固體析出沉淀課件

第五章

固相析出分離法通過改變?nèi)芤簵l件，使溶質(zhì)以固體形式從溶液中分出的操作技術(shù)。鹽析法有機(jī)溶劑沉淀法等電點(diǎn)沉淀法結(jié)晶法1第一節(jié)鹽析法

(salt

precipitation)定義：鹽析法是利用各種生物分子在濃鹽溶液中溶解度的差異，通過向溶液中引入一定數(shù)量的中性鹽，使目的物或雜蛋白以沉淀析出，達(dá)到純化目的的方法。優(yōu)點(diǎn)：簡單、經(jīng)濟(jì)、較少變性缺點(diǎn)：分辨率不高，要除鹽220%硫酸銨纖維蛋白28—30%α球蛋白33%-50%β、γ球蛋白大于50%白蛋白3一、基本原理5原理形成離子對，部分中和了蛋白質(zhì)的電性，排斥作用減弱而能相互靠攏，聚集起來。中性鹽的親水性比蛋白質(zhì)大，使蛋白質(zhì)脫去了水化膜，使其沉淀。6在鹽析區(qū)，符合公式logS=-Ks

S——蛋白質(zhì)溶解度，g/L；—鹽離子強(qiáng)度,Ci——i離子濃度，mol/L；Zi——i離子化合價(jià)；——常數(shù),為縱坐標(biāo)上的截距;Ks——鹽析常數(shù)。7、KS為縱坐標(biāo)上的截距，是外推截距，與無機(jī)鹽種類無關(guān)。KS是鹽析常數(shù)，與蛋白質(zhì)和鹽的種類有關(guān)，但與溫度和pH無關(guān)。兩種類型：（1）在一定的pH和溫度下改變離子強(qiáng)度（鹽濃度）進(jìn)行鹽析，稱作Ks鹽析法。（2）在一定離子強(qiáng)度下僅改變pH和溫度進(jìn)行鹽析，稱作β鹽析法。8(二）溶質(zhì)（蛋白質(zhì)等）種類的影響10（三）蛋白質(zhì)濃度的影響蛋白質(zhì)濃度提高，鹽用量減少。

12（五）pH的影響當(dāng)溶液的pH在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)附近時(shí)，值最小。利用值最低點(diǎn)時(shí)pH的不同，可以分級沉淀蛋白質(zhì).14三、鹽析操作

（一）鹽析用鹽的濃度表示固體粉末硫酸銨飽和溶液常用“飽和度”來表征硫酸銨在溶液中的最終濃度，25℃時(shí)(NH4)2SO4的飽和濃度為4.1mol／L，定義它為100%飽和度.15

16（二）鹽析方法和注意事項(xiàng)

1、分部鹽析法2、重復(fù)鹽析法3、反抽提法一定的鹽濃度下將目的蛋白夾帶一定量的雜蛋白一同沉淀。將沉淀用較低濃度鹽溶液平衡，溶出其中的雜蛋白。17分部鹽析法18注意事項(xiàng)“局部過濃”

溫度（室溫）分離方法20第二節(jié)有機(jī)溶劑沉淀

(OrganicSolventPrecipitation)

定義：向水溶液中加入一定量親水性的有機(jī)溶劑，降低溶質(zhì)的溶解度，使其沉淀析出的分離純化方法。21一些溶劑的介電常數(shù)

23二、影響沉淀效果的因素

（一）有機(jī)溶劑種類及用量常用的溶劑有乙醇、丙酮、甲醇等。

（二）pH的影響許多蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)附近時(shí)溶解度最低，溶液pH應(yīng)在等電點(diǎn)附近，還須考慮蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。

25（三）溫度（低溫沉淀）有機(jī)溶劑存在下，大多數(shù)蛋白質(zhì)的溶解度隨溫度降低而顯著地減小。（四）無機(jī)鹽的含量低鹽：有利于沉淀，還有保護(hù)蛋白質(zhì)，防止變性。

高鹽：增大蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑―水溶液中的溶解度，沉淀物中可能夾帶鹽。26

多價(jià)陽離子，如Ca2+、Zn2+能與蛋白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物，使蛋白質(zhì)溶解度降低。

