酶工程酶分子修飾

關(guān)于酶工程酶分子修飾第1頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾什么是酶分子修飾酶分子修飾（enzymemolecularmodification）通過(guò)各種方法使酶分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的催化特性的技術(shù)過(guò)程酶分子工程（enzymemolecularengineering）指按照酶的各種特性的需要，依據(jù)結(jié)構(gòu)－性能間的關(guān)系，在分子水平上實(shí)現(xiàn)酶的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)和操作分子生物學(xué)水平：用基因工程方法對(duì)DNA或RNA進(jìn)行分子改造，以獲得化學(xué)結(jié)構(gòu)更合理的酶蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)水平：對(duì)天然的酶分子進(jìn)行改造，包括酶一級(jí)結(jié)構(gòu)中氨基酸置換、肽鏈切割、氨基酸側(cè)鏈修飾等?第2頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾對(duì)酶進(jìn)行分子修飾的原因和依據(jù)在非生理?xiàng)l件下，酶的某些性質(zhì)不滿足工程應(yīng)用生理最適溫度、pH值≠體外最適溫度、pH值酶分子對(duì)熱、酸、堿、有機(jī)溶劑的耐受性較差酶在非生理?xiàng)l件下活力下降，抗原性顯著理論依據(jù)和方法酶的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與酶催化特性的關(guān)系：構(gòu)效關(guān)系理性設(shè)計(jì)（rationaldesign）：找出關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，在掌握酶的構(gòu)效關(guān)系的基礎(chǔ)上，有目的地對(duì)其進(jìn)行改造半理性設(shè)計(jì)（semi-rationaldesign）：以基因的隨機(jī)重組為手段，參考酶的構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行關(guān)鍵位點(diǎn)的改造第3頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾酶分子修飾的意義：我們究竟要做什么？應(yīng)用角度——酶工程提高酶的催化效率，改變底物專一性增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性，降低/消除酶的抗原性研究角度——酶學(xué)研究酶分子中一級(jí)結(jié)構(gòu)的改變對(duì)酶空間構(gòu)象的影響，進(jìn)一步探索酶的結(jié)構(gòu)與催化特性之間的關(guān)系探測(cè)酶活性必需氨基酸的性質(zhì)和數(shù)目探索酶分子的拓?fù)鋵W(xué)及寡聚酶的亞基結(jié)合狀態(tài)探測(cè)酶蛋白部分區(qū)域的構(gòu)象狀態(tài)，以及結(jié)構(gòu)變化與運(yùn)動(dòng)探索酶的作用機(jī)理和催化反應(yīng)歷程催化特性環(huán)境適應(yīng)性第4頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾酶分子修飾的條件修飾反應(yīng)盡可能在酶穩(wěn)定條件下進(jìn)行，并盡量不破壞維持酶活性功能的必需基團(tuán)pH值與離子強(qiáng)度決定了酶蛋白分子中反應(yīng)基團(tuán)的解離狀態(tài)修飾反應(yīng)的溫度與時(shí)間嚴(yán)格控制溫度和時(shí)間可以減少以至消除一些非專一性的修飾反應(yīng)反應(yīng)體系中酶與修飾劑的比例控制二者的比例，防止酶的過(guò)度修飾而導(dǎo)致的活性完全喪失第5頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾第6頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾化學(xué)修飾的方法學(xué)揭示了蛋白質(zhì)必需基團(tuán)的化學(xué)修飾和活性喪失的定量關(guān)系鄒氏作圖法袁勤生,《現(xiàn)代酶學(xué)》p139第7頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾化學(xué)修飾的方法學(xué)第8頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾酶分子修飾的種類金屬離子置換修飾（重點(diǎn)）大分子結(jié)合修飾（重點(diǎn)）側(cè)鏈基團(tuán)修飾（重點(diǎn)）親和修飾肽鏈有限水解修飾（重點(diǎn)）核苷酸鏈有限水解修飾氨基酸置換修飾核苷酸置換修飾酶分子的物理修飾酶的定向進(jìn)化修飾第9頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾金屬離子置換修飾Metalionsubstitutemodification把酶分子中的金屬離子換成另一種金屬離子，使酶的催化特性發(fā)生改變的修飾方法通過(guò)修飾了解各種金屬離子在酶催化過(guò)程中的作用，闡明催化機(jī)制適用對(duì)象：金屬酶（metalloenzyme）一種結(jié)合金屬的酶，以一個(gè)或幾個(gè)金屬離子作為輔因子金屬離子或是直接參與催化作用，或是對(duì)保持酶的活性和構(gòu)象起穩(wěn)定作用金屬酶純化時(shí)仍保留著定量的功能金屬離子第10頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾金屬離子置換修飾常見的金屬酶及其離子種類-淀粉酶——Ca2+、Mg2+、Zn2+谷氨酸脫氫酶——Zn2+過(guò)氧化氫酶——Fe2+?；被崦浮猌n2+超氧化物歧化酶——Cu2+、Zn2+細(xì)胞色素P450單加氧酶——Fe2+固氮酶——Fe(II)、Mo(IV)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶——Se(IV)主要的金屬離子Ca、Mg、Cu、Zn、Co、Fe、Mn等CytP450第11頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾金屬離子置換修飾金屬離子置換修飾的方法酶的提純除去原有金屬離子加入金屬螯合劑，如EDTA等，讓酶分子中的金屬離子與EDTA形成螯合物透析、超濾或?qū)游龀ヲ衔锛尤胫脫Q的離子加入含另一種金屬離子的溶液，酶蛋白與其結(jié)合用透析或?qū)游龅确椒ǔノ唇Y(jié)合的離子第12頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾金屬離子置換修飾金屬離子置換修飾的作用闡明金屬離子對(duì)酶催化作用的影響一般在活性中心的金屬離子能與底物或輔酶/輔基可逆結(jié)合，從而起到催化作用提高酶的催化效率將Zn型-淀粉酶置換成Ca型，活力可提高20%～30%增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性Fe-SOD置換成Mn-SOD后穩(wěn)定性增強(qiáng)，對(duì)NaN3

