無機(jī)及分析化學(xué)(第三版)第12章課件

第12章吸光光度法12.1概述12.2吸光光度法基本原理12.3分光光度計(jì)12.4顯色反應(yīng)及影響因素12.5光度分析法的設(shè)計(jì)12.6吸光光度法的誤差12.7常用的吸光光度法12.8吸光光度法的應(yīng)用第12章吸光光度法12.1概述吸光光度法：分子光譜分析法的一種，又稱分光光度法(spectrophotometry)，屬于分子吸收光譜分析方法基于外層電子躍遷12.1概述吸收光譜發(fā)射光譜散射光譜分子光譜原子光譜吸光光度法：分子光譜分析法的一種，又稱分光光度法(spect12.2吸光光度法基本原理1吸收光譜產(chǎn)生的原因光:一種電磁波,波粒二象性

光譜名稱波長(zhǎng)范圍X射線0.1~10nm遠(yuǎn)紫外光10~200nm近紫外光200~400nm可見光400~750nm近紅外光0.75~2.5um中紅外光2.5~5.0um遠(yuǎn)紅外光5.0~1000um微波0.1~100cm無線電波1～1000m當(dāng)光子的能量與分子的E匹配時(shí)，就會(huì)吸收光子

E=hu=hc/l12.2吸光光度法基本原理1吸收光譜產(chǎn)生的原因光譜名稱波a躍遷類型

價(jià)電子躍遷：σ→σ*,π→π*;n→σ*,n→π*

E(h)順序:n→π*<π→π*<n→σ*<σ→σ*

有機(jī)化合物的生色原理b生色團(tuán)（chromophore)和助色團(tuán)(auxochrome)

生色團(tuán):含有π→π*躍遷的不飽和基團(tuán)助色團(tuán):含非鍵電子的雜原子基團(tuán),如-NH2,-OH,-CH3…

與生色團(tuán)相連時(shí)，會(huì)使吸收峰紅移(bathochromicshift)，吸收強(qiáng)度增強(qiáng)a躍遷類型有機(jī)化合物的生色原理b生色團(tuán)（chromoph物質(zhì)的顏色吸收光顏色波長(zhǎng)范圍(l,nm)黃綠黃橙紅紫紅紫藍(lán)綠藍(lán)藍(lán)綠紫藍(lán)綠藍(lán)藍(lán)綠綠黃綠黃橙紅400-450450-480480-490490-500500-560560-580580-600600-650650-7502物質(zhì)顏色和其吸收光關(guān)系互補(bǔ)色物質(zhì)的顏色吸收光顏色波長(zhǎng)范圍(l,nm)黃綠紫400-吸收光譜曲線：物質(zhì)在不同波長(zhǎng)下吸收光的強(qiáng)度大小

A～l關(guān)系最大吸收波長(zhǎng)lmax：光吸收最大處的波長(zhǎng)3一些基本名詞和概念lmax對(duì)比度(Δl):絡(luò)合物最大吸收波長(zhǎng)(lMRmax)與試劑最大吸收波(lRmax)之差Δl吸收光譜曲線：物質(zhì)在不同波長(zhǎng)下吸收光的強(qiáng)度大小3一些基本名原子光譜為線光譜分子光譜為帶光譜電子躍遷能級(jí)分子振動(dòng)能級(jí)分子轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)原子光譜為線光譜電子躍遷能級(jí)4朗伯-比爾定律光吸收定律－朗伯-比爾(Lambert-Beer)定律吸光光度法的理論依據(jù)，研究光吸收的最基本定律I0=Ir+It+IaI0=It+IaI0IrItIa

T=It/I0,T:透射比或透光度

A=lg(I0/It)＝lg(1/T),A:吸光度朗伯定律：光吸收與溶液層厚度成正比比爾定律：光吸收與溶液濃度成正比4朗伯-比爾定律光吸收定律－朗伯-比爾(Lambert-B朗伯-比爾定律數(shù)學(xué)推導(dǎo)朗伯定律的數(shù)學(xué)表達(dá)式可以改寫為：朗伯-比爾定律數(shù)學(xué)推導(dǎo)朗伯定律的數(shù)學(xué)表達(dá)式可以改寫為：朗伯-比爾定律數(shù)學(xué)推導(dǎo)朗伯-比爾定律數(shù)學(xué)推導(dǎo)朗伯-比爾定律數(shù)學(xué)推導(dǎo)將合并得：

吸光度(absorbance)、透光率、百分透光率間的關(guān)系有：T=It/I0,T%=T×100，A=-lgT=2-lgT%朗伯-比爾定律數(shù)學(xué)推導(dǎo)將當(dāng)一束平行單色光垂直照射到樣品溶液時(shí)，溶液的吸光度與溶液的濃度及光程（溶液的厚度）成正比關(guān)系－－－朗伯比爾定律－－－光吸收定律數(shù)學(xué)表達(dá)：A＝lg(1/T)=Kbc其中，A:吸光度，T:透射比(transmitance)，K:比例常數(shù)，b:溶液厚度，c:溶液濃度注意：平行單色光均相介質(zhì)無發(fā)射、散射或光化學(xué)反應(yīng)當(dāng)一束平行單色光垂直照射到樣品溶液時(shí)，溶液的吸光摩爾吸光系數(shù)e靈敏度表示方法A=e

bcA=Kbcc:mol/Le

表示物質(zhì)的濃度為1mol/L,液層厚度為1cm時(shí)溶液的吸光度。單位：

(L?mol-1?cm-1)c:g/LA=abca:吸光系數(shù)摩爾吸光系數(shù)e靈敏度表示方法A=ebcA=Kbc桑德爾(sandell)靈敏度：S當(dāng)儀器檢測(cè)吸光度為0.001時(shí)，單位截面積光程內(nèi)所能檢測(cè)到的吸光物質(zhì)的最低含量。單位：mg/cm2

S=M/e

推導(dǎo)：根據(jù)定義0.001＝εbc故bc＝0.001/ε（1）c為濃度，單位為mol/1000cm3,b為cm,bc表示單位截面積光程內(nèi)的摩爾數(shù)，即mol/1000cm2，如果bc乘以被測(cè)物質(zhì)的分子量M,則得單位截面積光程內(nèi)被測(cè)物質(zhì)的量，即桑德爾靈敏度S。S=（bc/1000）×M×106=bcM×103（μg·cm-2），將（1）的bc＝0.001/ε代入，S＝(0.001/ε)×M×103，得：S=M/ε桑德爾(sandell)靈敏度：S推導(dǎo)：根據(jù)定義0.001氯磺酚S測(cè)定鋼中的鈮50ml容量瓶中有Nb30μg，用2cm比色池，在650nm測(cè)定光吸收，A＝0.43,求S.(Nb原子量92.91)。有兩種做法：根據(jù)A=εbC,求ε＝3.3×104L·mol-1·cm-1

氯磺酚S測(cè)定鋼中的鈮＝3.3×104L·mol-1·cm吸光度的加和性A1=e1bc1A2=e2bc2A=e1bc1+e2bc2

根據(jù)吸光度的加和性可以進(jìn)行多組分的測(cè)定以及某些化學(xué)反應(yīng)平衡常數(shù)的測(cè)定在某一波長(zhǎng)，溶液中含有對(duì)該波長(zhǎng)的光產(chǎn)生吸收的多種物質(zhì)，那么溶液的總吸光度等于溶液中各個(gè)吸光物質(zhì)的吸光度之和吸光度的加和性A1=e1bc1根據(jù)吸光度的加和性可以進(jìn)行練習(xí)題：1.在510nm波長(zhǎng)處，2cm比色皿，測(cè)定0.0010％某一有色絡(luò)合物溶液，測(cè)得透光率T為0.420，已知ε＝2.50×103L·mol-1·cm-1，試求該有色絡(luò)合物的摩爾質(zhì)量。練習(xí)題：1.在510nm波長(zhǎng)處，2cm比色皿，測(cè)定0.001練習(xí)題：2.稱取鋼樣0.500g，溶解后，轉(zhuǎn)入100ml容量瓶中，定容。取出10.0ml試液于燒杯中，將其中的Mn2+氧化為MnO4-后，轉(zhuǎn)入50ml容量瓶中，定容，搖勻，用2cm比色皿于525nm測(cè)量吸光度為0.50，求鋼樣中Mn的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。已知：MMn=54.94,ε525＝2300L·mol-1·cm-1

