不同類型細胞培養(yǎng)特點課件

第六章

個別細胞和組織的培養(yǎng)第六章

個別細胞和組織的培養(yǎng)1

類型：正常細胞培養(yǎng)腫瘤細胞培養(yǎng)

類型：2第一節(jié)正常細胞培養(yǎng)

正常細胞，在體外培養(yǎng)時都不易生長，建立細胞系更難。正常細胞難培養(yǎng)的原因是它們是分化的細胞，對體外生存條件要求嚴格.但只要一切條件適當(dāng)仍有培養(yǎng)成功可能。第一節(jié)正常細胞培養(yǎng)

正常細胞，在體外培養(yǎng)時都不易生長，建3一、上皮細胞類培養(yǎng)

上皮細胞可來源于外、內(nèi)、中三個胚層；培養(yǎng)中只有源于外和內(nèi)胚層的細胞能反映出上皮細胞的特征，細胞呈膜狀生長的特點。一、上皮細胞類培養(yǎng)

上皮細胞可來源于外、內(nèi)、中三個胚層；4上皮細胞培養(yǎng)有三個難點：①需求特殊底物，如在底物上涂有膠原底層則利于細胞生長；②需求特殊培養(yǎng)基；③與上皮細胞相鄰的成纖維細胞常與上皮細胞同時混雜生長，并常壓過上皮細胞。純化和延長上皮細胞生存期是上皮細胞培養(yǎng)的關(guān)鍵之一。上皮細胞培養(yǎng)有三個難點：5(一)表皮細胞培養(yǎng)1．特點：在有膠原的底物上易生長；把人或小鼠表皮細胞培養(yǎng)在以3T3細胞為飼養(yǎng)層(用射線照射后)上時，細胞易生長并可發(fā)生一定程度的分化現(xiàn)象。降低pH、Ca2+的含量和溫度等，均利于表皮細胞生長。向培養(yǎng)基中加氫化可的松(10μg/m1)、10-6M的異丙基腎上腺素(Isoproterenol)和10ng/m1促表皮生長因子(EGF)能促表皮細胞生長。(一)表皮細胞培養(yǎng)6【飼細胞】飼細胞(FeederCells)也稱滋養(yǎng)細胞，是一層經(jīng)過射線照射或絲裂霉素傷害處理的、用作克隆細胞附著底物的細胞層。飼細胞作用：有同化營養(yǎng)液的能力。飼細胞能促克隆細胞的生長，利于克隆的形成?？寺⌒纬珊箫暭毎麧u死亡，換液時清除?！撅暭毎匡暭毎?FeederCells)也稱滋養(yǎng)細胞，是7飼細胞的制備：(1)取原代培養(yǎng)的人或動物胚胎成纖維細胞，90%匯合時制成細胞懸液，再按103

細胞/毫升重新接種培養(yǎng)；(2)在細胞半?yún)R合時，準備0.25μg/ml的絲裂霉素，按2ug/105細胞的量加入到培養(yǎng)瓶中過夜；或用射線單次照射，劑量30～50戈瑞(Gy)；(3)細胞經(jīng)上述處理后，Hanks液漂洗兩次、更換培養(yǎng)液、再培養(yǎng)24小時，胰蛋白酶消化細胞制成懸液，按5×104/ml接種入新培養(yǎng)基中；(4)48小時后，即可用于細胞克隆之用。飼細胞的制備：82．表皮細胞培養(yǎng)程序：(1)取材：取外科植皮或手術(shù)殘余皮膚小塊，以角化層薄者為佳，早產(chǎn)流產(chǎn)兒皮膚更好，切成0.5~1cm2小塊；(2)EDTA處理：先置入0.02％EDTA中室溫置5分鐘。(3)冷消化：換入0.25%胰蛋白酶中，置4℃過夜；(4)分離：取出皮塊，用血管鉗或鑷子把表皮與真皮層分開；2．表皮細胞培養(yǎng)程序：9(5)溫消化：取出表皮單獨處理；用剪刀剪成更小的塊后，置入新的0.25％胰蛋白酶中，37℃再消化30~60分鐘；(6)制細胞懸液：用吸管輕輕反復(fù)吹打，使成細胞懸液；(7)加培養(yǎng)液：通過80目不銹鋼紗網(wǎng)濾過后，低速離心，吸上清，直接加入Eagle液和20％小牛血清.(8)培養(yǎng)：接種入碟皿中，CO2溫箱培養(yǎng)。(5)溫消化：取出表皮單獨處理；用剪刀剪成更小的塊后，置入10注意事項：冷消化目的在于使表皮和真皮結(jié)合松散；如冷消化后分離下來的表皮膜自身也已松散，此時亦可直接置入PBS中用吸管吹打制備細胞懸液；不再經(jīng)過第二次消化。注意事項：冷消化目的在于使表皮和真皮結(jié)合松散；如冷消化后分離11(二)胃上皮細胞培養(yǎng)

適于胃上皮細胞生長的條件是：①膠原酶和透明質(zhì)酸酶消化法并用消化細胞；②應(yīng)用膠原底物培養(yǎng)；③制備含有特定成分的培養(yǎng)基；(二)胃上皮細胞培養(yǎng)