敏感性降低改變酶的動(dòng)力學(xué)特性?；被崴饷富钚圆课坏腪n被Co置換后，酶的底物專一性（Km

值）和最適pH都顯著改變第13頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾大分子結(jié)合修飾Macromoleculescombinemodification采用水溶性大分子與酶的側(cè)鏈基團(tuán)共價(jià)結(jié)合，使酶分子的空間構(gòu)象發(fā)生某些精細(xì)的改變，從而改變酶催化特性的方法常用的大分子糖、糖的衍生物聚乙二醇（PEG）含C=C雙鍵單體聚合得到的聚合物多肽鏈，甚至蛋白質(zhì)第14頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾大分子結(jié)合修飾大分子結(jié)合修飾的方法選擇修飾劑選擇溶解性好、生物相容性好、抗原性弱、無(wú)毒的大分子聚乙二醇（PEG）、寡聚糖、多糖及其衍生物等修飾劑的活化將修飾劑分子中的基團(tuán)（—OH）轉(zhuǎn)化為高反應(yīng)性的基團(tuán)修飾反應(yīng)將活化過(guò)的修飾劑與純化的酶液按照一定比例混合反應(yīng)，控制溫度、pH等條件分離層析分離，除去多余的修飾劑第15頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾大分子結(jié)合修飾修飾劑——聚乙二醇（polyethyleneglycol，PEG）PEG既可溶于水，又可溶于多種有機(jī)溶劑微毒或無(wú)毒免疫原性低生物相容性好，已通過(guò)FDA認(rèn)證分子量范圍很寬，從幾百到數(shù)十萬(wàn)，選擇余地大末端有兩個(gè)能被活化的—OH基團(tuán)為了獲得單功能的PEG，將其中一個(gè)羥基轉(zhuǎn)化為烷氧基，即單甲氧基聚乙二醇（MPEG）第16頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾大分子結(jié)合修飾修飾劑——MPEG三氯均三嗪活化法（重點(diǎn)掌握）第17頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾大分子結(jié)合修飾修飾劑——MPEG疊氮法：將—OH轉(zhuǎn)化為—N3