練習(xí)題：2.稱取鋼樣0.500g，溶解后，轉(zhuǎn)入100ml容量1.解：已知T為0.420，根據(jù)A=－lgT計(jì)算吸光度

A=－lg0.420=0.377根據(jù)A=εbc計(jì)算有色絡(luò)合物溶液濃度c=A/(εb)=0.377/(2.5×103×2)＝7.54×10-5(mol/L)根據(jù)有色絡(luò)合物溶液0.0010％濃度，一升該有色絡(luò)合物溶液中有色絡(luò)合物質(zhì)量為1000×0.0010％＝1.00×10-2（g）有色絡(luò)合物摩爾質(zhì)量為M＝m/c=(1.00×-2)/(7.54×10-5)＝132.6（g/mol）

1.解：已知T為0.420，根據(jù)A=－lgT計(jì)算吸光度2.解：(1)求50ml有色溶液中MnO4-的濃度，已知，b=2cm，A=0.50，ε525＝2300，根據(jù)A=εbc，c1=A/(bε)=0.50/(2×2300)＝1.1×10-4（mol/L）(2)求100ml試液中Mn2+的濃度c＝c1×50/10.0＝1.1×10-4×5＝5.5×10-4（mol/L）（3）求100ml試液中Mn的質(zhì)量m=cVM=5.5×10-4×100×10-3×54.94＝3.0×10-3（g）(4）

鋼樣中錳的含量wMn=m/ms×100%=(3.0×10-3)/0.500×100％＝0.60％2.解：(1)求50ml有色溶液中MnO4-的濃度，已知，1分光光度計(jì)的組成光源單色器樣品池檢測(cè)器讀出系統(tǒng)12.3分光光度計(jì)1分光光度計(jì)的組成光源單色器樣品池檢測(cè)器讀出系統(tǒng)12.3常用光源光源波長(zhǎng)范圍(nm)適用于氫燈185~375紫外氘燈185~400紫外鎢燈320~2500可見，近紅外鹵鎢燈250~2000紫外，可見，近紅外氙燈180~1000紫外、可見（熒光）能斯特?zé)?000~3500紅外空心陰極燈特有原子光譜激光光源特有各種譜學(xué)手段常用光源光源波長(zhǎng)范圍(nm)適用于氫燈185~375紫外氘燈單色器作用:產(chǎn)生單色光常用的單色器：棱鏡和光柵樣品池（比色皿）

厚度(光程):0.5,1,2,3,5…cm

材質(zhì)：玻璃比色皿－－可見光區(qū)石英比色皿－－可見、紫外光區(qū)單色器樣品池（比色皿）檢測(cè)器

作用：接收透射光，并將光信號(hào)轉(zhuǎn)化為電信號(hào)常用檢測(cè)器：光電管光電倍增管光二極管陣列光電管分為紅敏和紫敏，陰極表面涂銀和氧化銫為紅敏，適用625－1000nm波長(zhǎng)；陰極表面涂銻和銫為紫敏，適用200－625nm波長(zhǎng)檢測(cè)器光電管分為紅敏和紫敏，陰極表面涂銀和氧化銫為紅敏，適用目視比色法—比色管光電比色法—光電比色計(jì)

光源、濾光片、比色池、硒光電池、檢流計(jì)分光光度法與分光光度計(jì)722型分光光度計(jì)光學(xué)系統(tǒng)圖1.光源；2.濾光片；3,8聚光鏡4,7.狹縫；5.準(zhǔn)直鏡；6.光柵9.比色池；10.光電管目視比色法—比色管光電比色法—光電比色計(jì)分光光度法與分光光12.4顯色反應(yīng)及影響因素要求：a.選擇性好b.靈敏度高(ε>104)c.產(chǎn)物的化學(xué)組成穩(wěn)定d.化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定e.反應(yīng)和產(chǎn)物有明顯的顏色差別(l>60nm)沒有顏色的化合物，需要通過適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)定量生成有色化合物再測(cè)定－－顯色反應(yīng)1顯色反應(yīng)12.4顯色反應(yīng)及影響因素要求：沒有顏色的化合物，需要通過絡(luò)合反應(yīng)氧化還原反應(yīng)2顯色反應(yīng)類型絡(luò)合反應(yīng)氧化還原反應(yīng)2顯色反應(yīng)類型離子締合反應(yīng)成鹽反應(yīng)離子締合反應(yīng)成鹽反應(yīng)褪色反應(yīng)

Zr(IV)-偶氮胂III絡(luò)合物測(cè)定草酸吸附顯色反應(yīng)

達(dá)旦黃測(cè)定Mg(II),Mg(OH)2吸附達(dá)旦黃呈紅色褪色反應(yīng)吸附顯色反應(yīng)3顯色劑無機(jī)顯色劑:過氧化氫，硫氰酸銨，碘化鉀有機(jī)顯色劑：偶氮類：偶氮胂III3顯色劑無機(jī)顯色劑:有機(jī)顯色劑：三苯甲烷類三苯甲烷酸性染料鉻天菁S三苯甲烷堿性染料結(jié)晶紫三苯甲烷類三苯甲烷堿性染料結(jié)晶紫鄰菲羅啉類：新亞銅靈肟類：丁二肟鄰菲羅啉類：新亞銅靈肟類：丁二肟4多元絡(luò)合物混配化合物Nb-5-Br-PADAP-酒石酸V-PAR-H2O離子締合物

AuCl4--羅丹明B金屬離子-配體-表面活性劑體系Mo-水楊基熒光酮-CTMAB4多元絡(luò)合物混配化合物5影響因素a溶液酸度（pH值及緩沖溶液）影響顯色劑的平衡濃度及顏色，改變?chǔ)影響待測(cè)離子的存在狀態(tài)，防止沉淀影響絡(luò)合物組成形式pHλmax(nm)形式pHλmax(nm)H4L+1.2462-465Sn4+1.0530H3L4.8-5.2462,490Ga3+5.0550H2L-8.4-9.0512HL2-11.4-12.0532-538pH對(duì)苯芴酮及其絡(luò)合物的顏色影響5影響因素a溶液酸度（pH值及緩沖溶液）形式b顯色劑的用量稍過量，處于平臺(tái)區(qū)c顯色反應(yīng)時(shí)間針對(duì)不同顯色反應(yīng)確定顯示時(shí)間顯色反應(yīng)快且穩(wěn)定；顯色反應(yīng)快但不穩(wěn)定；顯色反應(yīng)慢，穩(wěn)定需時(shí)間；顯色反應(yīng)慢但不穩(wěn)定d顯色反應(yīng)溫度加熱可加快反應(yīng)速度，導(dǎo)致顯色劑或產(chǎn)物分解b顯色劑的用量稍過量，處于平臺(tái)區(qū)c顯色反應(yīng)時(shí)間針對(duì)不同e溶劑f干擾離子有機(jī)溶劑，提高靈敏度、顯色反應(yīng)速率消除辦法：提高酸度，加入隱蔽劑，改變價(jià)態(tài)選擇合適參比