適于胃上皮細胞生長的條件是：12培養(yǎng)程序：(1)取材：取胃潰瘍或胃癌手術(shù)切除胃標本遠端非病變區(qū)粘膜少許；(2)清洗：用含慶大霉素(400μg/m1)和兩性霉素(2μg/m1的Hanks)液漂洗后，用鈍器剝離下粘膜，剪成1mm大?。?3)消化：在I型膠原酶和透明質(zhì)酸酶中，于37℃中消化80分鐘；(4)離心：收集細胞懸液，800轉(zhuǎn)/分離心后，Hanks液漂洗兩次；培養(yǎng)程序：13(5)接種：末次離心后加入含有1％~2％胎牛血清的完全培養(yǎng)基，接種入不同孔數(shù)的培養(yǎng)板中；接種量依不同實驗?zāi)康亩?。細胞接種后一般在16小時內(nèi)貼壁，細胞呈多角形，成島狀或片狀生長，以后逐漸聯(lián)接成片。初代培養(yǎng)可維持2~3周，第一周末達高峰，最后逐漸衰退剝落。(5)接種：末次離心后加入含有1％~2％胎牛血清的完全14(三)肝細胞培養(yǎng)肝臟具有取材方便和易于生長的優(yōu)點，能獲得典型上皮細胞培養(yǎng)。1．初代組織塊培養(yǎng)：肝組織做組織塊培養(yǎng)效果很好。取新鮮肝臟，先剝除被膜和血管等纖維成分，用刀或剪刀把肝剪成1mm3左右的小塊，采用貼壁培養(yǎng)法。肝組織易于貼壁，生長力好，一般次日即可出現(xiàn)生長暈。(三)肝細胞培養(yǎng)肝臟具有取材方便和易于生長的優(yōu)點，能獲得典152．初代消化法培養(yǎng)：(1)把肝組織切成2~4立方毫米的小塊，用不合鈣鎂的BSS液洗兩次；(2)移入1:1的0.1％胰蛋白酶和0.1％膠原酶(都用無鈣鎂BSS配制)中，4℃冷消化10~12小時后，通過250微米和64微米尼龍網(wǎng)或不銹鋼紗網(wǎng)濾過(用紗布濾過亦可)；(3)收集細胞、BSS液洗1~2次、計數(shù)、接種培養(yǎng)；2．初代消化法培養(yǎng)：163．肝臟灌流法：需用全肝，以較小動物如小鼠和大鼠為好。(1)無菌解剖動物，取出肝臟，先用BSS洗除血污；(2)取5ml注射器一支，吸取消化液后，把注射器頭輕輕插入肝管中，用線繩結(jié)扎牢固，以防消化液漏出，輕輕把消化液注入膽管系統(tǒng)，并不時輕柔壓肝臟，以便消化液進入肝小葉中；消化液在肝內(nèi)停留20~30分后，在吸出消化液的同時并輕柔壓肝臟，以使肝細胞脫落和消化液吸出；3．肝臟灌流法：17(3)待吸凈消化液后，注入離心管中，低速離心分離，用RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)(較其它培養(yǎng)基為好)，能獲得較純的肝上皮細胞和獲較好的效果。(3)待吸凈消化液后，注入離心管中，低速離心分離，用RPM18(四)內(nèi)皮細胞培養(yǎng)應(yīng)用材料：人臍帶臍靜脈、動物大動脈等，用灌流消化法獲取細胞最為簡便。(四)內(nèi)皮細胞培養(yǎng)應(yīng)用材料：19(1)取產(chǎn)后的新鮮臍帶；如不立即培養(yǎng)可保存于4℃中，但不宜超過12小時；無菌剪取長10~15厘米一段。其它如胚胎和幼體動物的大血管，亦可用于培養(yǎng)；(2)先用三通注射器吸溫PBS液注入臍帶的臍靜脈中，洗除殘血；注入口處宜用線繩結(jié)扎，以防液體返流；(1)取產(chǎn)后的新鮮臍帶；如不立即培養(yǎng)可保存于4℃中，但不宜超20(3)用血管鉗夾緊臍帶一端，從另端向臍靜脈中徐徐注入最終濃度為0.1％的膠原酶，待末端出現(xiàn)液體后結(jié)扎之，令充滿血管，注入口亦應(yīng)結(jié)扎，以防液體返流，消化3~10分鐘；(4)吸出含有內(nèi)皮細胞的消化液，注入離心管中；為獲取更多細胞，可再注入溫PBS沖洗2~3次徹底清除干凈殘余細胞，一并注入離心管中離心；(5)吸除上清，加1640培養(yǎng)液，制成細胞懸液，接種入瓶皿中培養(yǎng)，順利時2~3天內(nèi)細胞即可長成單層。(3)用血管鉗夾緊臍帶一端，從另端向臍靜脈中徐徐注入最終濃21不同類型細胞培養(yǎng)特點課件22人臍帶易于獲得，培養(yǎng)效果好；細胞生長后，一般傳6~7代后即衰退，難以長期維持。用兔血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)較好，可傳10~30代；不同部位血管內(nèi)皮細胞生物學(xué)性狀不同，對各種作用因素反應(yīng)亦有很大差別。人臍帶易于獲得，培養(yǎng)效果好；細胞生長后，一般傳6~7代23(五)毛細血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)

毛細血管細小，結(jié)構(gòu)簡單，內(nèi)皮細胞外有較多的結(jié)締組織，進行分離培養(yǎng)有很大困難。近年毛細血管培養(yǎng)已獲成功；利用人的小兒包皮、人脾臟、牛腎上腺、癌組織(如卵巢癌)等均可；(五)毛細血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)

毛細血管細小，結(jié)構(gòu)簡單，內(nèi)皮細241．材料：[腫瘤條件培養(yǎng)基制備](1)取C3H小鼠的S-180實體肉瘤組織；(2)胰蛋白酶消化，Dulbecco改良Eagle氏培養(yǎng)液15m1(含10％小牛血清)種到培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)；1．材料：25(3)在細胞生長接近完全匯合時，收集培養(yǎng)液制成條件培養(yǎng)基；再用含10％小牛血清的新培養(yǎng)液后，也每隔兩天收集一次，可獲多量條件培養(yǎng)基；(4)4000轉(zhuǎn)／分離心后，再通過0.22μm微孔濾膜濾過，-20℃凍存?zhèn)溆?臨用前融解)。[凝膠底層制備](1)取60mmFalcon產(chǎn)培養(yǎng)皿，加1%Difco產(chǎn)明膠(用不合鈣和鎂的Hanks液配制)，鋪蓋瓶底，形成薄層；(2)置4℃過夜；用前再用少許培養(yǎng)液沖洗一次。(3)在細胞生長接近完全匯合時，收集培養(yǎng)液制成條件培養(yǎng)基；262．初代培養(yǎng)(1)取材：取新鮮牛腎上腺數(shù)個，先用Hanks液洗除血污；(2)消化：剝除被膜，分離出皮質(zhì)，切成lmm3小塊，加0.5％膠原酶室溫中消化1小時；每隔10分鐘用吸管吹打懸液令消化充分；(3)過濾：通過不銹鋼紗網(wǎng)濾過，網(wǎng)眼要求只允許能通過小于110微米長的毛細血管小段；(4)離心：650rpm，4℃，離心7分鐘后，棄掉上清膠原酶；2．初代培養(yǎng)27(5)再離心：沉淀物用培養(yǎng)液重懸并離心，再重懸，再離心，共兩次；(6)制細胞懸液：末次沉淀物仍用含10％小牛血清的Dulbecco改良Eag1e氏培養(yǎng)液重懸后，稍吹打；(7)接種：接種入鋪有明膠底層的培養(yǎng)皿中，37℃培養(yǎng)；在培養(yǎng)頭1~3小時中，毛細血管小段和內(nèi)皮細胞最先貼附于底物上，而腎上腺細胞和成纖維細胞卻仍在培養(yǎng)液中漂浮；(8)換液：吸除培養(yǎng)液，再加入腫瘤條件培養(yǎng)液；每兩天換液一次。毛細血管小段一般成自1~4個內(nèi)皮細胞，以后每個小段在底物上慢慢展成特殊形態(tài)的細胞島，能持續(xù)2~5天。(5)再離心：沉淀物用培養(yǎng)液重懸并離心，再重懸，再離心，共兩283．毛細血管內(nèi)皮細胞分離培養(yǎng)：(1)初代培養(yǎng)2~3天后，鏡下確認幾個毛細血管內(nèi)皮細胞島，在培養(yǎng)皿背面，用不脫色筆劃圈圈起；(2)鏡下檢查，如圈內(nèi)殘有非內(nèi)皮細胞時，可用顯微細針在倒置顯微鏡下挑除；用細胞解剖器也可，宜在凈化臺無菌氣流中、打開培養(yǎng)皿蓋進行，但時間不宜過長(15~20分鐘)；圈外非內(nèi)皮細胞可用無菌膠刮刮除；3．毛細血管內(nèi)皮細胞分離培養(yǎng)：29(3)用培養(yǎng)液漂洗兩次，以去除漂浮細胞；(4)剩余內(nèi)皮細胞島如小(5~20個細胞)而少時，生長增殖常變得緩慢或完全不生長，此時需加入3T3等飼細胞；飼細胞接種量為4000細胞／cm2；(5)當(dāng)內(nèi)皮細胞充滿所有飼細胞空間后，用胰蛋白酶消化、離心、加入腫瘤條件培養(yǎng)基；(6)接種入明膠底物皿中繼續(xù)培養(yǎng)(飼細胞死亡被淘汰)，細胞增殖生長匯合后，按1:5傳代。(3)用培養(yǎng)液漂洗兩次，以去除漂浮細胞；30不同類型細胞培養(yǎng)特點課件31二、結(jié)締組織類細胞培養(yǎng)