基團(tuán)第18頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾大分子結(jié)合修飾修飾劑——MPEG琥珀酸酐法（溴代或碘代琥珀酸酐）第19頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾大分子結(jié)合修飾修飾劑——MPEG重氮法：將—OH轉(zhuǎn)化為—N=N基團(tuán)第20頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾大分子結(jié)合修飾修飾劑——右旋糖酐（dextran）右旋糖酐是由葡萄糖通過(guò)-1,6-糖苷鍵形成的高分子多糖水溶性較好生物相容性好糖鏈上的2,3-雙羥基經(jīng)活化后可與酶分子中的氨基結(jié)合第21頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾大分子結(jié)合修飾修飾劑——右旋糖酐溴化氰（CNBr）法：糖酐活化第22頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾大分子結(jié)合修飾修飾劑——右旋糖酐溴化氰（CNBr）法：與酶偶聯(lián)第23頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾大分子結(jié)合修飾修飾劑——右旋糖酐高碘酸（HIO4）氧化法第24頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾大分子結(jié)合修飾修飾劑——右旋糖酐高碘酸（HIO4）氧化法：增加連接臂第25頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾大分子結(jié)合修飾修飾劑——肝素（heparin）由D--葡萄糖醛酸（或L--艾杜糖醛酸）和N-乙酰氨基葡萄糖形成重復(fù)二糖單位組成的多糖在體內(nèi)外都有抗凝血作用臨床上主要用于血栓栓塞性疾病、心肌梗死、心血管手術(shù)、心臟導(dǎo)管檢查、體外循環(huán)、血液透析等第26頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾大分子結(jié)合修飾修飾劑——肝素碳二亞胺法（—COOH反應(yīng)）第27頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾大分子結(jié)合修飾修飾劑——肝素三氯均三嗪法第28頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾大分子結(jié)合修飾大分子修飾的作用——提高酶的催化效率根本原因：改變了酶的空間構(gòu)象，有可能促使酶活性中心與底物更容易結(jié)合酶的催化功能是由其空間結(jié)構(gòu)決定的例1：1分子核糖核酸酶與6.5分子右旋糖酐共價(jià)結(jié)合，活力提高到原有的2.25倍例2：1分子胰凝乳蛋白酶與11分子右旋糖酐共價(jià)結(jié)合，酶的催化效率提高到原酶的5.1倍位阻效應(yīng)第29頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾大分子結(jié)合修飾大分子修飾的作用——增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性水溶性大分子與酶結(jié)合，在酶分子外層形成保護(hù)層，可以保護(hù)酶的空間構(gòu)象不溶性大分子與酶結(jié)合，形成固定化酶，也提高酶的穩(wěn)定性穩(wěn)定性的表征——半衰期酶的半衰期：酶活力降低到原來(lái)活力一半時(shí)所經(jīng)過(guò)的時(shí)間大分子修飾酶半衰期相對(duì)穩(wěn)定性天然SOD6min1右旋糖酐-SOD7h70Ficoll(低分子量)-SOD14h140Ficoll(高分子量)-SOD24h240PEG-SOD35h350第30頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾大分子結(jié)合修飾大分子修飾的作用——降低或消除抗原性酶非經(jīng)口（如注射）進(jìn)入人體后，會(huì)成為一種抗原，刺激體內(nèi)產(chǎn)生抗體；當(dāng)這種酶再次注射進(jìn)體內(nèi)時(shí)，抗體就會(huì)與作為抗原的酶特異地結(jié)合，使酶失去催化功能經(jīng)過(guò)大分子修飾，酶蛋白的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，致使酶蛋白與抗體之間不再發(fā)生特異性識(shí)別，從而降低了酶蛋白與體內(nèi)抗體的結(jié)合幾率例如：L-天冬酰胺酶[EC3.5.1.1]經(jīng)PEG修飾后抗原性顯著降低，已經(jīng)在1994年被FDA批準(zhǔn)用于治療急性淋巴性白血病第31頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾側(cè)鏈基團(tuán)修飾Sideresiduesmodification采用一定的（化學(xué)）方法，使酶蛋白側(cè)鏈基團(tuán)發(fā)生改變，從而改變酶催化特性的修飾方法用于研究各種基團(tuán)在酶分子中的作用及其對(duì)酶的結(jié)構(gòu)、特性和功能的影響熒光試劑修飾側(cè)鏈，了解酶在水溶液中的構(gòu)象各基團(tuán)對(duì)酶結(jié)構(gòu)和活性的影響，研究必需基團(tuán)的組成對(duì)非催化基團(tuán)修飾可改變酶的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，改變酶對(duì)特殊底物的束縛能力利用側(cè)鏈修飾測(cè)定某種基團(tuán)在酶分子中的數(shù)量改變酶的結(jié)構(gòu)和催化性能第32頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾側(cè)鏈基團(tuán)修飾兩類酶的修飾蛋白類酶?jìng)?cè)鏈基團(tuán)可組成各種次級(jí)鍵對(duì)蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的形成和穩(wěn)定起重要作用，而當(dāng)這些功能基團(tuán)發(fā)生改變，引起次級(jí)鍵改變，使空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些變化，從而引起酶特性和功能的改變親核性側(cè)鏈基團(tuán)：—OH、—COOH、—NH2、—SH、咪唑環(huán) 親核性取代的氨基酸殘基:Ser、Cys、Asp、Thr、Lys、His等親電性側(cè)鏈基團(tuán)：芳香環(huán)、吲哚環(huán) 親電性取代的氨基酸殘基:Tyr、Trp核酸類酶磷酸基，核糖糖環(huán)上的—OH、堿基雜環(huán)及其—NH2、—OH等第33頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾側(cè)鏈基團(tuán)修飾幾種重要的修飾反應(yīng)?；狾H（Ser、Thr、Tyr）、—SH（Cys）、—NH2（Lys）烷基化多種基團(tuán)均可發(fā)生，包括芳環(huán)和雜環(huán)氧化和還原酚基、—SH、雜環(huán)等芳香環(huán)取代涉及Phe、Tyr、Trp等幾種芳香族氨基酸其他反應(yīng)，如CNBr裂解反應(yīng)第34頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾側(cè)鏈基團(tuán)修飾各類側(cè)鏈基團(tuán)的修飾氨基修飾（Lys）羧基修飾（Asp、Glu）巰基修飾（Cys）胍基修飾（Arg）羥基修飾（Ser、Thr、Tyr）咪唑基修飾（His）吲哚基修飾（Trp）甲硫基修飾（Met）分子內(nèi)交聯(lián)第35頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾側(cè)鏈基團(tuán)修飾1.氨基（—NH2）修飾的主要特點(diǎn)氨基在酶蛋白中主要是Lys的-NH2