褪色空白(鉻天菁S測(cè)Al，氟化銨褪色，消除鋯、鎳、鈷干擾)選擇適當(dāng)波長(zhǎng)e溶劑f干擾離子有機(jī)溶劑，提高靈敏度、顯色反應(yīng)速率消除12.5光度分析法的設(shè)計(jì)1.選擇顯色反應(yīng)2.選擇顯色劑3.優(yōu)化顯色反應(yīng)條件4.選擇檢測(cè)波長(zhǎng)5.選擇合適的濃度6.選擇參比溶液7.建立標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)量條件選擇12.5光度分析法的設(shè)計(jì)1.選擇顯色反應(yīng)測(cè)量條件選擇1測(cè)定波長(zhǎng)選擇選擇原則：“吸收最大，干擾最小”靈敏度選擇性1測(cè)定波長(zhǎng)選擇選擇原則：“吸收最大，干擾最小”靈敏度選擇性2測(cè)定濃度控制控制濃度吸光度A：0.2～0.8減少測(cè)量誤差2測(cè)定濃度控制控制濃度吸光度A：0.2～0.8減少3參比溶液選擇儀器調(diào)零消除吸收池壁和溶液對(duì)入射光的反射扣除干擾試劑空白試樣空白褪色空白3參比溶液選擇儀器調(diào)零試劑空白4標(biāo)準(zhǔn)曲線制作理論基礎(chǔ)：朗伯-比爾定律相同條件下測(cè)定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度AA～c作圖4標(biāo)準(zhǔn)曲線制作理論基礎(chǔ)：朗伯-比爾定律相同條件下12.6吸光光度法的誤差非單色光引起的偏移物理化學(xué)因素：非均勻介質(zhì)及化學(xué)反應(yīng)吸光度測(cè)量的誤差

對(duì)朗伯-比爾定律的偏移12.6吸光光度法的誤差非單色光引起的偏移對(duì)朗伯-比爾定律顯色反應(yīng)體系中的副反應(yīng)影響M+nL=MLn顯色反應(yīng)*其它離子可能與顯色劑反應(yīng)：M′+nL=M′Ln,消耗顯色劑；*L受酸效應(yīng)影響，有L-、HL+等形態(tài)存在；被測(cè)離子有絡(luò)合效應(yīng)。表觀穩(wěn)定常數(shù)：顯色反應(yīng)體系中的副反應(yīng)影響M+nL=MLn顯色通常被測(cè)離子有99％以上絡(luò)合時(shí)，可以認(rèn)為反應(yīng)完全，此時(shí)這個(gè)式子可以判斷不同條件下顯色反應(yīng)的完全程度通常被測(cè)離子有99％以上絡(luò)合時(shí)，可以認(rèn)為反應(yīng)完全，此時(shí)這個(gè)式1非單色光引起的偏移復(fù)合光由l1和l2組成，對(duì)于濃度不同的溶液a和b,引起的吸光度的偏差不一樣，濃度大，復(fù)合光引起的誤差大，故在高濃度時(shí)線性關(guān)系向下彎曲。1非單色光引起的偏移復(fù)合光由l1和l2組成，對(duì)于濃度不同的*其它光學(xué)方面的干擾

雜散光散射光反射光非平行光*被測(cè)物質(zhì)溶液本身的化學(xué)、物理性質(zhì)引起偏離朗伯比爾定律介質(zhì)不均勻（膠體，懸浮、乳濁）；物質(zhì)在溶液中發(fā)生化學(xué)反應(yīng)（離解、締合、異構(gòu)等），重鉻酸鉀＝鉻酸鉀，Cr2O72-+H2O-=2HCrO4-=2H++2CrO42-；再如PAR的偶氮－醌腙式次甲基蘭的單體－λmax660nm,二聚體λmax610nm*其它光學(xué)方面的干擾非均勻介質(zhì)

膠體，懸浮、乳濁等對(duì)光產(chǎn)生散射，使實(shí)測(cè)吸光度增加，導(dǎo)致線性關(guān)系上彎2物理化學(xué)因素離解、締合、異構(gòu)等如：Cr2O72-+H2O-=2HCrO4-=2H++2CrO42-PAR的偶氮－醌腙式化學(xué)反應(yīng)非均勻介質(zhì)2物理化學(xué)因素離解、締合、異構(gòu)等化學(xué)反應(yīng)吸光度標(biāo)尺刻度不均勻3吸光度測(cè)量的誤差A(yù)＝0.434

，T＝36.8%時(shí)，測(cè)量的相對(duì)誤差最小A=0.2~0.8,T=15~65%，相對(duì)誤差<4%

dc/c=dA/A=dT/TlnTEr=dc/c×100％=dA/A×100％=dT/TlnT×100％吸光度標(biāo)尺刻度不均勻3吸光度測(cè)量的誤差A(yù)＝0.434，T令ST=0.01,計(jì)算T不同值時(shí)的Sc/c，當(dāng)TlnT對(duì)T進(jìn)行微分時(shí)，其值為零時(shí)，Sc/c最小，此時(shí)T=0.368。令ST=0.01,計(jì)算T不同值時(shí)的Sc/c，當(dāng)TlnT對(duì)T進(jìn)無機(jī)及分析化學(xué)(第三版)第12章課件1.示差吸光光度法目的：提高光度分析的準(zhǔn)確度和精密度解決高(低)濃度組分(i.e.A在0.2~0.8以外)問題分類：高吸光度差示法、低吸光度差示法、 精密差示吸光度法特點(diǎn)：以標(biāo)準(zhǔn)溶液作空白原理：A相對(duì)=A=bcx-bc0=bc準(zhǔn)確度：讀數(shù)標(biāo)尺擴(kuò)展,相對(duì)誤差減少,

c0愈接近c(diǎn)x,準(zhǔn)確度提高愈顯著12.7常用的吸光光度法1.示差吸光光度法12.7常用的吸光光度法例：硫脲還原－硫氰酸鹽比色法測(cè)定鋼鐵中的鉬。酸溶，硫酸－高氯酸介質(zhì)中，硫脲還原鐵（III）為鐵(II),除干擾，還原鉬（VI）為五價(jià)，2.00mg/100ml的鉬標(biāo)準(zhǔn)溶液為參比溶液，用2.00-2.30mg/100ml的鉬標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制工作曲線和測(cè)定樣品溶液的吸光度,480nm測(cè)定A。例：硫脲還原－硫氰酸鹽比色法測(cè)定鋼鐵中的鉬。酸溶，硫酸－高氯2.雙波長(zhǎng)分光光度法(計(jì)算分光光度法）*光度加和性，溶液的總吸光度應(yīng)等于各吸光物質(zhì)的吸光度之和。A總=A1+A2+A3+……An.對(duì)多組分混合物的分別測(cè)定須解聯(lián)立方程,有聯(lián)立方程法Aλ1=ελ1bc1+ελ1bc2Aλ2=ελ2bc2+ελ2bc1定量分析2.雙波長(zhǎng)分光光度法(計(jì)算分光光度法）*光度加和性，溶液的例如測(cè)定呋喃唑酮和小檗堿復(fù)方片劑中這兩種物質(zhì)的含量1cm池，分別在365、342nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A1和A2),按下式計(jì)算兩組分：Cx=A1/α1[(b-m)/(b-a)]Cy=A2/β2[b(m-a)/m(b-a)]Cx和Cy分別為呋喃唑酮和小檗堿的濃度；α1和α2分別為呋喃唑酮在365和342nm波長(zhǎng)處的吸收系數(shù)（E）；β1和β2分別為硫酸小檗堿在365和342nm波長(zhǎng)處的吸收系數(shù)（E）.m=A2/A1,a=α2/α1;b=β2/β1根據(jù)吸光度加和性得：A1=α1Cx+β1Cy(1);A2=α2Cx+β2Cy(2)m=A2/A1,a=α2/α1;b=β2/β1代入（2）得：例如測(cè)定呋喃唑酮和小檗堿復(fù)方片劑中這兩種物質(zhì)的含量1cm池，ma1=aα1Cx+bβ1Cy(3)(1)代入（3）得Cx=A1/α1[(b-m)/(b-a)]同理得到Cy=A2/β2[b(m-a)/m(b-a)]ma1=aα1Cx+bβ1Cy(3)2.雙波長(zhǎng)吸光光度法目的：解決渾濁樣品光度分析消除背景吸收的干擾多組分同時(shí)檢測(cè)原理：A=Al1-Al2=（l1-l2）bc波長(zhǎng)對(duì)的選擇：a.等吸光度點(diǎn)法，b.系數(shù)倍率法3.導(dǎo)數(shù)吸光光度法2.雙波長(zhǎng)吸光光度法3.導(dǎo)數(shù)吸光光度法選l1為參比波長(zhǎng),l2為測(cè)量波長(zhǎng)得Al1=xl1bcx+

yl1bcyAl2=

xl2bcx+

yl2bcyΔA=Al2-Al1=(

xλ2bcx+

yl2bcy)-(

xl1bcx+

yl1bcy)在等吸光度的位置(G,F),

yl2＝

yl1，則上式成為

ΔA=(

xl2-

xl1）bcxΔA與cx成正比,可用于測(cè)定例,苯酚與2,4,6-三氯苯酚(y)混合物中苯酚(x)的雙波長(zhǎng)分光光度法測(cè)定。選l1為參比波長(zhǎng),l2為測(cè)量波長(zhǎng)例,苯酚與2,4,6-三氯3.導(dǎo)數(shù)吸光光度法目的：提高分辨率去除背景干擾