胰島素精制：

27（五）某些金屬離子的助沉淀作用（六）樣品濃度

濃度小時(shí)，增加溶劑投入量和損耗。濃度大時(shí)，增加共沉作用，降低分辨率。蛋白質(zhì)濃度0.5%～2%；粘多糖濃度1%～2%。28胰島素純化：胰島素

pH8

除去堿性雜蛋白

pH3

除去酸性雜蛋白30金屬離子沉淀：與生物分子的酸性功能團(tuán)作用的金屬復(fù)合鹽法；有機(jī)酸類復(fù)合鹽沉淀:與生物分子的堿性功能團(tuán)作用的有機(jī)酸復(fù)合鹽法（如苦味酸鹽、苦酮酸鹽、丹寧酸鹽等）。31二、成鹽沉淀法1．金屬離子沉淀：

Mn2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Zn2+、Ca2+、Ba2+、Mg2+等；

2．生成有機(jī)酸類復(fù)合鹽沉淀（1）丹寧即鞣酸（2）雷凡諾（3）三氯乙酸（TCA）32

雷凡諾

33豬心提取液洗脫液上清液上清細(xì)胞色素C

沉淀（去除）34吸附人造沸石鹽析45%飽和硫酸銨沉淀TCA透析三、親和沉淀

利用親和反應(yīng)原理，將配基與可溶性的載體偶聯(lián)后形成載體-配基復(fù)合物（親和沉淀劑），該復(fù)合物可選擇性地與蛋白質(zhì)結(jié)合，在一定條件下沉淀出來。中性可溶，酸性沉淀。35

36四、高分子聚合物沉淀水溶性非離子型高分子聚合物，如不同分子量的聚乙二醇（PEG）、葡聚糖、右旋糖苷硫酸酯等，能使蛋白質(zhì)水合作用減弱而發(fā)生沉淀。五、表面活性劑十六烷基三甲基季胺溴化物（CTAB）十六烷基氯化吡啶（CPC）

CTAB[CH3-(CH2)14-CH2-N+(CH3)3Br―]

37}酸性多糖38六、選擇性變性沉淀法熱變性沉淀法酸堿變性沉淀法利用試劑（氯仿）39固相析出分離法第一節(jié)鹽析法第二節(jié)有機(jī)溶劑沉淀第三節(jié)其它沉淀方法40第四節(jié)結(jié)晶(crystallization)

定義：溶液中的溶質(zhì)在一定條件下因分子有規(guī)則的排列而結(jié)合成晶體。

通過結(jié)晶，溶液中的大部分雜質(zhì)會(huì)留在母液中，經(jīng)過濾、洗滌可得到純度高的晶體。

41一、結(jié)晶過程指溶質(zhì)自動(dòng)從過飽和溶液中析出形成新相的過程。C2

—

小晶體的溶解度；C1

—

普通晶體的溶解度；ρ

—

晶體密度；M

—

晶體質(zhì)量；σ—

晶體與溶液間的界面張力；

γ2

—

小晶體的半徑；

γ1

—

普通晶體的半徑；42結(jié)晶包括三個(gè)過程：(1)形成過飽和溶液;(2)晶核形成;(3)晶體生長。43濃度溫度圖44二、過飽和溶液的形成(結(jié)晶方法)（一）、蒸發(fā)法

（二）、溫度誘導(dǎo)法

熱盒技術(shù)（三）、鹽析結(jié)晶法（四）、透析結(jié)晶法（五）、有機(jī)溶劑結(jié)晶法

45溫度誘導(dǎo)法46鹽析結(jié)晶法47透析結(jié)晶法48（六）、等電點(diǎn)法（七）、微量擴(kuò)散法（八）、化學(xué)反應(yīng)結(jié)晶法調(diào)節(jié)溶液的pH或向溶液中加入反應(yīng)劑，生成新物質(zhì)，結(jié)晶析出。（九）、共沸蒸餾結(jié)晶49等電點(diǎn)法50化學(xué)反應(yīng)結(jié)晶法51綜合利用52三、提高晶體質(zhì)量的途徑

工業(yè)上希望得到大而均勻的晶體，便于過濾與洗滌。（一）、晶體大小影響晶體大小的主要因素有過飽和度、溫度、攪拌速度、晶種等。53晶種54（二）、晶體形狀改變晶體外形，可用:選擇不同的溶劑、控制過飽和度、結(jié)晶溫度、調(diào)節(jié)溶液的pH和有目的地加入某種能改變晶形的雜質(zhì)等。（三）、晶體純度晶體表面具有一定的物理吸附能力。重結(jié)晶：即將晶體用合適的溶劑溶解再次結(jié)晶。55谷氨酸（GL