和肽鏈末端氨基非質(zhì)子化的-NH2

親核反應(yīng)活性很高，易被選擇性修飾一般情況下-NH2

的pKa=10，其解離程度取決于微環(huán)境氨基的修飾反應(yīng)主要有酯化、N-烷基化等第36頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾側(cè)鏈基團(tuán)修飾修飾反應(yīng)——氨基?；磻?yīng)第37頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾側(cè)鏈基團(tuán)修飾修飾反應(yīng)——氨基TNBS反應(yīng)和Sanger反應(yīng)第38頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾側(cè)鏈基團(tuán)修飾修飾反應(yīng)——氨基N-烷基化第39頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾側(cè)鏈基團(tuán)修飾2.羧基（—COOH）修飾的主要特點(diǎn)羧基在酶蛋白中主要是Asp和Glu的側(cè)鏈—COOH，以及肽鏈的末端羧基在水溶液中，—COOH通常解離成負(fù)離子，親核性降低，對(duì)其修飾的方法有限，主要反應(yīng)為成酯、成酰胺反應(yīng)第40頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾側(cè)鏈基團(tuán)修飾修飾反應(yīng)——羧基碳二亞胺反應(yīng)（羧基修飾的標(biāo)準(zhǔn)方法）第41頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾側(cè)鏈基團(tuán)修飾修飾反應(yīng)——羧基酯化反應(yīng)第42頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾側(cè)鏈基團(tuán)修飾3.巰基（—SH）修飾的主要特點(diǎn)巰基在酶蛋白中的來(lái)源是Cys的-SH巰基的親核性強(qiáng)，往往是酶分子中反應(yīng)活性最高的基團(tuán)巰基容易被氧化成—S—S—，在維持蛋白亞基之間的相互作用和酶催化過(guò)程中起重要作用巰基用烷基化試劑修飾后一般能得到穩(wěn)定的修飾產(chǎn)物第43頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾側(cè)鏈基團(tuán)修飾修飾反應(yīng)——巰基二硫鍵置換反應(yīng)第44頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾側(cè)鏈基團(tuán)修飾修飾反應(yīng)——巰基與含汞有機(jī)物的反應(yīng)（—SH對(duì)Hg的親和力很強(qiáng)）第45頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾側(cè)鏈基團(tuán)修飾修飾反應(yīng)——巰基S-烷基化反應(yīng)第46頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾側(cè)鏈基團(tuán)修飾4.胍基（—N=C(NH2)2）修飾的主要特點(diǎn)胍基存在于酶蛋白的Arg殘基側(cè)鏈上在結(jié)合帶有陰離子底物的酶的活性部位中起重要作用胍基堿性強(qiáng)，難以和大多數(shù)試劑反應(yīng)，一般采用具有兩個(gè)鄰位羰基的化合物，在中性或弱堿性條件下反應(yīng)，一般是可逆反應(yīng)第47頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾側(cè)鏈基團(tuán)修飾修飾反應(yīng)——胍基（與鄰二酮的反應(yīng)）第48頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾側(cè)鏈基團(tuán)修飾5.酚基和羥基（—OH）修飾的主要特點(diǎn)酶蛋白中含羥基的氨基酸殘基有：Ser、Thr、Tyr羥基的專一性修飾較困難，通常修飾劑能同時(shí)修飾羥基、氨基和巰基Tyr的酚羥基相比于Ser和Thr的羥基要活潑一些，更容易發(fā)生修飾；酚基具有芳香性，能發(fā)生親電取代反應(yīng)第49頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾側(cè)鏈基團(tuán)修飾修飾反應(yīng)——酚基和酚羥基酚基親電取代反應(yīng)第50頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾側(cè)鏈基團(tuán)修飾修飾反應(yīng)——（酚）羥基O-酰基化反應(yīng)第51頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾側(cè)鏈基團(tuán)修飾6.咪唑基修飾的主要特點(diǎn)咪唑基存在于酶蛋白的His殘基側(cè)鏈上His是多種酶的活性中心，是電荷中繼網(wǎng)中的重要成員對(duì)His咪唑基的修飾，一般是通過(guò)N-烷基化或C-親核取代來(lái)進(jìn)行對(duì)咪唑進(jìn)行修飾后，酶活性一般會(huì)受到顯著影響第52頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾側(cè)鏈基團(tuán)修飾修飾反應(yīng)——咪唑基N-取代反應(yīng)焦碳酸二乙酯第53頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾側(cè)鏈基團(tuán)修飾修飾反應(yīng)——咪唑基雜環(huán)上的親電取代反應(yīng)第54頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾側(cè)鏈基團(tuán)修飾7.吲哚基修飾的主要特點(diǎn)吲哚基存在于酶蛋白的Trp殘基側(cè)鏈上Trp殘基疏水性較強(qiáng)，一般位于酶分子的內(nèi)部，反應(yīng)活性比氨基和巰基差，因此對(duì)其修飾較困難，很多能與吲哚基反應(yīng)的試劑，一般優(yōu)先與巰基或氨基反應(yīng)有時(shí)候Tyr會(huì)對(duì)吲哚基的修飾產(chǎn)生干擾第55頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾側(cè)鏈基團(tuán)修飾修飾反應(yīng)——吲哚基與Koshland試劑的反應(yīng)第56頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾側(cè)鏈基團(tuán)修飾8.甲硫基修飾的主要特點(diǎn)酶蛋白中Met殘基中的硫以硫醚的形式存在硫醚中的硫原子雖然具有親核性，但反應(yīng)活性較差，在溫和的條件下一般不發(fā)生反應(yīng)硫醚的主要反應(yīng)主要是氧化反應(yīng)，產(chǎn)物為砜和亞砜；另外，采用某些試劑也可以進(jìn)行S-烷基化反應(yīng)第57頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾側(cè)鏈基團(tuán)修飾修飾反應(yīng)——甲硫基第58頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾側(cè)鏈基團(tuán)修飾9.分子內(nèi)交聯(lián)（掌握概念）采用雙功能基團(tuán)化合物（雙功能試劑），在酶分子中對(duì)空間距離較近的兩個(gè)氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)之間進(jìn)行共價(jià)交聯(lián)第59頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾側(cè)鏈基團(tuán)修飾分子內(nèi)交聯(lián)試劑同型、異型可裂解、不可裂解第60頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾親和修飾Affinitymodification，酶的專一性修飾試劑作用于特定部位的某一基團(tuán)，而不與這一部位之外的同類基團(tuán)反應(yīng)用于酶化學(xué)修飾的試劑，即使對(duì)某一基團(tuán)反應(yīng)是專一的，也仍然有多個(gè)同類殘基與之反應(yīng)，因此對(duì)某個(gè)特定殘基的選擇性修飾比較困難，為了解決此問題，開發(fā)了親和標(biāo)記試劑這類修飾劑也稱為位點(diǎn)專一性抑制劑，一般具有與底物相似的結(jié)構(gòu)，對(duì)酶活性部位具有高度的親和性，可專一性標(biāo)記于酶的活性中心上，使酶不可逆失活，因此也稱專一性不可逆抑制劑第61頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾親和修飾第62頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾親和修飾親和標(biāo)記試劑的特點(diǎn)在使酶不可逆失活以前，要與酶形成可逆復(fù)合物親和試劑的修飾程度是有限的競(jìng)爭(zhēng)性類似物的存在會(huì)降低修飾反應(yīng)速率親和試劑體積不能太大，否則造成較大的空間位阻修飾產(chǎn)物應(yīng)當(dāng)穩(wěn)定，應(yīng)便于表征和定量第63頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾親和修飾KS