原理：dnA/dln~l

3.導(dǎo)數(shù)吸光光度法目的：提高分辨率12.8吸光光度法的應(yīng)用1測(cè)定弱酸和弱堿的離解常數(shù)

AHB和AB-分別為有機(jī)弱酸HB在強(qiáng)酸和強(qiáng)堿性時(shí)的吸光度，它們此時(shí)分別全部以[HB]或[B-]形式存在。HB＝H++B-[H+][B-]Ka

=[HB]pKa=pH+lg

[HB][B-]A=AHB+AB-pKa=pH+lg

AB--AA-AHBlg

AB--AA-AHB對(duì)pH作圖即可求得pKa

12.8吸光光度法的應(yīng)用1測(cè)定弱酸和弱堿的離解常數(shù)AH2絡(luò)合物組成確定

飽和法（摩爾比法）制備一系列含釕3.0×10-5mol/L(固定不變)和不同濃度（小于12.0×10-5mol/L）的PDT溶液，按實(shí)驗(yàn)條件，485nm測(cè)定吸光度,作圖。PDT:Ru=2:12絡(luò)合物組成確定飽和法（摩爾比法）制備一系列含釕3.0×等摩爾連續(xù)變化法固定[M]+[L],改變[M],獲得一系列吸光度值，吸光度最大的值所對(duì)應(yīng)的[M]與[L]的比值，即獲得M:L比值。Co(III)與3，5－二氯－PADAT的比值為1:2等摩爾連續(xù)變化法固定[M]+[L],改變[M],獲得一系列吸平衡移動(dòng)法固定[M],不斷改變[L]，以lg[MLn]/[M]為縱坐標(biāo)，lg[L]為橫坐標(biāo)，作圖，斜率n即是絡(luò)合物中L:M的比值；縱軸上的截距l(xiāng)gK是絡(luò)合物的穩(wěn)定常數(shù)。lgK+nlg[L]=lg([MLn]/[M])[MLn]K

=[M][L]nlgK+nlg[L]=lgA/(Amax-A)平衡移動(dòng)法固定[M],不斷改變[L]，以lg[MLn]/[Mc.平衡移動(dòng)法（對(duì)數(shù)作圖法）M+nL＝MLn固定[M],不斷改變[L]，并以lg[MLn]/[M]為縱坐標(biāo)，lg[L]為橫坐標(biāo)，（10）式為一直線方程，斜率n即是絡(luò)合物中L:M的比值；縱軸上的截距l(xiāng)gK是絡(luò)合物的穩(wěn)定常數(shù)。c.平衡移動(dòng)法（對(duì)數(shù)作圖法）M+nL＝MLn固定[M],上式中，[M],[L]和[MLn]為平衡時(shí)各組分的摩爾濃度，[L]濃度由實(shí)驗(yàn)可知，由加入的L的總濃度減去形成絡(luò)合物消耗的L濃度之差計(jì)算，一般形成絡(luò)合物消耗的L與L總濃度相比不大，可忽略。[MLn]可由測(cè)得吸光度Ax計(jì)算，[M]可由Amax-Ax求得，上式變?yōu)椋荷鲜街校琜M],[L]和[MLn]為平衡時(shí)各組分的摩爾濃度，Vx是由試劑L溶液某次所取的體積。[L]o是試劑原始濃度，VMK是實(shí)驗(yàn)時(shí)的容量瓶體積，故q為一常數(shù)?？梢钥闯觯擅看渭尤氲脑噭w積，并以lg[MLn]/[M]為縱坐標(biāo)，lgVx為橫坐標(biāo)作圖，斜率n表達(dá)了絡(luò)合物的組成。Vx是由試劑L溶液某次所取的體積。[L]o是試劑原始濃度，V3分析應(yīng)用

痕量金屬分析臨床分析食品分析3分析應(yīng)用痕量金屬分析1.血清總蛋白、清蛋白、及球蛋白測(cè)定－鹽析雙縮脲法540nm檢測(cè)

蛋白質(zhì)肽鏈540nm檢測(cè)1.血清總蛋白、清蛋白、及球蛋白測(cè)定－鹽析雙縮脲法54血清中清蛋白幾乎由肝細(xì)胞合成，含量變化反映肝臟和免疫系統(tǒng)疾病正常：總蛋白6-8g/dL；清蛋白：3.5-5g/dL;球蛋白1.5-3.0/dL?？偟鞍赘邍?yán)重腹瀉，嘔吐，發(fā)燒；總蛋白低營(yíng)養(yǎng)不良球蛋白增加：炎征；結(jié)核?。宦轱L(fēng)；瘧疾；多發(fā)生骨髓瘤清蛋白減低：肝、腎疾病；肝炎，肝功能衰竭、腎炎血清中清蛋白幾乎由肝細(xì)胞合成，含量變化反映肝臟和免疫系統(tǒng)疾病2.血清轉(zhuǎn)氨酶測(cè)定

丙氨酸

α－酮戊二酸

丙酮酸

谷氨酸

2.血清轉(zhuǎn)氨酶測(cè)定丙氨酸α－酮戊二酸3.血清轉(zhuǎn)氨酶測(cè)定

丙酮酸2，4-二硝基苯腙（紅棕色，500nm）正常：40單位以下谷丙氨轉(zhuǎn)氨酶以肝細(xì)胞中最多，心肌細(xì)胞中也較多，只有少量進(jìn)入血液中，若血清中該酶含量高，肝有病或不正常3.血清轉(zhuǎn)氨酶測(cè)定4.血清乳酸脫氫酶(LDH)測(cè)定

乳酸輔酶I丙酮酸還原性輔酶440nm檢測(cè)4.血清乳酸脫氫酶(LDH)測(cè)定乳酸正常：血清，225-540單位；腦脊液，20-55單位乳酸脫氫酶廣泛存在，肝、心肌、腎臟、胰腺、肺和骨骼肌最多。如果這些組織有病，血液中該酶偏高正常：血清，225-540單位；腦脊液，20-55單位5.血清堿性磷酸酶（AKP）測(cè)定

AKP在堿性環(huán)境下，作用于磷酸苯二鈉，使之水解釋出酚和磷酸，酚在堿性溶液中與4-氨基安替比林作用，經(jīng)鐵氰化鉀氧化成紅色與標(biāo)準(zhǔn)酚比較，測(cè)定AKP5.血清堿性磷酸酶（AKP）測(cè)定AKP在堿性環(huán)境下，作用于AKP存在各組織，腎臟、肝臟、牙齒和骨骼中較多，血液中如果該酶增高，說明肝膽系統(tǒng)有問題，如骨炎肝炎、肝癌；減低，腎炎貧血

有色化合物在520nm測(cè)定AKP存在各組織，腎臟、肝臟、牙齒和骨骼中較多，血液中如果該6.鄰甲苯胺法測(cè)定血糖在熱乙酸溶液中，葡萄糖與鄰甲苯胺縮合生成藍(lán)色(620nm)的schiff堿

