濃度(5mg/mL)充分溶解，分裝-20℃避光保存，(2)Hoechst33258染液：稱取Hoechst332581mg,用20mL蒸餾水溶解，過(guò)濾，4℃避光保存。用時(shí)用蒸餾水10倍稀釋成染色液，pH7.0(3)

固定液：4%多聚甲醛(4)

PBS液第22頁(yè)，共25頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)54分，星期六放線菌素D是一種抗腫瘤