親和層析法課件

親和層析法親和層析法的基本介紹操作過程親和層析法的應用主要內容制備方法

1、生物親和作用生物物質具有識別特定物質并與該物質的分子相結合的能力。這種識別并結合的能力，能區(qū)分結構和性質非常相近的其它分子。如蛋白酶與輔酶、抗原和抗體、激素與其受體等體系。由于分離方法的特異性不強，導致分離純化的收得率較低；為了解決這一問題，一種有效的分離方法應運而生——親和層析(AffinityChromatography，AC)，利用被分離的生命大分子物質和特異性配體之間能可逆性結合與解離的原理而建立的層析方法。在親和層析中，作為固定相的一方稱為配基。配基必須偶聯(lián)于不溶性母體上。母體又稱為載體或擔體，一般采用瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝照、聚丙烯酰胺凝膠和纖維素等。親和層析載體的組成配體以共價鍵結合到活化的基質上，構成固相載體。原理親和的一對分子中的一方以共價鍵形式與不溶性載體相連作為固定相吸附劑；當含有混合組份的樣品（流動相）通過此固定相時，只有和固定相分子有特異親和力的物質，才能被固定相吸附結合，其它沒有親和力的無關組份就隨流動相流出；然后改變流動組成份，將結合的親和物洗脫下來。

3、特點優(yōu)點：上樣量大，純化過程簡單、迅速，且分離效率高，被分離物質的活性不易喪失。特別適用于分離純化一些含量低、穩(wěn)定性差的生物大分子。缺點：每分離一種物質都必須找到合適的配體，并將其制備成固相載體，在洗脫中，交聯(lián)在層析介質上的配基可能脫落并進入產品中，從而造成不良影響，如抗體、染料等配基。成本相對較昂貴。4、親和層析的分類特異性配體親和層析：配體一般為復雜的生命大分子物質（如抗體、受體、酶的類似物等）。其特點是吸附特異性強，結合力大。通用性配體親和層析：配體一般為簡單的小分子物質（如金屬、染料、氨基酸等）。其成本低，具有較高的吸附容量，但分辨率不及前者。5、親和層析的類型根據(jù)配體與生物大分子之間相互作用體系不同，可以把親和層析分為：生物親和層析利用自然界中存在的生物特異性相互作用物質對的親和作用，通常具有高的選擇性，典型的物質對有酶-底物，

酶-抑制劑，激素-受體等。免疫親和層析利用抗原抗體中的一方為配體，親和吸附另一方的分離系統(tǒng)。廣泛應用于許多以單克隆抗體作為親和配體的典型蛋白質純化。用免疫層析柱進行各種類型的免疫檢測被稱為免疫檢測法，特別適用于檢測含量低微的樣品。親和層析的基本原理操作過程親和層析的應用主要內容制備方法②具有與基質共價結合的基團與待分離物質有適當?shù)挠H和力，而與樣品中其它組分沒有明顯的親和力，對其它組分沒有非特異性吸附作用。③配體要能夠與基質穩(wěn)定的共價結合在實驗過程中不易脫落，并且配體與基質偶聯(lián)后，對其結構沒有明顯改變，尤其是偶聯(lián)過程不涉及配體中與待分離物質有親和力的部分，對二者的結合沒有明顯影響。④配體自身應具有較好的穩(wěn)定性在實驗中能夠耐受偶聯(lián)以及洗脫時可能的較劇烈的條件，可以多次重復使用。

根據(jù)配體對待分離物質的親和性的不同，可以將其分為兩類：特異性配體（specificligand）和通用性配體（generalligand）。特異性配體一般是指只與單一或很少種類的蛋白質等生物大分子結合的配體。如生物素－親和素、抗原－抗體、酶－抑制劑、激素－受體等，它們結合都具有很高的特異性。

通用性配體一般是指特異性不是很強，能和某一類的蛋白質等生物大分子結合的配體，如各種凝集素可以結合各種糖蛋白等。通用性配體對生物大分子的專一性雖然不如特異性配體，但通過選擇合適的洗脫條件也可以得到很高的分辨率。而且這些配體還具有結構穩(wěn)定、偶聯(lián)率高、吸附容量高、易于洗脫、價格便宜等優(yōu)點，所以在實驗中得到了廣泛的應用。親和層析的基本原理操作過程親和層析的應用主要內容制備方法

層析前：制備親和層析劑

選擇根據(jù)欲分離物質特性配基選擇根據(jù)配基分子大小及基團特性載體洗脫：削弱目的產物和親和吸附配體間的相互作用。包括：非專一性洗脫和專一性洗脫偶聯(lián)親和層析劑1、操作流程2、基質活化當用小分子化合為作為配體時，由于空間位阻作用，難于與配對的大分子親和吻合，常在母體與配體之間引入適當長度的連接臂。要使不溶性母體與配體偶聯(lián)或通過連接臂與配體偶聯(lián)，必須先使母體活化。即使母體引入某一活潑的基團，才能以共價鍵與配體偶聯(lián)?；|的活化是指通過對基質進行一定的化學處理，使基質表面上的一些化學基團轉變?yōu)橐子诤吞囟ㄅ潴w結合的活性基團。不同的載體活化需要不同的活化劑。