(一)成纖維細胞培養(yǎng)包括人在內(nèi)的各種成纖維細胞都很容易培養(yǎng)，也是其它組織培養(yǎng)時的副產(chǎn)物，極易獲得。用人或動物胚體為好；動物可用小鼠或雞胚，去頭和內(nèi)臟，剪成小碎塊后，用胰蛋白酶消化法培養(yǎng)；如為人胚，可取皮膚培養(yǎng)。幼兒包皮是培養(yǎng)成纖維細胞的很好對象。二、結(jié)締組織類細胞培養(yǎng)

(一)成纖維細胞培養(yǎng)32小鼠成纖維細胞培養(yǎng)條件12.5~14.5d胎齡的小鼠胎兒分離效果最好；最佳培養(yǎng)基為DMEM添加15%小牛血清；第3代細胞增殖最旺盛；室溫條件下，0.125%胰蛋白酶消化時間以8~10min為宜。在培養(yǎng)ES細胞時，應(yīng)選擇第3~5代的小鼠成纖維細胞作為飼養(yǎng)層細胞。小鼠成纖維細胞培養(yǎng)條件12.5~14.5d胎齡的小鼠胎兒分離33小鼠成纖維細胞；

細胞來源：swiss小鼠胚胎小鼠成纖維細胞；

細胞來源：swiss小鼠胚胎34不同類型細胞培養(yǎng)特點課件35(二)巨噬細胞培養(yǎng)巨噬細胞屬免疫細胞，有多種功能，是研究細胞吞噬、細胞免疫和分子免疫學(xué)的重要對象。巨噬細胞容易獲得，便于培養(yǎng)，并可進行純化。但屬不繁殖型細胞群，難以長期生存，好的條件下僅能生活2~3周，因之多用作初代培養(yǎng)。巨噬細胞也能建成無限細胞系；大多來自小鼠，如P388D-1、J774A．1、RAW309、Cr.1等。(二)巨噬細胞培養(yǎng)361．培養(yǎng)技術(shù)要點：[來源和取材]巨噬細胞可來源于人胸水、腹水、血和透析液等材料。實驗多從動物血液、肺、脾和胸腹腔獲取，其中以從動物腹腔取材最常用。用40μg的PHA注入腹腔中，能產(chǎn)生6~8×106個細胞，而且無刺激性，效果較好。1．培養(yǎng)技術(shù)要點：372．培養(yǎng)方法：培養(yǎng)巨噬細胞可用各種方法和各種來源獲取細胞，其中以小鼠腹腔取材法最為實用。人的材料除來源不同外，培養(yǎng)方法大同小異。[程序](1)實驗前三天，向每只小鼠腹腔內(nèi)注入無菌硫基乙酸肉湯1ml(勿注入腸內(nèi))；(2)引頸殺死動物；手提鼠尾將全鼠浸入70％酒精中3~5秒；(3)置動物于解剖臺上，用針頭固定四肢，雙手持鑷撕開皮膚拉向兩側(cè)，暴露出腹膜，但勿傷及腹膜壁；(4)再用70％酒精擦洗腹膜壁后，用注射器吸10mlEag1e液注入腹腔中，同時從兩側(cè)用手指揉壓腹膜壁，令液體在腹腔內(nèi)充分流動；2．培養(yǎng)方法：38(5)用針頭輕輕挑起腹壁，使動物體微傾向一側(cè)，使腹腔中液體集于針頭下吸取入針管內(nèi)；(6)小心拔出針頭，把液體注入離心管中，(4℃)離心10分鐘后，去上清，加10mlEagle培養(yǎng)基；(7)計數(shù)細胞，每只小鼠可產(chǎn)生20~30×106細胞，其中90％為巨噬細胞；(8)為獲取3×105個貼附細胞／平方厘米，需接種2.5×106／m1；(9)為純化培養(yǎng)細胞，去除其它白細胞，接種數(shù)小時后，去除培養(yǎng)液，用Eagle液沖洗1~2次后，再加新Eagle培養(yǎng)液置37℃CO2溫箱中培養(yǎng)。(5)用針頭輕輕挑起腹壁，使動物體微傾向一側(cè)，使腹腔中液體39不同類型細胞培養(yǎng)特點課件40三、肌組織細胞培養(yǎng)

以心肌和骨骼肌培養(yǎng)較為實用。(一)骨骼肌細胞培養(yǎng)動物胚或幼體的大腿肌組織為最好的培養(yǎng)材料。取材常用生后1~2天的乳鼠(Wistar大鼠更好)。(1)取材：殺死動物，無菌取大腿肌組織，切成0.3~0.5厘米小塊；(2)消化：用不含鈣鎂離子的Hanks液配的0.25％胰蛋白酶消化，無菌紗網(wǎng)或紗布濾過，合成培養(yǎng)基加10％小牛(或馬)血清培養(yǎng)，為促進分化可加1％的胎汁；三、肌組織細胞培養(yǎng)