型（競(jìng)爭(zhēng)性標(biāo)記試劑）根據(jù)底物的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的，具有與底物結(jié)構(gòu)相似的結(jié)合基團(tuán)，同時(shí)還具有能與酶活性部位氨基酸側(cè)鏈反應(yīng)的活性基團(tuán)特點(diǎn)底物、競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑及其他結(jié)構(gòu)類似物對(duì)修飾具有保護(hù)作用修飾反應(yīng)是定量定點(diǎn)進(jìn)行的Kcat

型（自殺性標(biāo)記試劑）根據(jù)酶催化過(guò)程設(shè)計(jì)，專一性很高具有酶的底物性質(zhì)，還有一個(gè)潛在的反應(yīng)基團(tuán)在酶催化下活化，與酶活性部位氨基酸側(cè)鏈發(fā)生反應(yīng)，不可逆地結(jié)合第64頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾肽鏈有限水解修飾Peptidechainlimithydrolysismodification在肽鏈的限定位點(diǎn)進(jìn)行水解，使酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生精細(xì)改變，從而改變酶催化特性的修飾方法肽鏈?zhǔn)堑鞍最惷傅闹麈湥敲阜肿咏Y(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)活性中心的肽段是酶催化作用必不可少的活性中心之外的肽段維持酶的空間構(gòu)象肽鏈被水解后可能出現(xiàn)的情況酶活性中心破壞，酶失去催化功能——探測(cè)酶活性中心位置酶活性中心構(gòu)象完整，酶活力保持不變或損失不多，但抗原性發(fā)生變化——提高酶的藥用價(jià)值活性中心形成，與底物結(jié)合能力提高并形成準(zhǔn)確的催化部位——酶催化功能增強(qiáng)或酶活力提高第65頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾肽鏈有限水解修飾酶蛋白主鏈修飾——酶切/酶原激活法胃蛋白酶原（pepsinogen）的自激活意義：保護(hù)作用，避免了過(guò)量的胃蛋白酶對(duì)胃壁自身進(jìn)行消化第66頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾肽鏈有限水解修飾酶蛋白主鏈修飾——酶切/酶原激活法胰蛋白酶原（trypsinogen）的水解激活

利用胰蛋白酶或腸激酶從trypsinogen的N-端切除一段六肽序列：N-Val—(Asp)4—Lys第67頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾肽鏈有限水解修飾酶蛋白主鏈修飾——酶切/酶原激活法胰凝乳蛋白酶原（chymotrypsinogen）的激活第68頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾肽鏈有限水解修飾酶蛋白主鏈修飾——酶切/酶原激活法Klenow片段：基因工程的工具酶E.coliDNA聚合酶I經(jīng)胰蛋白酶或枯草桿菌蛋白酶部分水解生成的C-末端605個(gè)氨基酸殘基片段。保留了DNA聚合酶I的5’3’聚合酶和3’5’外切酶活性，但缺少完整酶的5’3’外切酶活性。第69頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾核苷酸鏈剪切修飾Nucleotidechaincleavagemodification僅見于R酶的分子修飾，指在核苷酸鏈的限定位點(diǎn)進(jìn)行剪切，使R酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而改變其催化特性的方法L-19IVS的形成四膜蟲（Tetrahymena）26SrRNA前體自我剪接形成成熟的26SrRNA，同時(shí)生成414nt的線性間隔序列LIVSLIVS經(jīng)一系列剪接、環(huán)化、開環(huán)過(guò)程最終得到多功能R酶L-19IVS第70頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾氨基酸置換修飾Amino-acidsubstitutemodification將酶分子肽鏈上的某一個(gè)氨基酸置換成另一個(gè)氨基酸，從而改變酶催化特性的修飾方法肽鏈上某個(gè)氨基酸的改變會(huì)引起酶化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)象的改變氨基酸置換修飾的作用提高酶的催化效率（例：酪氨酸-RNA合成酶Thr51

