免疫熒光技術(shù)操作步驟

免疫熒光技術(shù)操作步驟免疫熒光技術(shù)操作步驟免疫熒光技術(shù)操作步驟xxx公司免疫熒光技術(shù)操作步驟文件編號：文件日期：修訂次數(shù)：第1.0次更改批準(zhǔn)審核制定方案設(shè)計，管理制度免疫熒光技術(shù)操作步驟直接免疫熒光法測抗原基本原理將熒光素標(biāo)記在相應(yīng)的抗體上，直接與相應(yīng)抗原反應(yīng)。其優(yōu)點(diǎn)是方法簡便、特異性高，非特異性熒光染色少，相對使用標(biāo)記抗體用量偏大。試劑與儀器磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）：L，熒光標(biāo)記的抗體溶液：以L，的PBS進(jìn)行稀釋緩沖甘油：分析純無熒光的甘油9份+碳酸鹽緩沖液1份配制搪瓷桶三只（內(nèi)有L，的PBS1500ml）有蓋搪瓷盒一只（內(nèi)鋪一層浸濕的紗布墊）熒光顯微鏡玻片架濾紙37℃溫箱等。實(shí)驗(yàn)步驟1.滴加L，的PBS于待檢標(biāo)本片上，10min后棄去，使標(biāo)本保持一定濕度。2.滴加適當(dāng)稀釋的熒光標(biāo)記（飽和濃度可以用滴度發(fā)或公式法算出）的抗體溶液，使其完全覆蓋標(biāo)本，置于有蓋搪瓷盒內(nèi)，保溫30min定時間（參考：30min）。3.取出玻片，置玻片架上，先用L，的PBS沖洗后，再按順序過L，的PBS三缸浸泡，每缸3-5min，不時振蕩。4.取出玻片，用濾紙吸去多余水分，但不使標(biāo)本干燥，加一滴緩沖甘油，以蓋玻片覆蓋。5.立即用熒光顯微鏡觀察。觀察標(biāo)本的特異性熒光強(qiáng)度，一般可用“+”表示：（-）無熒光；（±）極弱的可疑熒光；（+）熒光較弱，但清楚可見；（++）熒光明亮；（+++--++++）熒光閃亮。待檢標(biāo)本特異性熒光染色強(qiáng)度達(dá)“++”以上，而各種對照顯示為（±）或（-），即可判定為陽性。注意事項(xiàng)1.對熒光標(biāo)記的抗體的稀釋，要保證抗體的蛋白有一定的濃度，一般稀釋在1：20-100之間，要自行摸索最佳梯度，建立最好的稀釋比例，抗體濃度過低，會導(dǎo)致產(chǎn)生的熒光過弱，影響結(jié)果的觀察。2.染色的溫度和時間需要根據(jù)各種不同的標(biāo)本及抗原而變化，染色時間可以從10min到數(shù)小時，一般30min已足夠。染色溫度多采用室溫（25℃左右），高于37℃可加強(qiáng)染色效果，但對不耐熱的抗原（如流行性乙型腦炎病毒）可采用0-2℃的低溫，延長染色時間。低溫染色過夜較37℃30min效果好的多。3.為了保證熒光染色的正確性，首次試驗(yàn)時需設(shè)置下述對照，以排除某些非特異性熒光染色的干擾。（1）標(biāo)本自發(fā)熒光對照：標(biāo)本加1-2滴L，的PBS。（2）特異性對照（抑制試驗(yàn)）：標(biāo)本加未標(biāo)記的特異性抗體，再加熒光標(biāo)記的特異性抗體。如果標(biāo)本自發(fā)熒光對照和特異性對照呈無熒光或弱熒光，待檢標(biāo)本呈強(qiáng)熒光，則為特異性陽性染色。4.