正常：70-100mg/dl降低：腫瘤，腺垂體機(jī)能減退6.鄰甲苯胺法測(cè)定血糖正常：70-100mg/dl7.血清γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-GTP）測(cè)定

γ-L-谷氨酰-α-萘胺

γ-L-谷氨酰γ-L-谷氨酰-α-萘胺肽

7.血清γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-GTP）測(cè)定γ-L-谷氨酰-正常：40單位以下。臨床意義：此酶主要來自肝臟，肝膽系統(tǒng)疾病酶活力高，明顯增高見于肝癌、阻塞性黃疸、胰頭癌、胰腺炎、傳染性肝炎、膽道癌等，食酒和長(zhǎng)期服用苯巴比妥等

520nm正常：40單位以下。520nm8.血脂（甘油三酯）測(cè)定

1.甘油三酯皂化

8.血脂（甘油三酯）測(cè)定1.甘油三酯皂化2.甘油氧化

2.甘油氧化3.甲醛、乙酰丙酮和氨水縮合反應(yīng)生成3，5-二乙酰-2，6-二甲基吡啶（棕色，420nm）

正常：30-150mg/dL.3.甲醛、乙酰丙酮和氨水縮合反應(yīng)生成3，5-二乙酰-2，6-在510nm波長(zhǎng)處，2cm比色皿，測(cè)定0.0010％（w/v）某一有色絡(luò)合物溶液，測(cè)得透光率T為0.420，已知ε＝2.50×103L·mol-1·cm-1，試求該有色絡(luò)合物的摩爾質(zhì)量。

例題解：已知T為0.420，根據(jù)A=－lgT計(jì)算吸光度A=－lg0.420=0.377根據(jù)A=εbc計(jì)算有色絡(luò)合物溶液濃度c=A/εb=0.377/(2.5×103×2)＝7.54×10-5(mol/L)根據(jù)有色絡(luò)合物溶液0.0010％濃度，一升該有色絡(luò)合物溶液中有色絡(luò)合物質(zhì)量為1000×0.0010％＝1.00×10-2（g）有色絡(luò)合物摩爾質(zhì)量為M＝m/c=(1.00×-2)/(7.54×10-5)＝132.6（g/mol）

在510nm波長(zhǎng)處，2cm比色皿，測(cè)定0.0010％（w/v1.用雙環(huán)己酮測(cè)定濃度為25.0微克/25ml的Cu2+溶液，波長(zhǎng)600nm,吸收池2cm,測(cè)得T%=50.1，求摩爾吸光系數(shù)ε和桑德爾靈敏度S。

例題解：用百分透光率計(jì)算溶液吸光度A＝-lgT=-lg0.501＝0.300求Cu2+溶液濃度，c=(25.0×10-6×103)/25＝1.00×10-3（g·L-1）根據(jù)公式A=εbc求ε，ε＝A/bc=0.300/(2×1.00×10-3/63.55)=9600（L·mol-1·cm-1）S=M/ε=63.55/9600＝6.62×10-3（μg·cm-2）1.用雙環(huán)己酮測(cè)定濃度為25.0微克/25ml的Cu2+溶液2.某鋼含鎳約0.12％，用丁二酮肟光度法測(cè)定。試樣溶液轉(zhuǎn)入100ml容量瓶中，在適宜條件下顯色，定容，1cm比色皿，在470nm測(cè)定，要求測(cè)量誤差最小，應(yīng)該稱取試樣多少克？ε＝1.3×104（L·mol-1·cm-1），MNi=58.69解：根據(jù)光度測(cè)量誤差公式可知：當(dāng)吸光度A＝0.434時(shí)，誤差最小，已知b=1,ε＝1.3×104，根據(jù)A=εbcc=A/εb＝0.434/（1.3×104×1）＝3.34×10-5(mol/L)100ml有色溶液中Ni的含量為m=cVM＝3.34×10-5×100×10-3×58.69＝1.96×10-4(g)已知某鋼含鎳約0.12％，則應(yīng)稱取試樣質(zhì)量為：(1.96×10-4/ms)×100=0.12ms=0.16g2.某鋼含鎳約0.12％，用丁二酮肟光度法測(cè)定。試3.用卟啉類顯色劑光度法測(cè)定Cu2+，ε＝2.00×105L·mol-1·cm-1。試液中Cu2+濃度在5.0×10-7～5.0×10-6mol/L范圍內(nèi)，使用1cm比色皿進(jìn)行測(cè)定，吸光度和透光率的范圍如何？若光度計(jì)的透光率讀數(shù)誤差ΔT為0.005，可能引起的濃度測(cè)量相對(duì)誤差為多少？解：已知ε＝2.00×105L·mol-1·cm-1,b=1cm根據(jù)A=εbc計(jì)算吸光度范圍，A1=2.00×105×1×5.0×10-7＝0.100A2=2.00×105×1×5.0×10-6＝1.00根據(jù)公式A=-lgT計(jì)算透光率T1=10-0.100=0.794T2=10-1.00=0.100由以上計(jì)算獲得吸光度A范圍0.100～1.00，相應(yīng)透光率范圍為0.794～0.100。因ΔT為0.005，根據(jù)光度測(cè)量誤差公式 Δc/c=(0.434×ΔT)/TlgT，可得 Δc/c=(0.434×0.005)/(0.794×lg0.794)=0.0273=-2.73% Δc/c=(0.434×0.005)/(0.100×lg0.100)=0.0217=-2.17%3.用卟啉類顯色劑光度法測(cè)定Cu2+，ε＝2.00×4.某有色溶液在1cm比色池中測(cè)得吸光度0.30，問入射光強(qiáng)度減弱了多少？如果用3cm比色皿測(cè)吸光度，入射光強(qiáng)度又減弱多少？4.某有色溶液在1cm比色池中測(cè)得吸光度0.30，問入射光強(qiáng)解：首先了解吸光度A、吸收光強(qiáng)度Ia、入射光強(qiáng)度I0、透過光強(qiáng)度I和透光率T的關(guān)系，I0=I+Ia,T=I/I0,A=-lgT，則有：Ia＝I0－I,

Ia/I0=（I0－I）/I0=1－I/I0=1－T，T=10-AIa/I0=（I0－I）/I0=1－I/I0=1－T＝1－10-A

當(dāng)1cm，A=0.30時(shí)，Ia/I0=1－10-0.30＝1-0.50＝0.50＝50％當(dāng)3cm時(shí)，根據(jù)A＝Kbc，A=0.30×3=0.90,則：Ia/I0=1－10-0.90＝1-0.126＝0.874＝87.4％解：首先了解吸光度A、吸收光強(qiáng)度Ia、入射光強(qiáng)度I0、透5.用試劑空白調(diào)節(jié)光度計(jì)透光率為100%，測(cè)得某試液的吸光度為1.301，如果透光率讀數(shù)誤差ΔT＝0.003，光度測(cè)量相對(duì)誤差為多少？若以T＝10％的標(biāo)準(zhǔn)溶液為參比溶液，該試液的透光率為多少？此時(shí)測(cè)量相對(duì)誤差又為多少？5.用試劑空白調(diào)節(jié)光度計(jì)透光率為100%，測(cè)得某試液的吸光度根據(jù)A=－lgT式計(jì)算普通光度法的透光率T=10-A＝10-1.301=0.050=5.0%普通光度法測(cè)量相對(duì)誤差為根據(jù)公式Δc/c=(0.434×ΔT)/TlgT計(jì)算Δc/c=(0.434×ΔT)/TlgT＝（0.434×0.003）、（0.05×lg0.05）=2%用示差法時(shí)，10％的標(biāo)準(zhǔn)溶液為參比溶液，試液的透光率為T相對(duì)＝5.0％/10%=50%示差法測(cè)量時(shí)，其相對(duì)誤差為Δc/c=(0.434×ΔT相對(duì))/[T相對(duì)（lgT相對(duì)+lgTs）]已知ΔT相對(duì)＝0.003，T相對(duì)＝50％，Ts=10%，Δc/c＝（0.434×0.003）/[0.50（lg0.50+lg0.10）]＝0.2％說明示差法的相對(duì)誤差為普通法的1/10。