常用：溴化氰（CNBr）、環(huán)氧氯丙烷、1,4-丁二醚、戊二醛、高碘酸鹽、苯醌等。活化溴化腈活化法溴化氰活化法是最常用的活化方法之一，活化過程主要是生成亞胺碳酸活性基團，它可以和伯氨（NH2）反應，主要生成異脲衍生物。反應如下：缺點：基質和配體偶聯(lián)后生成的異脲衍生物中氨基的pKa＝10.4，所以通常會帶一定的正電荷，從而使基質可能有陰離子離子交換作用，增大了非特異性吸附，影響親和層析的分辨率。另外溴化氰活化的基質與配體結合不夠穩(wěn)定，尤其是當與小配體結合時，可能會出現(xiàn)配體脫落現(xiàn)象。另外溴化氰有劇毒、易揮發(fā)，所以操作不便。3、偶聯(lián)

經(jīng)過活化和洗滌過的基質與等體積的0.2-0.5mol/L碳酸鹽緩沖液混合，緩慢攪拌2小時，或室溫下過夜，以便配體和基質充分偶聯(lián)而形成固體載體。對于偶聯(lián)極牢固會喪失活性的大分子物質配體，則應在低pH值緩沖液中反應或活化基質預先在pH8.3的堿性溶液中進行適當?shù)乃庾饔?，這樣可提高配體的活性。配體和基質偶聯(lián)完畢后，必須要反復洗滌，以去除未偶聯(lián)的配體。另外要用適當?shù)姆椒ǚ忾]基質中未偶聯(lián)上配體的活性基團，也就是使基質失活，以免影響后面的親和層析分離。例如對于能結合氨基的活性基團，常用的方法是用2－乙醇胺、氨基乙烷等小分子處理。

4、配體結合量的測定

配體結合量一般是用每毫升或每克貯存膠束縛配體的量來表示，測得的配體結合量，可作為決定親和吸附劑實際用量的參數(shù)，具體測定方法有直接測定法（2,4,6-三硝基苯磺酸鈉的顏色試驗和根據(jù)配體的特征來進行測定）和間接測定法（推算法和根據(jù)親和吸附劑對被吸附物質的操作容量可計算配體的結合量）。親和層析的應用親和層析的基本原理操作步驟目 錄制備方法親和層析能有效地保持生物活性物質的高級結構的穩(wěn)定性，其回收率也非常高，對含量極少又不穩(wěn)定的生物活性藥物的分離極為有效，它是一種專門用于分離純化生物大分子的層析分離技術。相應的配體

所要分離的目的產物底物、抑制劑、輔酶（輔因子）抗體凝集素激素輔酶和磷酸酰苷過渡金屬離子（Cu2+等）組氨酸肝素酶抗原、病毒、細胞多糖、糖蛋白、細胞受體受體、載體蛋白脫氫酶和激酶蛋白質蛋白質脂蛋白、脂肪酶、甾體受體、限制性核酸內切酶、抗凝血酶、凝血蛋白質等抗體利用抗體為配基的親和層析又稱為免疫親和層析（Immunoaffinitychromatography）。抗體與抗原之間具有高度特異性結合能力，結合常數(shù)一般為107～1012L/mol。因此，利用免疫親和層析法，特別是以單抗為配基的免疫親和層析法是高度純化蛋白質類生物大分子的有效手段。凝集素凝集素（lectin）是與糖特異性結合的蛋白質（酶和抗體除外）的總稱，大部分凝集素為多聚體，含有兩個以上的糖結合部位，不同的凝集素與糖結合的特異性不同。例如，常用做親和配基的伴刀豆球蛋白A(concanavalinA，conA)與葡聚糖和甘露糖的親和結合作用較強。組氨酸組氨酸的性質比較獨特：具有弱疏水性、咪唑環(huán)為弱電性。因此組氨酸可與蛋白質發(fā)生親和結合作用。這種親和作用的機理尚不十分清楚。在鹽濃度較低和pH約等于目標蛋白質等電點的溶液中，固定化組氨酸的親和吸附作用最強，隨著鹽濃度增大，親和吸附作用降低。因此利用組氨酸為配基可親和分離等電點相差較大的蛋白質，洗脫則可采用增大鹽濃度的梯度洗脫法。肝素肝素（heparin）是存在于哺乳動物的肝、肺、腸等臟器中的酸性多糖類物質，分子量一般為5～30KD，具有抗凝血作用。肝素與脂蛋白、脂肪酶、甾體受體、限制性核酸內切酶、抗凝血酶、凝血蛋白質等具有親和作用，可用作這些物質的親和配基。肝素的親