重點(diǎn)腸道傳染病實(shí)課件

重點(diǎn)腸道傳染病實(shí)驗(yàn)室檢測方法概述襄陽市疾控中心趙耀儒2014/11/21霍亂弧菌培養(yǎng)、分型操作方法。傷寒、副傷寒培養(yǎng)操作方法。細(xì)菌性痢疾（阿米巴痢疾）培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)操作方法。、手足口病實(shí)驗(yàn)操作方法。細(xì)菌藥敏試驗(yàn)微生物標(biāo)本的采集

通常有血液、腦脊液、尿液、傷口的膿液、胸水腹水、糞便、痰液及泌尿生殖系統(tǒng)的分泌物。

1采集的一般原則：a早期采集b

無菌采集注意對(duì)局部及周圍皮膚的消毒。寄生部位采集的標(biāo)本應(yīng)明確目的菌，采用選擇培養(yǎng)基。C

不同菌不同采集方法D

采集適量標(biāo)本，量不應(yīng)過少，注意采集不同時(shí)間不同部位標(biāo)本，要全面。E

安全采集霍亂檢驗(yàn)程序標(biāo)本的采集和送檢分離培養(yǎng)鑒定一、標(biāo)本的采集和送檢

1.標(biāo)本的采集：標(biāo)本采集的好壞，對(duì)整個(gè)檢驗(yàn)工作的質(zhì)量影響很大。糞便標(biāo)本的采集應(yīng)爭取在發(fā)病早期，服用抗菌藥物之前并盡快送到檢驗(yàn)室。標(biāo)本以病人糞便為主。采便方法可用棉拭采取自然排出的新鮮大便，亦可用直腸棉拭或采便管由肛門插入直腸內(nèi)3～5cm處采取。采用后者應(yīng)注意棉拭大小適宜，避免采便量過少。一般要求水樣便采取1～3ml，成形便采取指甲大小的糞量。在某些情況下，病人的嘔吐物、沾染糞便的衣物和尸體的腸內(nèi)容物亦可作為檢材。

2.標(biāo)本的送檢：采得的標(biāo)本應(yīng)立即接種于培養(yǎng)基。劇烈腹瀉病人的水樣便含有大量病菌（106～109/ml），直接分離培養(yǎng)不難檢出陽性。不能立即檢查的，要接種于保存培養(yǎng)基內(nèi)，盡快送往檢驗(yàn)室。送檢標(biāo)本可放入堿性蛋白胨水、文—臘二氏保存液或插入Cary－Blair二氏半固體保存培養(yǎng)基中。后者不僅對(duì)霍亂弧菌，而且對(duì)其它腸道致病菌也有保存作用。標(biāo)本與保存液的比例要適當(dāng)，8～10ml保存液可加入1～3ml液體便或指甲大小的成形便，過多的大便量可降低保存液的pH值。二、分離培養(yǎng)方法