Pro51，對(duì)ATP親和力提高近100倍，催化效率提高25倍）增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性（例：T4溶菌酶Ile3

Cys3，與Cys97

形成二硫鍵，熱穩(wěn)定性提高）改變酶的專一性（例：農(nóng)桿菌-葡萄糖苷酶Glu358Ala358，失去水解活性，卻能催化糖苷合成）第71頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾氨基酸置換修飾置換修飾方法——化學(xué)修飾對(duì)某些側(cè)鏈結(jié)構(gòu)相近的氨基酸殘基進(jìn)行基團(tuán)修飾，從而變成另一種氨基酸殘基難度較大，很難精確操作第72頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾氨基酸置換修飾置換修飾方法——定點(diǎn)突變?cè)贒NA序列中的某一特定位點(diǎn)上進(jìn)行堿基的改變蛋白質(zhì)工程常用的技術(shù)手段1983年，美國(guó)生物學(xué)家Ulmer首先提出了“蛋白質(zhì)工程”的概念蛋白質(zhì)工程通過(guò)改造蛋白質(zhì)相對(duì)應(yīng)基因中的堿基排列次序，或設(shè)計(jì)合成新的基因，將它克隆到宿主細(xì)胞中，通過(guò)基因表達(dá)而獲得具有新特性的蛋白質(zhì)的技術(shù)過(guò)程蛋白質(zhì)工程是在基因工程的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，在技術(shù)方面有諸多同基因工程技術(shù)相似的地方，因此蛋白質(zhì)工程也被稱為第二代基因工程第73頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾氨基酸置換修飾定點(diǎn)突變主要步驟1)新的分子結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)根據(jù)已知蛋白酶的化學(xué)結(jié)構(gòu)、空間結(jié)構(gòu)及其特性，確定新蛋白質(zhì)或酶的氨基酸排列順序

，乃至欲置換的核苷酸及其位置2)突變基因的核苷酸序列確定逆推法第74頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾氨基酸置換修飾定點(diǎn)突變主要步驟3)突變基因的獲得用DNA合成儀合成有數(shù)個(gè)核苷酸被置換了的寡核苷酸鏈，再以此寡核苷酸鏈為引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得所需的大量突變基因，即寡核苷酸誘導(dǎo)的定位突變4)新酶的獲得——重組表達(dá)將定位突變獲得的突變基因進(jìn)行體外重組，插入適當(dāng)?shù)幕蜉d體中，通過(guò)基因操作技術(shù)轉(zhuǎn)入特定的宿主細(xì)胞中，培養(yǎng)并表達(dá)所需的修飾酶第75頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾氨基酸置換修飾實(shí)驗(yàn)操作大致步驟1)先測(cè)定酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)2)用NMR、X射線衍射法等方法分析測(cè)定其三維結(jié)構(gòu)3)根據(jù)結(jié)構(gòu)信息選擇突變部位，即選定哪一個(gè)氨基酸殘基要被取代4)選擇4～6個(gè)氨基酸殘基的寡肽序列，其間含待取代的氨基酸殘基5)用化學(xué)法合成由12～18個(gè)堿基組成并為所選寡肽的氨基酸序列編碼的核苷酸序列，作為定位誘變的引物6)構(gòu)建單股質(zhì)粒，含有為所需蛋白質(zhì)編碼的基因，作為定點(diǎn)突變的模板第76頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾氨基酸置換修飾實(shí)驗(yàn)操作大致步驟7)將引物與單鏈模板DNA配對(duì)，用PCR法將引物延長(zhǎng)，形成互補(bǔ)鏈，得到共價(jià)閉合的雙鏈DNA，也叫異質(zhì)雙鏈質(zhì)粒8)將異質(zhì)雙鏈質(zhì)粒引入宿主細(xì)胞（如E.coli），轉(zhuǎn)化為兩個(gè)同質(zhì)雙鏈質(zhì)粒，一個(gè)含天然蛋白質(zhì)編碼的基因，另一個(gè)含編碼突變體的基因9)將這兩個(gè)基因分離并克隆，最后產(chǎn)物是細(xì)胞轉(zhuǎn)化突變型，能合成突變體蛋白質(zhì)，與母體蛋白質(zhì)僅有1個(gè)氨基酸的差別，這個(gè)氨基酸就是事先選定的突變部位第77頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾核苷酸置換修飾Nucleotidesubstitutemodification將R酶分子核苷酸鏈上的某個(gè)（或數(shù)個(gè)）核苷酸置換成其他的核苷酸，一般采用定點(diǎn)突變技術(shù)自我剪切酶的保守序列和剪切位點(diǎn)序列與酶的催化作用關(guān)系密切對(duì)自我剪切酶的結(jié)構(gòu)與功能研究可了解酶催化中心必需基團(tuán)，據(jù)此進(jìn)行分子改造，從催化分子內(nèi)反應(yīng)的R酶設(shè)計(jì)出催化分子間反應(yīng)的R酶第78頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾核苷酸置換修飾核苷酸置換對(duì)催化特性的影響例：L-19IVS活性中心堿基變化L-19IVS22～27位核苷酸序列底物催化產(chǎn)物III5’―GGAGGG―3’GGCCUCUAAAAA(1)GGGCCUCU+GAAAAAGGCCUGUAAAAA(2)G/GGCCGCUAAAAA(3)G/5’―GCAGGG―3’(1)G/(2)GGGCCUGU+GAAAAA(3)G/5’―GGCGGG―3’(1)G/(2)G/(3)GGGCCGCU+GAAAAA第79頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾核苷酸置換修飾Nucleotidesubstitutemodification例：錘頭型核酶（hammerheadribozyme）1989年，Koizumi證明只要保留11個(gè)核苷酸保守序列即可催化自我剪切反應(yīng)。第80頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾核苷酸置換修飾錘頭型核酶的置換修飾除了11個(gè)保守核苷酸以外的其他核苷酸都可以置換修飾第81頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾核苷酸置換修飾發(fā)夾型核酶（hairpinribozyme）的置換修飾1989年，Hamp提出煙草環(huán)斑病毒（sTRSV）負(fù)鏈RNA自我剪切反應(yīng)是基于發(fā)夾結(jié)構(gòu)（一種回文結(jié)構(gòu)），只要形成此結(jié)構(gòu)就會(huì)在底物識(shí)別序列處自動(dòng)催化剪切反應(yīng)第82頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾酶分子的物理修飾Physicalmodification通過(guò)各種物理方法，使酶分子的空間構(gòu)象發(fā)生某些改變，從而改變酶的某些特性和功能的方法研究極端條件下酶結(jié)構(gòu)和活性的變化“極端微生物”物理修飾的特點(diǎn)——非共價(jià)不改變酶的組成單位及其基團(tuán)酶分子中的共價(jià)鍵不發(fā)生改變——酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)不變副鍵發(fā)生某些改變和重排——酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化第83頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾酶分子的物理修飾物理修飾的效果改變底物特異性例：羧肽酶