根據(jù)A=－lgT式計(jì)算普通光度法的透光率課后練習(xí)P.47412;13;14;16;17課后練習(xí)P.474

謝謝注意！謝謝注意！第12章吸光光度法12.1概述12.2吸光光度法基本原理12.3分光光度計(jì)12.4顯色反應(yīng)及影響因素12.5光度分析法的設(shè)計(jì)12.6吸光光度法的誤差12.7常用的吸光光度法12.8吸光光度法的應(yīng)用第12章吸光光度法12.1概述吸光光度法：分子光譜分析法的一種，又稱分光光度法(spectrophotometry)，屬于分子吸收光譜分析方法基于外層電子躍遷12.1概述吸收光譜發(fā)射光譜散射光譜分子光譜原子光譜吸光光度法：分子光譜分析法的一種，又稱分光光度法(spect12.2吸光光度法基本原理1吸收光譜產(chǎn)生的原因光:一種電磁波,波粒二象性

光譜名稱波長(zhǎng)范圍X射線0.1~10nm遠(yuǎn)紫外光10~200nm近紫外光200~400nm可見光400~750nm近紅外光0.75~2.5um中紅外光2.5~5.0um遠(yuǎn)紅外光5.0~1000um微波0.1~100cm無線電波1～1000m當(dāng)光子的能量與分子的E匹配時(shí)，就會(huì)吸收光子

E=hu=hc/l12.2吸光光度法基本原理1吸收光譜產(chǎn)生的原因光譜名稱波a躍遷類型

價(jià)電子躍遷：σ→σ*,π→π*;n→σ*,n→π*

E(h)順序:n→π*<π→π*<n→σ*<σ→σ*

有機(jī)化合物的生色原理b生色團(tuán)（chromophore)和助色團(tuán)(auxochrome)

生色團(tuán):含有π→π*躍遷的不飽和基團(tuán)助色團(tuán):含非鍵電子的雜原子基團(tuán),如-NH2,-OH,-CH3…

與生色團(tuán)相連時(shí)，會(huì)使吸收峰紅移(bathochromicshift)，吸收強(qiáng)度增強(qiáng)a躍遷類型有機(jī)化合物的生色原理b生色團(tuán)（chromoph物質(zhì)的顏色吸收光顏色波長(zhǎng)范圍(l,nm)黃綠黃橙紅紫紅紫藍(lán)綠藍(lán)藍(lán)綠紫藍(lán)綠藍(lán)藍(lán)綠綠黃綠黃橙紅400-450450-480480-490490-500500-560560-580580-600600-650650-7502物質(zhì)顏色和其吸收光關(guān)系互補(bǔ)色物質(zhì)的顏色吸收光顏色波長(zhǎng)范圍(l,nm)黃綠紫400-吸收光譜曲線：物質(zhì)在不同波長(zhǎng)下吸收光的強(qiáng)度大小

A～l關(guān)系最大吸收波長(zhǎng)lmax：光吸收最大處的波長(zhǎng)3一些基本名詞和概念lmax對(duì)比度(Δl):絡(luò)合物最大吸收波長(zhǎng)(lMRmax)與試劑最大吸收波(lRmax)之差Δl吸收光譜曲線：物質(zhì)在不同波長(zhǎng)下吸收光的強(qiáng)度大小3一些基本名原子光譜為線光譜分子光譜為帶光譜電子躍遷能級(jí)分子振動(dòng)能級(jí)分子轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)原子光譜為線光譜電子躍遷能級(jí)4朗伯-比爾定律光吸收定律－朗伯-比爾(Lambert-Beer)定律吸光光度法的理論依據(jù)，研究光吸收的最基本定律I0=Ir+It+IaI0=It+IaI0IrItIa

T=It/I0,T:透射比或透光度

A=lg(I0/It)＝lg(1/T),A:吸光度朗伯定律：光吸收與溶液層厚度成正比比爾定律：光吸收與溶液濃度成正比4朗伯-比爾定律光吸收定律－朗伯-比爾(Lambert-B朗伯-比爾定律數(shù)學(xué)推導(dǎo)朗伯定律的數(shù)學(xué)表達(dá)式可以改寫為：朗伯-比爾定律數(shù)學(xué)推導(dǎo)朗伯定律的數(shù)學(xué)表達(dá)式可以改寫為：朗伯-比爾定律數(shù)學(xué)推導(dǎo)朗伯-比爾定律數(shù)學(xué)推導(dǎo)朗伯-比爾定律數(shù)學(xué)推導(dǎo)將合并得：

吸光度(absorbance)、透光率、百分透光率間的關(guān)系有：T=It/I0,T%=T×100，A=-lgT=2-lgT%朗伯-比爾定律數(shù)學(xué)推導(dǎo)將當(dāng)一束平行單色光垂直照射到樣品溶液時(shí)，溶液的吸光度與溶液的濃度及光程（溶液的厚度）成正比關(guān)系－－－朗伯比爾定律－－－光吸收定律數(shù)學(xué)表達(dá)：A＝lg(1/T)=Kbc其中，A:吸光度，T:透射比(transmitance)，K:比例常數(shù)，b:溶液厚度，c:溶液濃度注意：平行單色光均相介質(zhì)無發(fā)射、散射或光化學(xué)反應(yīng)當(dāng)一束平行單色光垂直照射到樣品溶液時(shí)，溶液的吸光摩爾吸光系數(shù)e靈敏度表示方法A=e

bcA=Kbcc:mol/Le

表示物質(zhì)的濃度為1mol/L,液層厚度為1cm時(shí)溶液的吸光度。單位：

(L?mol-1?cm-1)c:g/LA=abca:吸光系數(shù)摩爾吸光系數(shù)e靈敏度表示方法A=ebcA=Kbc桑德爾(sandell)靈敏度：S當(dāng)儀器檢測(cè)吸光度為0.001時(shí)，單位截面積光程內(nèi)所能檢測(cè)到的吸光物質(zhì)的最低含量。單位：mg/cm2

S=M/e

推導(dǎo)：根據(jù)定義0.001＝εbc故bc＝0.001/ε（1）c為濃度，單位為mol/1000cm3,b為cm,bc表示單位截面積光程內(nèi)的摩爾數(shù)，即mol/1000cm2，如果bc乘以被測(cè)物質(zhì)的分子量M,則得單位截面積光程內(nèi)被測(cè)物質(zhì)的量，即桑德爾靈敏度S。S=（bc/1000）×M×106=bcM×103（μg·cm-2），將（1）的bc＝0.001/ε代入，S＝(0.001/ε)×M×103，得：S=M/ε桑德爾(sandell)靈敏度：S推導(dǎo)：根據(jù)定義0.001氯磺酚S測(cè)定鋼中的鈮50ml容量瓶中有Nb30μg，用2cm比色池，在650nm測(cè)定光吸收，A＝0.43,求S.(Nb原子量92.91)。有兩種做法：根據(jù)A=εbC,求ε＝3.3×104L·mol-1·cm-1

氯磺酚S測(cè)定鋼中的鈮＝3.3×104L·mol-1·cm吸光度的加和性A1=e1bc1A2=e2bc2A=e1bc1+e2bc2

根據(jù)吸光度的加和性可以進(jìn)行多組分的測(cè)定以及某些化學(xué)反應(yīng)平衡常數(shù)的測(cè)定在某一波長(zhǎng)，溶液中含有對(duì)該波長(zhǎng)的光產(chǎn)生吸收的多種物質(zhì)，那么溶液的總吸光度等于溶液中各個(gè)吸光物質(zhì)的吸光度之和吸光度的加和性A1=e1bc1根據(jù)吸光度的加和性可以進(jìn)行練習(xí)題：1.在510nm波長(zhǎng)處，2cm比色皿，測(cè)定0.0010％某一有色絡(luò)合物溶液，測(cè)得透光率T為0.420，已知ε＝2.50×103L·mol-1·cm-1，試求該有色絡(luò)合物的摩爾質(zhì)量。練習(xí)題：1.在510nm波長(zhǎng)處，2cm比色皿，測(cè)定0.001練習(xí)題：2.稱取鋼樣0.500g，溶解后，轉(zhuǎn)入100ml容量瓶中，定容。取出10.0ml試液于燒杯中，將其中的Mn2+氧化為MnO4-后，轉(zhuǎn)入50ml容量瓶中，定容，搖勻，用2cm比色皿于525nm測(cè)量吸光度為0.50，求鋼樣中Mn的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。已知：MMn=54.94,ε525＝2300L·mol-1·cm-1