以心肌和骨骼肌培養(yǎng)較為實用。41(3)接種：細胞接種量為2×106/皿；接種在膠原或明膠的底物上能促進細胞分化。明膠制備比較簡單，常用Hanks液配的0.01％明膠。生長特點：細胞生長開始呈紡錘形，培養(yǎng)50~52小時后將出現(xiàn)融合形成肌細胞狀多核纖維。數(shù)日后融合停止，此時能觀察到橫紋。一般在融合后二三天內(nèi)能見到收縮現(xiàn)象；因收縮運動有時可導(dǎo)致細胞從底物脫離。(3)接種：細胞接種量為2×106/皿；接種在膠原或明膠的底42(二)心肌細胞培養(yǎng)最常用材料：雞胚心肌、小鼠、大鼠以及人胎兒心肌等都可應(yīng)用。心肌是比較容易培養(yǎng)和生長的組織，可應(yīng)用多種方法進行培養(yǎng)，如懸滴培養(yǎng)、組織塊培養(yǎng)和消化培養(yǎng)法等，主要取心室肌培養(yǎng)，均能獲得良好的生長效果。(二)心肌細胞培養(yǎng)最常用材料：43[程序](1)選新鮮受精雞卵，置溫箱中孵育(溫箱中放有水槽，以維持箱內(nèi)濕度)；每日翻動一次(180度)，孵育9~12天；(2)取雞胎；(3)用眼科剪剪開胸腔，剝出心臟，置入皿中用Hanks液漂洗1~2次；(4)小心剪除大的動靜脈，保留心室??；用組織塊或消化培養(yǎng)法均可。初代培養(yǎng)的雞胚心肌呈紡錘形，純化及生長特點：常雜有成纖維細胞和內(nèi)皮細胞；心肌細胞亦較其它成分貼壁慢，可反復(fù)貼壁法排除其它細胞成分。在培養(yǎng)成功時，相差顯微鏡下可觀察到橫紋；一周后便可出現(xiàn)節(jié)律性收縮現(xiàn)象。[程序]44乳鼠心肌細胞原代培養(yǎng)乳鼠心肌細胞原代培養(yǎng)45不同類型細胞培養(yǎng)特點課件46四、神經(jīng)組織細胞培養(yǎng)神經(jīng)組織主要由兩種神經(jīng)細胞(神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞）組成。神經(jīng)元為高度分化的細胞，在組織發(fā)生晚期已失掉增殖能力，對生存條件要求高，只有在適宜情況下，如接種在膠原底層上，或在加入神經(jīng)生長因子(NGF)和膠質(zhì)細胞因子時，才能生存，并可能出現(xiàn)一定程度的分化現(xiàn)象，如長出突起等，但卻難使之增殖；即使培養(yǎng)胚胎組織情況也是如此。四、神經(jīng)組織細胞培養(yǎng)47神經(jīng)膠質(zhì)細胞為較易培養(yǎng)成分，它分少突、星形和小膠質(zhì)三種。神經(jīng)膠質(zhì)細胞與神經(jīng)元有共存關(guān)系。神經(jīng)膠質(zhì)細胞為較易培養(yǎng)成分，它分少突、星形和小膠質(zhì)三種。神經(jīng)48人腦膠質(zhì)瘤細胞人腦膠質(zhì)瘤細胞49大鼠c6膠質(zhì)細胞大鼠c6膠質(zhì)細胞50不同類型細胞培養(yǎng)特點課件51(一)初代培養(yǎng)神經(jīng)元能發(fā)生一定分化現(xiàn)象，如生長突起，但因無增殖能力，最后衰退死亡；但神經(jīng)膠質(zhì)尤以星形細胞能繼續(xù)生存和分裂增殖。(二)傳代培養(yǎng)神經(jīng)膠質(zhì)細胞是神經(jīng)組織中比較容易培養(yǎng)的成分。不僅能獲得生長的膠質(zhì)細胞并可形成能傳代的二倍體細胞系。(一)初代培養(yǎng)52(三)培養(yǎng)方法人腦組織可用于神經(jīng)膠質(zhì)細胞培養(yǎng)，培養(yǎng)組織來自手術(shù)室無菌取腦髓灰質(zhì)或白質(zhì)均可用于培養(yǎng)，1．程序：(1)細胞懸液制備：獲取腦組織后，先仔細剝除腦膜和血管等纖維成分，置入Hanks液中漂洗1~2次后，置于30~50倍的Hanks液中；腦組織比較柔軟，反復(fù)吹打即可制備成細胞懸液；(2)排除脂肪成分和其它碎塊：把懸液注入離心管中，在室溫直立5~10分鐘后，細胞或細胞團塊自然下沉，脂肪等雜物易漂浮于懸液表層，吸除上清，如此反復(fù)二三次可獲較多的細胞成分；(三)培養(yǎng)方法53(3)濾過、計數(shù)、接種：向末次沉降物中加入適量營養(yǎng)液，通過紗網(wǎng)或紗布濾過，計數(shù)細胞并調(diào)整好細胞密度，接種入培養(yǎng)瓶或皿中，置5％C02溫箱中培養(yǎng)；(4)傳代：細胞生長匯合后，可用0.25％胰蛋白酶消化法做傳代處理。(3)濾過、計數(shù)、接種：向末次沉降物中加入適量營養(yǎng)液，通過紗542．生長特點：接種后初期，細胞可能出現(xiàn)飄浮不貼壁現(xiàn)象，貼壁后在短期內(nèi)也可能不見細胞分裂現(xiàn)象；細胞適應(yīng)環(huán)境過程較長，然而一旦生長后，即能進入較旺盛的增殖狀態(tài)。生長開始常雜有巨噬細胞、成纖維細胞和上皮細胞等，傳二、三代后，這些成分即消失，逐漸形成均一的星形膠質(zhì)細胞，一般形成連接不甚緊密的單層細胞2．生長特點：55第二節(jié)腫瘤細胞培養(yǎng)腫瘤細胞在組織培養(yǎng)中占有核心的位置，首先癌細胞是比較容易培養(yǎng)的細胞，當(dāng)前建立的細胞系中癌細胞系是最多的。腫瘤細胞培養(yǎng)是研究癌變機理、抗癌藥檢測、癌分子生物學(xué)極其重要的手段。第二節(jié)腫瘤細胞培養(yǎng)腫瘤細胞在組織培養(yǎng)中占有核心的位置56培養(yǎng)方法腫瘤細胞培養(yǎng)成功關(guān)鍵在于：取材、成纖維細胞的排除、選用適宜的培養(yǎng)液和培養(yǎng)底物等幾個方面。初代培養(yǎng)應(yīng)用組織塊和消化培養(yǎng)法均可。一、要點1．取材：人腫瘤細胞來自外科手術(shù)或活檢瘤組織。取材時盡量避免用退變組織，要挑選活力較好的部位。癌性轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)或胸腹水是好的培養(yǎng)材料。培養(yǎng)方法572．培養(yǎng)基：腫瘤細胞對培養(yǎng)基的要求不如正常細胞嚴格，一般常用的RPMIl640、DMEM、Mc-Coy5A等培養(yǎng)基等皆可用于腫瘤細胞培養(yǎng)。腫瘤細胞對血清的需求比正常細胞低，正常細胞培養(yǎng)不加血清不能生長，腫瘤細胞在低血清培養(yǎng)基中也能生長。腫瘤細胞對培養(yǎng)環(huán)境適應(yīng)性較大。培養(yǎng)腫瘤細胞仍需加血清和相關(guān)生長因子培養(yǎng)更易成功。2．培養(yǎng)基：583．成纖維細胞的排除：成纖維細胞常與腫瘤細胞同時混雜生長，致難以純化腫瘤細胞。而且成纖維細胞常比腫瘤細胞生長得快，最終能壓制腫瘤細胞的生長。因此排除成纖維細胞成為腫瘤細胞培養(yǎng)中的關(guān)鍵。3．成纖維細胞的排除：59成纖維細胞排除法1．機械刮除法：是用不銹鋼絲末端插有橡膠刮頭(用膠塞剪成三角形插以不銹鋼絲)，或裹少許脫脂棉制成，裝入試管中高壓滅菌后備用(也可用特制電熱燒灼器刮除)。刮除程序為：(1)標記：鏡下觀察，用不脫色筆在培養(yǎng)瓶皿的背面圈下生長腫瘤細胞的部位；(2)刮除：棄掉培養(yǎng)液，把無菌膠刮伸入瓶皿中，肉眼或顯微鏡窺視下，刮除無標記空間；(3)用Hanks液沖洗一兩次，洗除被刮掉的細胞；(5)注入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)仍有成纖維細胞殘留，可重復(fù)刮除至完全除掉為止。成纖維細胞排除法1．機械刮除法：602．反復(fù)貼壁法：根據(jù)腫瘤細胞比成纖維細胞貼壁速度慢的特點，并結(jié)合使用不加血清的營養(yǎng)液，(1)細胞生長達一定數(shù)量后，倒出舊培養(yǎng)液，用胰酶消化后，Hanks沖洗2次，加入不含血清的培養(yǎng)液，吹打制成細胞懸液；(2)編號為A、B、C三個培養(yǎng)瓶；首先把懸液接種入A培養(yǎng)瓶中，置溫箱中靜止培養(yǎng)5—20分鐘后，輕輕傾斜培養(yǎng)瓶，讓液體集中瓶角后慢慢吸出全部培養(yǎng)液，再接種入B培養(yǎng)瓶中后；向A瓶中補充少許完全培養(yǎng)液置溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)；(3)B瓶中細胞5~20分鐘后，按處理A的方法，把培養(yǎng)液注入C培養(yǎng)瓶中；再向B瓶中補加完全培養(yǎng)基。2．反復(fù)貼壁法：61當(dāng)三個瓶內(nèi)都含有培養(yǎng)液后，均在溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)。如操作成功，次日觀察可見A瓶主要為成纖維細胞，B瓶兩類細胞相雜，C瓶可能主要為癌細胞。必要時可反復(fù)處理多次，直至癌細胞純化為止。當(dāng)三個瓶內(nèi)都含有培養(yǎng)液后，均在溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)。如操作成功，次623．消化排除法：(1)先是用0.5％胰蛋白酶和0.02％EDTA(1:1)混合液漂洗培養(yǎng)細胞一次，然后再換成新的混合液繼續(xù)消化，并在倒置顯微鏡下窺視和不時搖動培養(yǎng)瓶，到半數(shù)細胞脫落下來后，便立即停止消化；(2)把消化液吸入離心管中，離心去上清，吸入另瓶中，加培養(yǎng)液置溫箱中培養(yǎng)；向原瓶內(nèi)也補加新的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。用此法處理后，成纖維細胞比腫瘤細胞易先脫落，經(jīng)過幾次反復(fù)處理，可能把成纖維細胞除凈。3．消化排除法：634．膠原酶消化法：本法是利用成纖維細胞對膠原酶較為敏感的特點，通過消化進行選擇。(1)可用0．5mg／ml的膠原酶消化處理，邊消化邊在倒置顯微鏡下窺視，當(dāng)發(fā)現(xiàn)成纖維細胞被除掉后，即終止消化；(2)用Hanks洗滌處理一次后，更換新培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，可獲純凈腫瘤細胞。如成纖維細胞末被除凈，可再次重復(fù)。4．膠原酶消化法：645．其它方法：有人發(fā)現(xiàn)聚丙烯酰胺有抑制成纖維細胞生長的作用；也有人用聚蔗糖制備成比重1.025~1.085的密度梯度離心液，加入細胞懸液后，在23℃中800g離心10分鐘。在比重1.025~1.050層為成纖維細胞，在比重1.065~1.085層為上皮細胞，再經(jīng)過分離進行培養(yǎng)。最近也有人應(yīng)用特殊化學(xué)物如SOD抑制成纖維細胞生長的方法。選用上述任何一種方法，都需進行試驗，取得必要經(jīng)驗，找出適合的條件，才能獲得好的效果。5．其它方法：65二、提高腫瘤細胞培養(yǎng)存活率和生長率措施1．適宜底物：如：把經(jīng)過純化的細胞接種在不同的底物上，如鼠尾膠原底層、飼細胞層等。2．生長因子：應(yīng)用促細胞生長因子，向培養(yǎng)液中增加一種或幾種促細胞生長因子。根據(jù)細胞種類不同選用不同的促生長物，常用有胰島素、氫化可的松、雌激素以及其它生長因子。3．動物體媒介培養(yǎng)：為提高腫瘤細胞對體外培養(yǎng)環(huán)境的適應(yīng)力和增加有活力癌細胞(干細胞)的數(shù)量，可采用動物體轉(zhuǎn)嫁接種成瘤后，再從動物體內(nèi)取出進行培養(yǎng)，能提高體外培養(yǎng)的成功率。受體動物以裸鼠最好。二、提高腫瘤細胞培養(yǎng)存活率和生長率措施66Hela細胞Hela細胞67肝癌細胞肝癌細胞68人乳腺癌細胞株MCF-7人乳腺癌細胞株MCF-769第六章