1.直接分離培養(yǎng)：急性期病人水樣大便標(biāo)本在增菌培養(yǎng)的同時(shí)，可取其粘液絮片或用棉拭標(biāo)本直接作分離培養(yǎng)。這不僅能縮短檢出時(shí)間，還可避免標(biāo)本中其他雜菌特別是非O1群霍亂弧菌經(jīng)增菌后大量繁殖而影響O1群霍亂弧菌的分離分離培養(yǎng)基有選擇性強(qiáng)、弱之不同。選擇性強(qiáng)的培養(yǎng)基常用的慶大霉素瓊脂和4號(hào)瓊脂等；選擇性弱的有堿性瓊脂和堿性膽鹽瓊脂等。培養(yǎng)基的使用，可根據(jù)當(dāng)?shù)鼐唧w情況和各檢驗(yàn)室的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)來選擇。近年的趨勢是使用堿性蛋白胨水增菌，再用強(qiáng)選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行分離。瓊脂平皿應(yīng)新鮮配置，接種前培養(yǎng)基表面適當(dāng)烘干。劃線培養(yǎng)應(yīng)掌握能分離出盡量多的單個(gè)菌落。一般每個(gè)標(biāo)本接種一個(gè)平皿，必要時(shí)一個(gè)標(biāo)本接種強(qiáng)和弱選擇性培養(yǎng)基各一個(gè)。在慶大霉素瓊脂平皿上，腸內(nèi)細(xì)菌和革蘭氏陽性菌的生長受到顯著抑制?；【L快、菌落大，培養(yǎng)4～5小時(shí)，原劃線處有菌臺(tái)生長，8～10小時(shí)可長出小菌落，16小時(shí)菌落直徑可達(dá)2mm。菌落弱帶灰色、半透明、扁平、稍隆起、光滑濕潤，培養(yǎng)時(shí)間延長或室溫放置后，菌落略帶黃色，中心厚而周圍透明，培養(yǎng)基含亞碲酸鉀時(shí)菌落呈灰色，中心形成黑色金屬碲沉淀。在堿性瓊脂平皿上弧菌生長也較快，菌落較透明。在這些平皿上挑取菌落做玻片凝集容易形成懸液，凝集狀態(tài)良好。三、鑒定鑒定標(biāo)準(zhǔn)以血清學(xué)性狀為主，結(jié)合形態(tài)學(xué)和生化學(xué)性狀作出判定。血清學(xué)性狀以玻片凝集實(shí)驗(yàn)為主，可疑菌落先用O1群或/和O139群霍亂弧菌診斷血清作檢查。有的標(biāo)本可能同時(shí)存在非O1群/非O139群霍亂弧菌，因此，可疑菌落較多時(shí)，應(yīng)挑選5個(gè)以上的菌落逐個(gè)進(jìn)行玻片凝集檢查。必要時(shí)，取原劃線菌苔邊緣透明部分再做玻片凝集。這對(duì)一次流行的首批病人進(jìn)行檢查時(shí)尤應(yīng)注意。此外，平皿分離未獲分散的單個(gè)菌落，而在密集部位仍有可疑菌落時(shí)，應(yīng)將該部分再做或經(jīng)增菌后再做分離。有時(shí)從恢復(fù)期病人分離出菌落典型但不凝集的弧菌，這時(shí)應(yīng)以霍亂粗糙型血清作玻片凝集，檢查是否為本菌的粗糙型。二、分離培養(yǎng)1、血標(biāo)本取病人靜脈血5毫升加入約10倍量的葡萄糖膽鹽肉湯中，37℃培養(yǎng)，逐日觀察結(jié)果。如出現(xiàn)混濁即可用血瓊脂或SS、麥康凱瓊脂進(jìn)行分離培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)18一24小時(shí)，挑取疑菌落作進(jìn)一步鑒定。一般增菌1一2天陽性率高，如至第7天培養(yǎng)物仍清澈透明，經(jīng)接種培養(yǎng)仍無菌生長，則可判為陰性。2、糞便標(biāo)本（1）直接分離培養(yǎng)將標(biāo)本接種到SS和麥康凱瓊脂上，37℃培養(yǎng)18一24小時(shí)，挑取可疑菌落進(jìn)行鑒定。（2）增菌培養(yǎng)將標(biāo)本乳化后接種在改良的亞硒酸氫鈉甘露醇（SFM）增菌培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)15一18小時(shí)后，再接種到SS和麥康凱瓊脂上，37℃培養(yǎng)18一24小時(shí)后，挑取可疑菌落。3、尿、膽汁、骨髓標(biāo)本取患者尿或膽汁經(jīng)離心后的沉淀物或骨髓液，作直接分離或增菌分離培養(yǎng)，方法與糞便標(biāo)本分離培養(yǎng)方法相同。三、鑒定

1、初步生化鑒定

挑取上述分離培養(yǎng)基上無色、透明或半透明的可疑菌落2一3個(gè)，分別接種雙糖鐵斜面（KIA）和動(dòng)力靛基質(zhì)尿素半固體（MIU）各一支，37℃培養(yǎng)18一24小時(shí)，觀察生化反應(yīng)。若符傷寒或副傷寒桿菌生化反時(shí)，則取KIA斜面上菌苔進(jìn)行血清學(xué)鑒定。2、血清學(xué)分型

（1）0血清群別判定初步生化反應(yīng)符合傷寒或甲、乙、丙型副傷寒桿菌時(shí)，先用A－F群沙門氏“0”多價(jià)血清作玻片凝集，以判定其群別。

（2）H抗原判定0抗原判定后，依次用相應(yīng)的H因子血清檢查第一相和第二相抗原與Hd因子血清凝集。

（3）Vi抗原檢查新分離的傷寒桿菌有Vi抗原，能與Vi血清凝集。一、標(biāo)本采集、運(yùn)送、包裝、保存、接收可采用便盒留便、肛拭或采便管采便。便盒留便：留取糞便時(shí)應(yīng)采集新鮮糞便的膿血部分、粘液部分、水樣便或稀便。便量1～5g。

集體腹瀉或食源性暴發(fā)患者糞便采集的數(shù)額，應(yīng)根據(jù)患者人數(shù)的多少，決定采取標(biāo)本的數(shù)量。當(dāng)懷疑患者為菌血癥時(shí)，應(yīng)以無菌操作，從靜脈血管采取10～15mL血液，放入加有EDTA抗凝劑瓶中送檢。所采取的糞便標(biāo)本應(yīng)盡快送檢，不得超過2h送到化驗(yàn)室，否則標(biāo)本應(yīng)放入Cary-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基中，運(yùn)送時(shí)間超過2h者，應(yīng)在冰浴條件下送檢。送交分型分析菌株的接收要求：1)經(jīng)過分純的沒有污染的菌株;2)分離菌株應(yīng)該用甘油半固體保存；3)與分離菌株相對(duì)應(yīng)的患者的臨床癥狀和流行病學(xué)資料；4)經(jīng)血清和生化證實(shí)為志賀菌。痢疾檢驗(yàn)程序二、糞便標(biāo)本志賀菌的分離方法1、分離方法