經(jīng)高壓處理，其水解能力降低，而有利于催化肽的合成反應(yīng)（逆反應(yīng)）改變酶催化的最適溫度例：纖維素酶經(jīng)高壓處理，最適溫度下降，但在30～40oC條件下，活力提高了10%提高酶的穩(wěn)定性例：用鹽酸胍破壞胰蛋白酶的空間構(gòu)象，伸展肽鏈，再透析除去鹽酸胍，在不同溫度下重新構(gòu)建/恢復(fù)酶的構(gòu)象，50oC下重新構(gòu)建的酶穩(wěn)定性比天然酶提高5倍第84頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾酶的定向進(jìn)化修飾Enzymedirectedevolution模擬自然進(jìn)化（隨機(jī)突變和自然選擇）的過(guò)程，在體外進(jìn)行酶基因的人工隨機(jī)突變，建立突變基因文庫(kù)，在人工控制條件的特殊環(huán)境下，定向選擇得到具有優(yōu)良催化特性的酶的突變體定向進(jìn)化的三個(gè)過(guò)程隨機(jī)突變：產(chǎn)生基因多態(tài)性構(gòu)建突變基因文庫(kù)：將突變基因與適當(dāng)?shù)妮d體重組定向選擇：高通量篩選方法隨機(jī)突變的方法易錯(cuò)PCR（error-pronePCR）DNA改組（DNAshuffling）第85頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾酶的定向進(jìn)化修飾易錯(cuò)PCR（error-pronePCR）通常PCR使用的TaqDNA聚合酶失去了3’5’方向的校正活性，因此核苷酸錯(cuò)誤摻入的幾率約為5×10-5如果配合適當(dāng)?shù)臈l件，調(diào)整正常PCR體系中dNTPs的濃度和比例，提高M(jìn)g2+

