感受態(tài)制備和電轉(zhuǎn)化,多種感受態(tài)

一、金黃色葡萄球菌感受態(tài)制備、平板上挑單菌落于TSB液體培養(yǎng)基過(guò)夜，攝氏度搖床。、按接種于2ml:200ml培基培養(yǎng)，2個(gè)50ml管上預(yù)冷℃將培養(yǎng)的菌分裝管離6-8min，去上清。、加0.5M蔗打菌體再0.5M蔗糖混勻離5min去清。、重復(fù)4、再重復(fù)，但加到50ml0.5M蔗糖后要在冰上冰浴30min，再5000rpm離心，去上清。、用600ul0.5M蔗糖垂懸。、分裝菌液，每管。、液氮冷凍，存于-80。二、大腸桿菌感受態(tài)、平板上挑單菌落于LB液培養(yǎng)基過(guò)夜37攝度床。、按接種于2ml:200ml培液體基培養(yǎng)2h（用50ml管OD600=0.4-0.6、冰浴。、℃離，去上清。、加預(yù)0.1mol/l（80mmol/l和MgCl2垂懸，冰上靜置。、2預(yù)（80mmol/lCaCl2和MgCl2垂懸，冰上靜置10min。、分裝每管，于80℃。三、超級(jí)感受態(tài)（一）溶液、TB（1L

終度55mmol/l15mmol/l250mmol/lPIPES(0.5mol/l,ph6.7)20ml10mmol/l補(bǔ)至1L過(guò)濾除菌、PIPES(0.5mol/l,ph6.7),

哌嗪-1,4-二乙磺酸(),≥99.5%英文名稱

：acid溶80ml水KOH調(diào)Ph=6.7容100ml過(guò)除菌-20℃保存。、培基1L胰蛋白胨20g酵母浸粉5g搖動(dòng)容器使質(zhì)完全溶。加／LKCl溶液(將1.86gKCl用100ml去離子水溶解即配成250mmol/l溶液。用調(diào)pH值至7.0。去離子水定容至1L在15／

2

)高壓下蒸滅菌液在使前5ml滅菌的2mol/lMgCl2

22／LMgCl溶液的配制法如下：用90ml去離子水溶19gMgCl，去離子水整體積為2，在15psi(1.05kg)高壓下蒸滅菌20min]。(二、Protocol:、挑單菌落接種形瓶中，25ml或SOB培養(yǎng)基37,培6-8h.三個(gè)1L錐瓶加入250mlSOB培液的別入菌℃培養(yǎng)過(guò)夜、次日早上，測(cè)瓶菌液測(cè)次。、當(dāng)有一瓶菌液0D600=0.55,將該瓶之于冰上10，其余棄掉。、℃離心10min,收菌體。、棄培養(yǎng)液，將離心管倒扣在吸水紙上以吸干剩余液體。用真空吸塵器將貼附于壁上的培養(yǎng)基吸干。、加預(yù)的懸細(xì)菌沉淀,輕輕旋勿渦旋或槍頭吸打。、4離心收菌體。、棄培養(yǎng)液，將離心管倒扣在吸水紙上以吸干剩余液體。用真空吸塵器將貼附于壁上的培養(yǎng)基吸干。1020ml預(yù)的TB重細(xì)菌沉輕旋轉(zhuǎn),勿渦旋或槍頭吸打。11加1.5mlDMSO（DMSO是二甲基亞是一種滲透性護(hù)劑，能降低細(xì)胞點(diǎn)，減少冰晶的形成減輕自由對(duì)細(xì)胞損改變生物膜對(duì)電解質(zhì)藥物毒物和代產(chǎn)物的通性終濃度輕旋轉(zhuǎn)勿渦旋或槍頭打冰上靜置10min12快速懸液分裝到冷卻的無(wú)菌離心管，封緊管口，氮速凍，存℃。四、電轉(zhuǎn)化（一轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞的制用槍頭取單克隆菌落投入盛有10mlLB液培基的50ml離管中做培養(yǎng)基和槍頭的空白對(duì)照）2.37℃，，培養(yǎng)個(gè)小時(shí)。第二天以1100的比例將這10ml菌倒入1000ml液培基中度，振搖時(shí)，每半小時(shí)測(cè)一次，OD達(dá)到0.3-0.4時(shí)停止培養(yǎng)。將菌液冰上預(yù)冷30分隨后將菌液分裝到500ml預(yù)的離心杯中℃離心分鐘。棄上清離心杯中加入少量，沉淀懸浮后，再將水注滿離心杯，℃，4000rpm離心分鐘。棄上清加少量滅菌水，重懸菌體，再將水注滿離心杯4000rpm，4℃離心。棄上清往離心杯中加入少量10%油(滅菌，預(yù)冷)，重懸菌體，再加滿甘油4,離心。棄上清離心杯中加入5ml10%甘油沉懸浮后液300ul/管分裝于1.5ml的離心管中℃箱中保存。同時(shí)100μl感態(tài)加puc18直電穿孔轉(zhuǎn)化，檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率。次日觀察轉(zhuǎn)化子生長(zhǎng)情況，并記錄。（二接物純化．將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至一管，加入下列試:10μlof2μlof3MNaAC（PH5.2）

50μlof無(wú)乙醇輕輕混勻，稍微離心并將其置-20放置時(shí)以上；℃，topSpeed離分鐘；小心移上清，避免接觸到管底的沉淀物；加入0μl70%的乙醇，輕輕顛倒幾次洗滌淀（注：不要離心混勻℃，topSpeed離5分；小心移上清，將此管置空氣中直無(wú)乙醇?xì)馕?；加?0μlddH2O重溶解沉淀，4℃短期保存，-20℃期保存?zhèn)溆?；（三轉(zhuǎn)從℃冰箱中取出感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上解凍；取μl純后的質(zhì)粒于一離心管中將其和0.1CM的極杯一起置于冰上預(yù)冷。將～解的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至此1.5ml的心管中心混勻冰上放置10min。打開(kāi)電儀，調(diào)至Manual，調(diào)節(jié)電壓為2.1KV。將此混物轉(zhuǎn)移至已預(yù)冷的電極杯中，輕輕敲擊電極杯使混合物均勻進(jìn)入電極杯的底部；將電極推入電轉(zhuǎn)化儀，按一下pulse鍵聽(tīng)到蜂鳴聲后，向電擊杯中迅速加入000μl的SOC液培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞后，轉(zhuǎn)移到的心管中。．℃，220－250rpm復(fù)1小。取μl轉(zhuǎn)產(chǎn)加160涂，放于37溫室，過(guò)夜培養(yǎng)，次日查看轉(zhuǎn)化結(jié)果。其余菌液加1：1的30%的甘后混勻℃保存。注：每塊加有Amp的板上均勻涂有X-Galμl，SOC，IPTG20。（四擊清洗流程用清水電擊杯稍沖一下。向電擊中加入的酒精