（1）用接種環(huán)多點(diǎn)沾取標(biāo)本病變部分，直接劃線分離于SS、EMB（或HE、麥康凱）瓊脂平板。37℃培養(yǎng)24h。

（2）血液培養(yǎng)

將采取的抗凝血液標(biāo)本，放入葡萄糖肉湯，37℃培養(yǎng)，逐日觀察結(jié)果。一般1～3d內(nèi)陽性較高。為提高陽性檢出率，可以在標(biāo)本中加入0.5mLOP乳化劑（聚乙二醇辛基苯基醚），使血球溶解，以提高陽性檢出率。

（3）挑選可疑菌落

從37℃培養(yǎng)16～24h的分離培養(yǎng)基上，觀察挑選可疑菌落，其形態(tài)為無色，半透明，圓形，濕潤、光滑、突起，大小為1～2mm；挑選可疑菌落，接種TSI和葡萄糖半固體或綜合培養(yǎng)基，先劃線后穿刺，做好標(biāo)記，放37℃培養(yǎng)16h以上，觀察結(jié)果

腸出血性大腸桿菌O157：H7的檢驗(yàn)程序糞便或其它標(biāo)本

增菌6小時(shí)左右

磁珠濃縮

山梨醇—麥康凱培養(yǎng)基培養(yǎng)18-24小時(shí)

可疑菌落

革蘭氏生化血清學(xué)毒力因子染色反應(yīng)鑒定鑒定*根據(jù)結(jié)果判定*有條件的單位可進(jìn)行如用PCR檢測SLT1、SLT2、Hly、EAE的基因【注】1、培養(yǎng)及增菌均在37℃進(jìn)行；2、山梨醇-麥康凱培養(yǎng)基中應(yīng)加入適當(dāng)?shù)囊志鷦?、“科瑪嘉”培養(yǎng)基加入亞碲酸鉀后選擇效果更好；4、在SMAC中加入下列抑制劑的一種均可增加培養(yǎng)基的選擇性；1）亞碲酸鉀2.5mg/l和先鋒霉素類抗生素Cefixime0.05mg/l；2）新生霉素10mg/l；3）萬古霉素40mg/l；5、在科瑪嘉或S--MAC平板上挑選可疑菌落與O157診斷血清、H7血清或O157單克隆抗體作試探性凝集試驗(yàn)，若不凝集，但臨床表現(xiàn)疑為EHEC感染，則應(yīng)做如下處理。因?yàn)閭€(gè)別腸出血性大腸桿菌O157：H7具有K抗原，應(yīng)在生化反應(yīng)確定為大腸桿菌后用生理鹽水制備菌懸液，并100℃水浴加熱10-15分鐘再與O157診斷血清或O157單克隆抗體做凝集試驗(yàn)。6、當(dāng)生化反應(yīng)和血清學(xué)反應(yīng)結(jié)果均與腸出血性大腸桿菌O157：H7符合時(shí)，才能確認(rèn)為腸出血性大腸桿菌O157：H7。7、目前許多國家使用的O157和H7特異性抗體與及少數(shù)細(xì)菌具有不同程度的交叉反應(yīng)，如美國、法國還有我國自己生產(chǎn)的試劑都與弗勞地枸櫞酸桿菌有交叉反應(yīng)，因此，用生化試驗(yàn)確定為大腸桿菌是必須的,最為重要的是硫化氫試驗(yàn)。絕大多數(shù)腸出血性大腸桿菌菌株在24小時(shí)內(nèi)不的發(fā)酵D-山梨醇。但是，也報(bào)道了一些能夠快速發(fā)酵D-山梨醇的菌株。8、典型大腸桿菌的主要生化反應(yīng)結(jié)果如下：1）動(dòng)力試驗(yàn)葡萄糖麥芽糖甘露醇蔗糖硫化氫尿素試驗(yàn)＋＋＋＋+/－－－2）靛基質(zhì)甲基紅V-P試驗(yàn)枸櫞酸鹽苯丙氨酸脫氨酶＋＋－－－3）賴氨酸脫羧酶鳥氨酸脫羧酶氧化酶氰化鉀+/－+/－－－手足口病的實(shí)驗(yàn)室檢測方法

病毒分離采集的樣本經(jīng)過相應(yīng)處理后接種于相應(yīng)細(xì)胞，進(jìn)行腸道病毒的培養(yǎng)，通過觀察細(xì)胞毒性變化來判斷是否感染腸道病毒。

測定人雙份血清標(biāo)本的中和抗體滴度用急性期血清與恢復(fù)期血清滴度進(jìn)行比