濃度，引入Mn2+

，可以高頻率隨機(jī)引入錯(cuò)配的突變位點(diǎn)，構(gòu)建突變文庫(kù)，再篩選突變體連續(xù)多次反復(fù)地隨機(jī)誘變，通過(guò)每一步的積累產(chǎn)生有益突變第86頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾酶的定向進(jìn)化修飾DNA改組（DNAshuffling）從正突變的基因庫(kù)（可以通過(guò)易錯(cuò)PCR構(gòu)建）中分離出DNA片段，用脫氧核糖核酸酶DNaseI隨機(jī)切割，得到的隨機(jī)片段經(jīng)過(guò)不加引物的多次PCR循環(huán)，隨機(jī)片段之間互為模板和引物進(jìn)行擴(kuò)增，直至獲得全長(zhǎng)的基因?qū)⒂H本基因群中的優(yōu)勢(shì)突變盡可能地組合在一起，最終使酶分子的某一性質(zhì)得到進(jìn)一步進(jìn)化第87頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾酶的定向進(jìn)化修飾突變文庫(kù)的定向篩選根據(jù)進(jìn)化的目標(biāo)設(shè)定選擇環(huán)境條件例：為提高酶的熱穩(wěn)定性，可以在較高的溫度下培養(yǎng)重組細(xì)胞，并在每一次“突變－篩選”的循環(huán)中逐步提高培養(yǎng)溫度高通量篩選96孔板（384孔板）篩選標(biāo)記篩選（熒光標(biāo)記、放射性標(biāo)記）噬菌體表面展示技術(shù)酵母細(xì)胞表面展示技術(shù)……第88頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾酶的定向進(jìn)化修飾例：對(duì)硝基芐酯酶的定向進(jìn)化修飾第89頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾酶的定向進(jìn)化修飾例：酯酶的定向進(jìn)化修飾將10g用PCR擴(kuò)增過(guò)的親本DNA片段用DNaseI切割，在PwoDNA聚合酶催化下進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增，35輪循環(huán)后補(bǔ)加PwoDNA聚合酶，再進(jìn)行35輪循環(huán)，得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行第二次PCR常規(guī)擴(kuò)增將擴(kuò)增產(chǎn)物和pNB106R質(zhì)粒用BamHI和XbaI酶切，體外連接后轉(zhuǎn)化到E.coli.TG1宿主細(xì)胞中，獲得重組子在一定濃度DMF溶液中對(duì)底物L(fēng)CN-pNB的催化活力進(jìn)行篩選，得到一株高活性進(jìn)化酶；在DMF水溶液中催化水解含p-硝基芐酯結(jié)構(gòu)的化合物活力可提高30倍第90頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾修飾酶的特性總結(jié)修飾酶的酶學(xué)性質(zhì)變化最適pH值熱穩(wěn)定性體內(nèi)抗原性半衰期酶動(dòng)力學(xué)性質(zhì)對(duì)組織的分布能力變化第91頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾修飾酶的特性總結(jié)熱穩(wěn)定性修飾劑與酶形成多點(diǎn)交聯(lián)，一般能增強(qiáng)酶的熱穩(wěn)定性，可能的原因是多點(diǎn)交聯(lián)產(chǎn)生固定酶分子構(gòu)象的效應(yīng)PEG修飾酶在熱穩(wěn)定性上沒有明顯提高，可能由于PEG和酶是單點(diǎn)交聯(lián)酶分子內(nèi)基團(tuán)間相互作用在受熱情況下發(fā)生了變化，向熱力學(xué)上熵增加的方向變化，即從緊密有序趨于隨機(jī)松散通過(guò)修飾后，使酶天然構(gòu)象產(chǎn)生“剛性”，不易伸展打開，減小熱振動(dòng)，從而增強(qiáng)酶的熱穩(wěn)定性第92頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾修飾酶的特性總結(jié)最適pH值一般情況下，修飾酶的最適pH范圍擴(kuò)大豬肝尿酸酶的最適pH為10.5，在pH7.4的生理環(huán)境中酶活僅剩5~10%，用白蛋白修飾后，最適pH范圍擴(kuò)大，在pH7.4時(shí)仍保留60%酶活吲哚-3-鏈烷羥化酶修飾后，最適pH從3.5增加到5.5，在pH7左右時(shí)，修飾酶活力比天然酶增加3倍，在生理環(huán)境下抗腫瘤效果比天然酶大得多可能的原因修飾酶的微環(huán)境更穩(wěn)定修飾酶被“固定”在一個(gè)更活潑的狀態(tài)第93頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾修飾酶的特性總結(jié)半衰期酶經(jīng)修飾增強(qiáng)了抗蛋白水解、抗抑制劑和抗失活因子的能力及對(duì)熱穩(wěn)定性提高，半衰期一般都比天然酶延長(zhǎng)體內(nèi)抗原性有些修飾劑在消除酶抗原性上并無(wú)作用，如PVP（聚乙烯吡咯烷酮）修飾酶；糖類物質(zhì)也不容易消除酶的抗原性現(xiàn)在比較公認(rèn)的是PEG和人血清蛋白在消除酶抗原性上效果明顯，原因可能是修飾劑破壞（共價(jià)結(jié)合）或“遮蓋”了抗原決定簇，使之抗原性減弱或消除第94頁(yè)，共103頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)27分，星期六酶分子修飾修飾酶的特性總結(jié)酶動(dòng)力學(xué)性質(zhì)絕大多數(shù)酶經(jīng)修飾后最大反應(yīng)速度Vmax

沒有變化有些酶在修飾后，米氏常數(shù)Km

通常會(huì)增大，這可能是交聯(lián)于酶上的分子或基團(tuán)產(chǎn)生了空間障礙，影響了底物對(duì)酶的接近和結(jié)合修飾酶抵抗各種失活因子的能力增強(qiáng)和體內(nèi)半衰期的延長(zhǎng)，能夠彌補(bǔ)Km