練習(xí)題：2.稱取鋼樣0.500g，溶解后，轉(zhuǎn)入100ml容量1.解：已知T為0.420，根據(jù)A=－lgT計(jì)算吸光度

A=－lg0.420=0.377根據(jù)A=εbc計(jì)算有色絡(luò)合物溶液濃度c=A/(εb)=0.377/(2.5×103×2)＝7.54×10-5(mol/L)根據(jù)有色絡(luò)合物溶液0.0010％濃度，一升該有色絡(luò)合物溶液中有色絡(luò)合物質(zhì)量為1000×0.0010％＝1.00×10-2（g）有色絡(luò)合物摩爾質(zhì)量為M＝m/c=(1.00×-2)/(7.54×10-5)＝132.6（g/mol）

1.解：已知T為0.420，根據(jù)A=－lgT計(jì)算吸光度2.解：(1)求50ml有色溶液中MnO4-的濃度，已知，b=2cm，A=0.50，ε525＝2300，根據(jù)A=εbc，c1=A/(bε)=0.50/(2×2300)＝1.1×10-4（mol/L）(2)求100ml試液中Mn2+的濃度c＝c1×50/10.0＝1.1×10-4×5＝5.5×10-4（mol/L）（3）求100ml試液中Mn的質(zhì)量m=cVM=5.5×10-4×100×10-3×54.94＝3.0×10-3（g）(4）

鋼樣中錳的含量wMn=m/ms×100%=(3.0×10-3)/0.500×100％＝0.60％2.解：(1)求50ml有色溶液中MnO4-的濃度，已知，1分光光度計(jì)的組成光源單色器樣品池檢測(cè)器讀出系統(tǒng)12.3分光光度計(jì)1分光光度計(jì)的組成光源單色器樣品池檢測(cè)器讀出系統(tǒng)12.3常用光源光源波長(zhǎng)范圍(nm)適用于氫燈185~375紫外氘燈185~400紫外鎢燈320~2500可見，近紅外鹵鎢燈250~2000紫外，可見，近紅外氙燈180~1000紫外、可見（熒光）能斯特?zé)?000~3500紅外空心陰極燈特有原子光譜激光光源特有各種譜學(xué)手段常用光源光源波長(zhǎng)范圍(nm)適用于氫燈185~375紫外氘燈單色器作用:產(chǎn)生單色光常用的單色器：棱鏡和光柵樣品池（比色皿）

厚度(光程):0.5,1,2,3,5…cm

材質(zhì)：玻璃比色皿－－可見光區(qū)石英比色皿－－可見、紫外光區(qū)單色器樣品池（比色皿）檢測(cè)器

作用：接收透射光，并將光信號(hào)轉(zhuǎn)化為電信號(hào)常用檢測(cè)器：光電管光電倍增管光二極管陣列光電管分為紅敏和紫敏，陰極表面涂銀和氧化銫為紅敏，適用625－1000nm波長(zhǎng)；陰極表面涂銻和銫為紫敏，適用200－625nm波長(zhǎng)檢測(cè)器光電管分為紅敏和紫敏，陰極表面涂銀和氧化銫為紅敏，適用目視比色法—比色管光電比色法—光電比色計(jì)

光源、濾光片、比色池、硒光電池、檢流計(jì)分光光度法與分光光度計(jì)722型分光光度計(jì)光學(xué)系統(tǒng)圖1.光源；2.濾光片；3,8聚光鏡4,7.狹縫；5.準(zhǔn)直鏡；6.光柵9.比色池；10.光電管目視比色法—比色管光電比色法—光電比色計(jì)分光光度法與分光光12.4顯色反應(yīng)及影響因素要求：a.選擇性好b.靈敏度高(ε>104)c.產(chǎn)物的化學(xué)組成穩(wěn)定d.化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定e.反應(yīng)和產(chǎn)物有明顯的顏色差別(l>60nm)沒有顏色的化合物，需要通過適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)定量生成有色化合物再測(cè)定－－顯色反應(yīng)1顯色反應(yīng)12.4顯色反應(yīng)及影響因素要求：沒有顏色的化合物，需要通過絡(luò)合反應(yīng)氧化還原反應(yīng)2顯色反應(yīng)類型絡(luò)合反應(yīng)氧化還原反應(yīng)2顯色反應(yīng)類型離子締合反應(yīng)成鹽反應(yīng)離子締合反應(yīng)成鹽反應(yīng)褪色反應(yīng)

Zr(IV)-偶氮胂III絡(luò)合物測(cè)定草酸吸附顯色反應(yīng)

達(dá)旦黃測(cè)定Mg(II),Mg(OH)2吸附達(dá)旦黃呈紅色褪色反應(yīng)吸附顯色反應(yīng)3顯色劑無機(jī)顯色劑:過氧化氫，硫氰酸銨，碘化鉀有機(jī)顯色劑：偶氮類：偶氮胂III3顯色劑無機(jī)顯色劑:有機(jī)顯色劑：三苯甲烷類三苯甲烷酸性染料鉻天菁S三苯甲烷堿性染料結(jié)晶紫三苯甲烷類三苯甲烷堿性染料結(jié)晶紫鄰菲羅啉類：新亞銅靈肟類：丁二肟鄰菲羅啉類：新亞銅靈肟類：丁二肟4多元絡(luò)合物混配化合物Nb-5-Br-PADAP-酒石酸V-PAR-H2O離子締合物

AuCl4--羅丹明B金屬離子-配體-表面活性劑體系Mo-水楊基熒光酮-CTMAB4多元絡(luò)合物混配化合物5影響因素a溶液酸度（pH值及緩沖溶液）影響顯色劑的平衡濃度及顏色，改變?chǔ)影響待測(cè)離子的存在狀態(tài)，防止沉淀影響絡(luò)合物組成形式pHλmax(nm)形式pHλmax(nm)H4L+1.2462-465Sn4+1.0530H3L4.8-5.2462,490Ga3+5.0550H2L-8.4-9.0512HL2-11.4-12.0532-538pH對(duì)苯芴酮及其絡(luò)合物的顏色影響5影響因素a溶液酸度（pH值及緩沖溶液）形式b顯色劑的用量稍過量，處于平臺(tái)區(qū)c顯色反應(yīng)時(shí)間針對(duì)不同顯色反應(yīng)確定顯示時(shí)間顯色反應(yīng)快且穩(wěn)定；顯色反應(yīng)快但不穩(wěn)定；顯色反應(yīng)慢，穩(wěn)定需時(shí)間；顯色反應(yīng)慢但不穩(wěn)定d顯色反應(yīng)溫度加熱可加快反應(yīng)速度，導(dǎo)致顯色劑或產(chǎn)物分解b顯色劑的用量稍過量，處于平臺(tái)區(qū)c顯色反應(yīng)時(shí)間針對(duì)不同e溶劑f干擾離子有機(jī)溶劑，提高靈敏度、顯色反應(yīng)速率消除辦法：提高酸度，加入隱蔽劑，改變價(jià)態(tài)選擇合適參比