個別細胞和組織的培養(yǎng)第六章

個別細胞和組織的培養(yǎng)70

類型：正常細胞培養(yǎng)腫瘤細胞培養(yǎng)

類型：71第一節(jié)正常細胞培養(yǎng)

正常細胞，在體外培養(yǎng)時都不易生長，建立細胞系更難。正常細胞難培養(yǎng)的原因是它們是分化的細胞，對體外生存條件要求嚴格.但只要一切條件適當(dāng)仍有培養(yǎng)成功可能。第一節(jié)正常細胞培養(yǎng)

正常細胞，在體外培養(yǎng)時都不易生長，建72一、上皮細胞類培養(yǎng)

上皮細胞可來源于外、內(nèi)、中三個胚層；培養(yǎng)中只有源于外和內(nèi)胚層的細胞能反映出上皮細胞的特征，細胞呈膜狀生長的特點。一、上皮細胞類培養(yǎng)

上皮細胞可來源于外、內(nèi)、中三個胚層；73上皮細胞培養(yǎng)有三個難點：①需求特殊底物，如在底物上涂有膠原底層則利于細胞生長；②需求特殊培養(yǎng)基；③與上皮細胞相鄰的成纖維細胞常與上皮細胞同時混雜生長，并常壓過上皮細胞。純化和延長上皮細胞生存期是上皮細胞培養(yǎng)的關(guān)鍵之一。上皮細胞培養(yǎng)有三個難點：74(一)表皮細胞培養(yǎng)1．特點：在有膠原的底物上易生長；把人或小鼠表皮細胞培養(yǎng)在以3T3細胞為飼養(yǎng)層(用射線照射后)上時，細胞易生長并可發(fā)生一定程度的分化現(xiàn)象。降低pH、Ca2+的含量和溫度等，均利于表皮細胞生長。向培養(yǎng)基中加氫化可的松(10μg/m1)、10-6M的異丙基腎上腺素(Isoproterenol)和10ng/m1促表皮生長因子(EGF)能促表皮細胞生長。(一)表皮細胞培養(yǎng)75【飼細胞】飼細胞(FeederCells)也稱滋養(yǎng)細胞，是一層經(jīng)過射線照射或絲裂霉素傷害處理的、用作克隆細胞附著底物的細胞層。飼細胞作用：有同化營養(yǎng)液的能力。飼細胞能促克隆細胞的生長，利于克隆的形成?？寺⌒纬珊箫暭毎麧u死亡，換液時清除。【飼細胞】飼細胞(FeederCells)也稱滋養(yǎng)細胞，是76飼細胞的制備：(1)取原代培養(yǎng)的人或動物胚胎成纖維細胞，90%匯合時制成細胞懸液，再按103

細胞/毫升重新接種培養(yǎng)；(2)在細胞半?yún)R合時，準備0.25μg/ml的絲裂霉素，按2ug/105細胞的量加入到培養(yǎng)瓶中過夜；或用射線單次照射，劑量30～50戈瑞(Gy)；(3)細胞經(jīng)上述處理后，Hanks液漂洗兩次、更換培養(yǎng)液、再培養(yǎng)24小時，胰蛋白酶消化細胞制成懸液，按5×104/ml接種入新培養(yǎng)基中；(4)48小時后，即可用于細胞克隆之用。飼細胞的制備：772．表皮細胞培養(yǎng)程序：(1)取材：取外科植皮或手術(shù)殘余皮膚小塊，以角化層薄者為佳，早產(chǎn)流產(chǎn)兒皮膚更好，切成0.5~1cm2小塊；(2)EDTA處理：先置入0.02％EDTA中室溫置5分鐘。(3)冷消化：換入0.25%胰蛋白酶中，置4℃過夜；(4)分離：取出皮塊，用血管鉗或鑷子把表皮與真皮層分開；2．表皮細胞培養(yǎng)程序：78(5)溫消化：取出表皮單獨處理；用剪刀剪成更小的塊后，置入新的0.25％胰蛋白酶中，37℃再消化30~60分鐘；(6)制細胞懸液：用吸管輕輕反復(fù)吹打，使成細胞懸液；(7)加培養(yǎng)液：通過80目不銹鋼紗網(wǎng)濾過后，低速離心，吸上清，直接加入Eagle液和20％小牛血清.(8)培養(yǎng)：接種入碟皿中，CO2溫箱培養(yǎng)。(5)溫消化：取出表皮單獨處理；用剪刀剪成更小的塊后，置入79注意事項：冷消化目的在于使表皮和真皮結(jié)合松散；如冷消化后分離下來的表皮膜自身也已松散，此時亦可直接置入PBS中用吸管吹打制備細胞懸液；不再經(jīng)過第二次消化。注意事項：冷消化目的在于使表皮和真皮結(jié)合松散；如冷消化后分離80(二)胃上皮細胞培養(yǎng)

適于胃上皮細胞生長的條件是：①膠原酶和透明質(zhì)酸酶消化法并用消化細胞；②應(yīng)用膠原底物培養(yǎng)；③制備含有特定成分的培養(yǎng)基；(二)胃上皮細胞培養(yǎng)

適于胃上皮細胞生長的條件是：81培養(yǎng)程序：(1)取材：取胃潰瘍或胃癌手術(shù)切除胃標本遠端非病變區(qū)粘膜少許；(2)清洗：用含慶大霉素(400μg/m1)和兩性霉素(2μg/m1的Hanks)液漂洗后，用鈍器剝離下粘膜，剪成1mm大小；(3)消化：在I型膠原酶和透明質(zhì)酸酶中，于37℃中消化80分鐘；(4)離心：收集細胞懸液，800轉(zhuǎn)/分離心后，Hanks液漂洗兩次；培養(yǎng)程序：82(5)接種：末次離心后加入含有1％~2％胎牛血清的完全培養(yǎng)基，接種入不同孔數(shù)的培養(yǎng)板中；接種量依不同實驗?zāi)康亩?。細胞接種后一般在16小時內(nèi)貼壁，細胞呈多角形，成島狀或片狀生長，以后逐漸聯(lián)接成片。初代培養(yǎng)可維持2~3周，第一周末達高峰，最后逐漸衰退剝落。(5)接種：末次離心后加入含有1％~2％胎牛血清的完全83(三)肝細胞培養(yǎng)肝臟具有取材方便和易于生長的優(yōu)點，能獲得典型上皮細胞培養(yǎng)。1．初代組織塊培養(yǎng)：肝組織做組織塊培養(yǎng)效果很好。取新鮮肝臟，先剝除被膜和血管等纖維成分，用刀或剪刀把肝剪成1mm3左右的小塊，采用貼壁培養(yǎng)法。肝組織易于貼壁，生長力好，一般次日即可出現(xiàn)生長暈。(三)肝細胞培養(yǎng)肝臟具有取材方便和易于生長的優(yōu)點，能獲得典842．初代消化法培養(yǎng)：(1)把肝組織切成2~4立方毫米的小塊，用不合鈣鎂的BSS液洗兩次；(2)移入1:1的0.1％胰蛋白酶和0.1％膠原酶(都用無鈣鎂BSS配制)中，4℃冷消化10~12小時后，通過250微米和64微米尼龍網(wǎng)或不銹鋼紗網(wǎng)濾過(用紗布濾過亦可)；(3)收集細胞、BSS液洗1~2次、計數(shù)、接種培養(yǎng)；2．初代消化法培養(yǎng)：853．肝臟灌流法：需用全肝，以較小動物如小鼠和大鼠為好。(1)無菌解剖動物，取出肝臟，先用BSS洗除血污；(2)取5ml注射器一支，吸取消化液后，把注射器頭輕輕插入肝管中，用線繩結(jié)扎牢固，以防消化液漏出，輕輕把消化液注入膽管系統(tǒng)，并不時輕柔壓肝臟，以便消化液進入肝小葉中；消化液在肝內(nèi)停留20~30分后，在吸出消化液的同時并輕柔壓肝臟，以使肝細胞脫落和消化液吸出；3．肝臟灌流法：86(3)待吸凈消化液后，注入離心管中，低速離心分離，用RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)(較其它培養(yǎng)基為好)，能獲得較純的肝上皮細胞和獲較好的效果。(3)待吸凈消化液后，注入離心管中，低速離心分離，用RPM87(四)內(nèi)皮細胞培養(yǎng)應(yīng)用材料：人臍帶臍靜脈、動物大動脈等，用灌流消化法獲取細胞最為簡便。(四)內(nèi)皮細胞培養(yǎng)應(yīng)用材料：88(1)取產(chǎn)后的新鮮臍帶；如不立即培養(yǎng)可保存于4℃中，但不宜超過12小時；無菌剪取長10~15厘米一段。其它如胚胎和幼體動物的大血管，亦可用于培養(yǎng)；(2)先用三通注射器吸溫PBS液注入臍帶的臍靜脈中，洗除殘血；注入口處宜用線繩結(jié)扎，以防液體返流；(1)取產(chǎn)后的新鮮臍帶；如不立即培養(yǎng)可保存于4℃中，但不宜超89(3)用血管鉗夾緊臍帶一端，從另端向臍靜脈中徐徐注入最終濃度為0.1％的膠原酶，待末端出現(xiàn)液體后結(jié)扎之，令充滿血管，注入口亦應(yīng)結(jié)扎，以防液體返流，消化3~10分鐘；(4)吸出含有內(nèi)皮細胞的消化液，注入離心管中；為獲取更多細胞，可再注入溫PBS沖洗2~3次徹底清除干凈殘余細胞，一并注入離心管中離心；(5)吸除上清，加1640培養(yǎng)液，制成細胞懸液，接種入瓶皿中培養(yǎng)，順利時2~3天內(nèi)細胞即可長成單層。(3)用血管鉗夾緊臍帶一端，從另端向臍靜脈中徐徐注入最終濃90不同類型細胞培養(yǎng)特點課件91人臍帶易于獲得，培養(yǎng)效果好；細胞生長后，一般傳6~7代后即衰退，難以長期維持。用兔血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)較好，可傳10~30代；不同部位血管內(nèi)皮細胞生物學(xué)性狀不同，對各種作用因素反應(yīng)亦有很大差別。人臍帶易于獲得，培養(yǎng)效果好；細胞生長后，一般傳6~7代92(五)毛細血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)

毛細血管細小，結(jié)構(gòu)簡單，內(nèi)皮細胞外有較多的結(jié)締組織，進行分離培養(yǎng)有很大困難。近年毛細血管培養(yǎng)已獲成功；利用人的小兒包皮、人脾臟、牛腎上腺、癌組織(如卵巢癌)等均可；(五)毛細血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)

毛細血管細小，結(jié)構(gòu)簡單，內(nèi)皮細931．材料：[腫瘤條件培養(yǎng)基制備](1)取C3H小鼠的S-180實體肉瘤組織；(2)胰蛋白酶消化，Dulbecco改良Eagle氏培養(yǎng)液15m1(含10％小牛血清)種到培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)；1．材料：94(3)在細胞生長接近完全匯合時，收集培養(yǎng)液制成條件培養(yǎng)基；再用含10％小牛血清的新培養(yǎng)液后，也每隔兩天收集一次，可獲多量條件培養(yǎng)基；(4)4000轉(zhuǎn)／分離心后，再通過0.22μm微孔濾膜濾過，-20℃凍存?zhèn)溆?臨用前融解)。[凝膠底層制備](1)取60mmFalcon產(chǎn)培養(yǎng)皿，加1%Difco產(chǎn)明膠(用不合鈣和鎂的Hanks液配制)，鋪蓋瓶底，形成薄層；(2)置4℃過夜；用前再用少許培養(yǎng)液沖洗一次。(3)在細胞生長接近完全匯合時，收集培養(yǎng)液制成條件培養(yǎng)基；952．初代培養(yǎng)(1)取材：取新鮮牛腎上腺數(shù)個，先用Hanks液洗除血污；(2)消化：剝除被膜，分離出皮質(zhì)，切成lmm3小塊，加0.5％膠原酶室溫中消化1小時；每隔10分鐘用吸管吹打懸液令消化充分；(3)過濾：通過不銹鋼紗網(wǎng)濾過，網(wǎng)眼要求只允許能通過小于110微米長的毛細血管小段；(4)離心：650rpm，4℃，離心7分鐘后，棄掉上清膠原酶；2．初代培養(yǎng)96(5)再離心：沉淀物用培養(yǎng)液重懸并離心，再重懸，再離心，共兩次；(6)制細胞懸液：末次沉淀物仍用含10％小牛血清的Dulbecco改良Eag1e氏培養(yǎng)液重懸后，稍吹打；(7)接種：接種入鋪有明膠底層的培養(yǎng)皿中，37℃培養(yǎng)；在培養(yǎng)頭1~3小時中，毛細血管小段和內(nèi)皮細胞最先貼附于底物上，而腎上腺細胞和成纖維細胞卻仍在培養(yǎng)液中漂?。?8)換液：吸除培養(yǎng)液，再加入腫瘤條件培養(yǎng)液；每兩天換液一次。毛細血管小段一般成自1~4個內(nèi)皮細胞，以后每個小段在底物上慢慢展成特殊形態(tài)的細胞島，能持續(xù)2~5天。(5)再離心：沉淀物用培養(yǎng)液重懸并離心，再重懸，再離心，共兩973．毛細血管內(nèi)皮細胞分離培養(yǎng)：(1)初代培養(yǎng)2~3天后，鏡下確認幾個毛細血管內(nèi)皮細胞島，在培養(yǎng)皿背面，用不脫色筆劃圈圈起；(2)鏡下檢查，如圈內(nèi)殘有非內(nèi)皮細胞時，可用顯微細針在倒置顯微鏡下挑除；用細胞解剖器也可，宜在凈化臺無菌氣流中、打開培養(yǎng)皿蓋進行，但時間不宜過長(15~20分鐘)；圈外非內(nèi)皮細胞可用無菌膠刮刮除；3．毛細血管內(nèi)皮細胞分離培養(yǎng)：98(3)用培養(yǎng)液漂洗兩次，以去除漂浮細胞；(4)剩余內(nèi)皮細胞島如小(5~20個細胞)而少時，生長增殖常變得緩慢或完全不生長，此時需加入3T3等飼細胞；飼細胞接種量為4000細胞／cm2；(5)當(dāng)內(nèi)皮細胞充滿所有飼細胞空間后，用胰蛋白酶消化、離心、加入腫瘤條件培養(yǎng)基；(6)接種入明膠底物皿中繼續(xù)培養(yǎng)(飼細胞死亡被淘汰)，細胞增殖生長匯合后，按1:5傳代。(3)用培養(yǎng)液漂洗兩次，以去除漂浮細胞；99不同類型細胞培養(yǎng)特點課件100二、結(jié)締組織類細胞培養(yǎng)

(一)成纖維細胞培養(yǎng)包括人在內(nèi)的各種成纖維細胞都很容易培養(yǎng)，也是其它組織培養(yǎng)時的副產(chǎn)物，極易獲得。用人或動物胚體為好；動物可用小鼠或雞胚，去頭和內(nèi)臟，剪成小碎塊后，用胰蛋白酶消化法培養(yǎng)；如為人胚，可取皮膚培養(yǎng)。幼兒包皮是培養(yǎng)成纖維細胞的很好對象。二、結(jié)締組織類細胞培養(yǎng)

(一)成纖維細胞培養(yǎng)101小鼠成纖維細胞培養(yǎng)條件12.5~14.5d胎齡的小鼠胎兒分離效果最好；最佳培養(yǎng)基為DMEM添加15%小牛血清；第3代細胞增殖最旺盛；室溫條件下，0.125%胰蛋白酶消化時間以8~10min為宜。在培養(yǎng)ES細胞時，應(yīng)選擇第3~5代的小鼠成纖維細胞作為飼養(yǎng)層細胞。小鼠成纖維細胞培養(yǎng)條件12.5~14.5d胎齡的小鼠胎兒分離102小鼠成纖維細胞；

細胞來源：swiss小鼠胚胎小鼠成纖維細胞；

細胞來源：swiss小鼠胚胎103不同類型細胞培養(yǎng)特點課件104(二)巨噬細胞培養(yǎng)巨噬細胞屬免疫細胞，有多種功能，是研究細胞吞噬、細胞免疫和分子免疫學(xué)的重要對象。巨噬細胞容易獲得，便于培養(yǎng)，并可進行純化。但屬不繁殖型細胞群，難以長期生存，好的條件下僅能生活2~3周，因之多用作初代培養(yǎng)。巨噬細胞也能建成無限細胞系；大多來自小鼠，如P388D-1、J774A．1、RAW309、Cr.1等。(二)巨噬細胞培養(yǎng)1051．培養(yǎng)技術(shù)要點：[來源和取材]巨噬細胞可來源于人胸水、腹水、血和透析液等材料。實驗多從動物血液、肺、脾和胸腹腔獲取，其中以從動物腹腔取材最常用。用40μg的PHA注入腹腔中，能產(chǎn)生6~8×106個細胞，而且無刺激性，效果較好。1．培養(yǎng)技術(shù)要點：1062．培養(yǎng)方法：培養(yǎng)巨噬細胞可用各種方法和各種來源獲取細胞，其中以小鼠腹腔取材法最為實用。人的材料除來源不同外，培養(yǎng)方法大同小異。[程序](1)實驗前三天，向每只小鼠腹腔內(nèi)注入無菌硫基乙酸肉湯1ml(勿注入腸內(nèi))；(2)引頸殺死動物；手提鼠尾將全鼠浸入70％酒精中3~5秒；(3)置動物于解剖臺上，用針頭固定四肢，雙手持鑷撕開皮膚拉向兩側(cè)，暴露出腹膜，但勿傷及腹膜壁；(4)再用70％酒精擦洗腹膜壁后，用注射器吸10mlEag1e液注入腹腔中，同時從兩側(cè)用手指揉壓腹膜壁，令液體在腹腔內(nèi)充分流動；2．培養(yǎng)方法：107(5)用針頭輕輕挑起腹壁，使動物體微傾向一側(cè)，使腹腔中液體集于針頭下吸取入針管內(nèi)；(6)小心拔出針頭，把液體注入離心管中，(4℃)離心10分鐘后，去上清，加10mlEagle培養(yǎng)基；(7)計數(shù)細胞，每只小鼠可產(chǎn)生20~30×106細胞，其中90％為巨噬細胞；(8)為獲取3×105個貼附細胞／平方厘米，需接種2.5×106／m1；(9)為純化培養(yǎng)細胞，去除其它白細胞，接種數(shù)小時后，去除培養(yǎng)液，用Eagle液沖洗1~2次后，再加新Eagle培養(yǎng)液置37℃CO2溫箱中培養(yǎng)。(5)用針頭輕輕挑起腹壁，使動物體微傾向一側(cè)，使腹腔中液體108不同類型細胞培養(yǎng)特點課件109三、肌組織細胞培養(yǎng)

以心肌和骨骼肌培養(yǎng)較為實用。(一)骨骼肌細胞培養(yǎng)動物胚或幼體的大腿肌組織為最好的培養(yǎng)材料。取材常用生后1~2天的乳鼠(Wistar大鼠更好)。(1)取材：殺死動物，無菌取大腿肌組織，切成0.3~0.5厘米小塊；(2)消化：用不含鈣鎂離子的Hanks液配的0.25％胰蛋白酶消化，無菌紗網(wǎng)或紗布濾過，合成培養(yǎng)基加10％小牛(或馬)血清培養(yǎng)，為促進分化可加1％的胎汁；三、肌組織細胞培養(yǎng)

以心肌和骨骼肌培養(yǎng)較為實用。110(3)接種：細胞接種量為2×106/皿；接種在膠原或明膠的底物上能促進細胞分化。明膠制備比較簡單，常用Hanks液配的0.01％明膠。生長特點：細胞生長開始呈紡錘形，培養(yǎng)50~52小時后將出現(xiàn)融合形成肌細胞狀多核纖維。數(shù)日后融合停止，此時能觀察到橫紋。一般在融合后二三天內(nèi)能見到收縮現(xiàn)象；因收縮運動有時可導(dǎo)致細胞從底物脫離。(3)接種：細胞接種量為2×106/皿；接種在膠原或明膠的底111(二)心肌細胞培養(yǎng)最常用材料：雞胚心肌、小鼠、大鼠以及人胎兒心肌等都可應(yīng)用。心肌是比較容易培養(yǎng)和生長的組織，可應(yīng)用多種方法進行培養(yǎng)，如懸滴培養(yǎng)、組織塊培養(yǎng)和消化培養(yǎng)法等，主要取心室肌培養(yǎng)，均能獲得良好的生長效果。(二)心肌細胞培養(yǎng)最常用材料：112[程序](1)選新鮮受精雞卵，置溫箱中孵育(溫箱中放有水槽，以維持箱內(nèi)濕度)；每日翻動一次(180度)，孵育9~12天；(2)取雞胎；(3)用眼科剪剪開胸腔，剝出心臟，置入皿中用Hanks液漂洗1~2次；(4)小心剪除大的動靜脈，保留心室??；用組織塊或消化培養(yǎng)法均可。初代培養(yǎng)的雞胚心肌呈紡錘形，純化及生長特點：常雜有成纖維細胞和內(nèi)皮細胞；心肌細胞亦較其它成分貼壁慢，可反復(fù)貼壁法排除其它細胞成分。在培養(yǎng)成功時，相差顯微鏡下可觀察到橫紋；一周后便可出現(xiàn)節(jié)律性收縮現(xiàn)象。[程序]113乳鼠心肌細胞原代培養(yǎng)乳鼠心肌細胞原代培養(yǎng)114不同類型細胞培養(yǎng)特點課件115四、神經(jīng)組織細胞培養(yǎng)神經(jīng)組織主要由兩種神經(jīng)細胞(神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞）組成。神經(jīng)元為高度分化的細胞，在組織發(fā)生晚期已失掉增殖能力，對生存條件要求高，只有在適宜情況下，如接種在膠原底層上，或在加入神經(jīng)生長因子(NGF)和膠質(zhì)細胞因子時，才能生存，并可能出現(xiàn)一定程度的分化現(xiàn)象，如長出突起等，但卻難使之增殖；即使培養(yǎng)胚胎組織情況也是如此。四、神經(jīng)組織細胞培養(yǎng)116神經(jīng)膠質(zhì)細胞為較易培養(yǎng)成分，它分少突、星形和小膠質(zhì)三種。神經(jīng)膠質(zhì)細胞與神經(jīng)元有共存關(guān)系。神經(jīng)膠質(zhì)細胞為較易培養(yǎng)成分，它分少突、星形和小膠質(zhì)三種。神經(jīng)117人腦膠質(zhì)瘤細胞人腦膠質(zhì)瘤細胞118大鼠c6膠質(zhì)細胞大鼠c6膠質(zhì)細胞119不同類型細胞培養(yǎng)特點課件120(一)初代培養(yǎng)神經(jīng)元能發(fā)生一定分化現(xiàn)象，如生長突起，但因無增殖能力，最后衰退死亡；但神經(jīng)膠質(zhì)尤以星形細胞能繼續(xù)生存和分裂增殖。(二)傳代培養(yǎng)神經(jīng)膠質(zhì)細胞是神經(jīng)組織中比較容易培養(yǎng)的成分。不僅能獲得生長的膠質(zhì)細胞并可形成能傳代的二倍體細胞系。(一)初代培養(yǎng)121(三)培養(yǎng)方法人腦組織可用于神經(jīng)膠質(zhì)細胞培養(yǎng)，培養(yǎng)組織來自手術(shù)室無菌取腦髓灰質(zhì)或白質(zhì)均可用于培養(yǎng)，1．程序：(1)細胞懸液制備：獲取腦組織后，先仔細剝除腦膜和血管等纖維成分，置入Hanks液中漂洗1~2次后，置于30~50倍的Hanks液中；腦組織比較柔軟，反復(fù)吹打即可制備成細胞懸液；(2)排除脂肪成分和其它碎塊：把懸液注入離心管中，在室溫直立5~10分鐘后，細胞或細胞團塊自然下沉，脂肪等雜物易漂浮于懸液表層，吸除上清，如此反復(fù)二三次可獲較多的細胞成分；(三)培養(yǎng)方法122(3)濾過、計數(shù)、接種：向末次沉降物中加入適量營養(yǎng)液，通過紗網(wǎng)或紗布濾過，計數(shù)細胞并調(diào)整好細胞密度，接種入培養(yǎng)瓶或皿中，置5％C02溫箱中培養(yǎng)；(4)傳代：細胞生長匯合后，可用0.25％胰蛋白酶消化法做傳代處理。(3)濾過、計數(shù)、接種：向末次沉降物中加入適量營養(yǎng)液，通過紗1232．生長特點：接種后初期，細胞可能出現(xiàn)飄浮不貼壁現(xiàn)象，貼壁后在短期內(nèi)也可能不見細胞分裂現(xiàn)象；細胞適應(yīng)環(huán)境過程較長，然而一旦生長后，即能進入較旺盛的增殖狀態(tài)。生長開始常雜有巨噬細胞、成纖維細胞和上皮細胞等，傳二、三代后，這些成分即消失，逐漸形成均一的星形膠質(zhì)細胞，一般形成連接不甚緊密的單層細胞2．生長特點：124第二節(jié)腫瘤細胞培養(yǎng)腫瘤細胞在組織培養(yǎng)中占有核心的位置，首先癌細胞是比較容易培養(yǎng)的細胞，當(dāng)前建立的細胞系中癌細胞系是最多的。腫瘤細胞培養(yǎng)是研究癌變機理、抗癌藥檢測、癌分子生物學(xué)極其重要的手段。第二節(jié)腫瘤細胞培養(yǎng)腫瘤細胞在組織培養(yǎng)中占有核心的位置125培養(yǎng)方法腫瘤細胞培養(yǎng)成功關(guān)鍵在于：取材、