褪色空白(鉻天菁S測(cè)Al，氟化銨褪色，消除鋯、鎳、鈷干擾)選擇適當(dāng)波長(zhǎng)e溶劑f干擾離子有機(jī)溶劑，提高靈敏度、顯色反應(yīng)速率消除12.5光度分析法的設(shè)計(jì)1.選擇顯色反應(yīng)2.選擇顯色劑3.優(yōu)化顯色反應(yīng)條件4.選擇檢測(cè)波長(zhǎng)5.選擇合適的濃度6.選擇參比溶液7.建立標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)量條件選擇12.5光度分析法的設(shè)計(jì)1.選擇顯色反應(yīng)測(cè)量條件選擇1測(cè)定波長(zhǎng)選擇選擇原則：“吸收最大，干擾最小”靈敏度選擇性1測(cè)定波長(zhǎng)選擇選擇原則：“吸收最大，干擾最小”靈敏度選擇性2測(cè)定濃度控制控制濃度吸光度A：0.2～0.8減少測(cè)量誤差2測(cè)定濃度控制控制濃度吸光度A：0.2～0.8減少3參比溶液選擇儀器調(diào)零消除吸收池壁和溶液對(duì)入射光的反射扣除干擾試劑空白試樣空白褪色空白3參比溶液選擇儀器調(diào)零試劑空白4標(biāo)準(zhǔn)曲線制作理論基礎(chǔ)：朗伯-比爾定律相同條件下測(cè)定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度AA～c作圖4標(biāo)準(zhǔn)曲線制作理論基礎(chǔ)：朗伯-比爾定律相同條件下12.6吸光光度法的誤差非單色光引起的偏移物理化學(xué)因素：非均勻介質(zhì)及化學(xué)反應(yīng)吸光度測(cè)量的誤差

對(duì)朗伯-比爾定律的偏移12.6吸光光度法的誤差非單色光引起的偏移對(duì)朗伯-比爾定律顯色反應(yīng)體系中的副反應(yīng)影響M+nL=MLn顯色反應(yīng)*其它離子可能與顯色劑反應(yīng)：M′+nL=M′Ln,消耗顯色劑；*L受酸效應(yīng)影響，有L-、HL+等形態(tài)存在；被測(cè)離子有絡(luò)合效應(yīng)。表觀穩(wěn)定常數(shù)：顯色反應(yīng)體系中的副反應(yīng)影響M+nL=MLn顯色通常被測(cè)離子有99％以上絡(luò)合時(shí)，可以認(rèn)為反應(yīng)完全，此時(shí)這個(gè)式子可以判斷不同條件下顯色反應(yīng)的完全程度通常被測(cè)離子有99％以上絡(luò)合時(shí)，可以認(rèn)為反應(yīng)完全，此時(shí)這個(gè)式1非單色光引起的偏移復(fù)合光由l1和l2組成，對(duì)于濃度不同的溶液a和b,引起的吸光度的偏差不一樣，濃度大，復(fù)合光引起的誤差大，故在高濃度時(shí)線性關(guān)系向下彎曲。1非單色光引起的偏移復(fù)合光由l1和l2組成，對(duì)于濃度不同的*其它光學(xué)方面的干擾

雜散光散射光反射光非平行光*被測(cè)物質(zhì)溶液本身的化學(xué)、物理性質(zhì)引起偏離朗伯比爾定律介質(zhì)不均勻（膠體，懸浮、乳濁）；物質(zhì)在溶液中發(fā)生化學(xué)反應(yīng)（離解、締合、異構(gòu)等），重鉻酸鉀＝鉻酸鉀，Cr2O72-+H2O-=2HCrO4-=2H++2CrO42-；再如PAR的偶氮－醌腙式次甲基蘭的單體－λmax660nm,二聚體λmax610nm*其它光學(xué)方面的干擾非均勻介質(zhì)

膠體，懸浮、乳濁等對(duì)光產(chǎn)生散射，使實(shí)測(cè)吸光度增加，導(dǎo)致線性關(guān)系上彎2物理化學(xué)因素離解、締合、異構(gòu)等如：Cr2O72-+H2O-=2HCrO4-=2H++2CrO42-PAR的偶氮－醌腙式化學(xué)反應(yīng)非均勻介質(zhì)2物理化學(xué)因素離解、締合、異構(gòu)等化學(xué)反應(yīng)吸光度標(biāo)尺刻度不均勻3吸光度測(cè)量的誤差A(yù)＝0.434

，T＝36.8%時(shí)，測(cè)量的相對(duì)誤差最小A=0.2~0.8,T=15~65%，相對(duì)誤差<4%

dc/c=dA/A=dT/TlnTEr=dc/c×100％=dA/A×100％=dT/TlnT×100％吸光度標(biāo)尺刻度不均勻3吸光度測(cè)量的誤差A(yù)＝0.434，T令ST=0.01,計(jì)算T不同值時(shí)的Sc/c，當(dāng)TlnT對(duì)T進(jìn)行微分時(shí)，其值為零時(shí)，Sc/c最小，此時(shí)T=0.368。令ST=0.01,計(jì)算T不同值時(shí)的Sc/c，當(dāng)TlnT對(duì)T進(jìn)無機(jī)及分析化學(xué)(第三版)第12章課件1.示差吸光光度法目的：提高光度分析的準(zhǔn)確度和精密度解決高(低)濃度組分(i.e.A在0.2~0.8以外)問題分類：高吸光度差示法、低吸光度差示法、 精密差示吸光度法特點(diǎn)：以標(biāo)準(zhǔn)溶液作空白原理：A相對(duì)=A=bcx-bc0=bc準(zhǔn)確度：讀數(shù)標(biāo)尺擴(kuò)展,相對(duì)誤差減少,

c0愈接近c(diǎn)x,準(zhǔn)確度提高愈顯著12.7常用的吸光光度法1.示差吸光光度法12.7常用的吸光光度法例：硫脲還原－硫氰酸鹽比色法測(cè)定鋼鐵中的鉬。酸溶，硫酸－高氯酸介質(zhì)中，硫脲還原鐵（III）為鐵(II),除干擾，還原鉬（VI）為五價(jià)，2.00mg/100ml的鉬標(biāo)準(zhǔn)溶液為參比溶液，用2.00-2.30mg/100ml的鉬標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制工作曲線和測(cè)定樣品溶液的吸光度,480nm測(cè)定A。例：硫脲還原－硫氰酸鹽比色法測(cè)定鋼鐵中的鉬。酸溶，硫酸－高氯2.雙波長(zhǎng)分光光度法(計(jì)算分光光度法）*光度加和性，溶液的總吸光度應(yīng)等于各吸光物質(zhì)的吸光度之和。A總=A1+A2+A3+……An.對(duì)多組分混合物的分別測(cè)定須解聯(lián)立方程,有聯(lián)立方程法Aλ1=ελ1bc1+ελ1bc2Aλ2=ελ2bc2+ελ2bc1定量分析2.雙波長(zhǎng)分光光度法(計(jì)算分光光度法）*光度加和性，溶液的例如測(cè)定呋喃唑酮和小檗堿復(fù)方片劑中這兩種物質(zhì)的含量1cm池，分別在365、342nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A1和A2),按下式計(jì)算兩組分：Cx=A1/α1[(b-m)/(b-a)]Cy=A2/β2[b(m-a)/m(b-a)]Cx和Cy分別為呋喃唑酮和小檗堿的濃度；α1和α2分別為呋喃唑酮在365和342nm波長(zhǎng)處的吸收系數(shù)（E）；β1和β2分別為硫酸小檗堿在365和342nm波長(zhǎng)處的吸收系數(shù)（E）.m=A2/A1,a=α2/α1;b=β2/β1根據(jù)吸光度加和性得：A1=α1Cx+β1Cy(1);A2=α2Cx+β2Cy(2)m=A2/A1,a=α2/α1;b=β2/β1代入（2）得：例如測(cè)定呋喃唑酮和小檗堿復(fù)方片劑中這兩種物質(zhì)的含量1cm池，ma1=aα1Cx+bβ1Cy(3)(1)代入（3）得Cx=A1/α1[(b-m)/(b-a)]同理得到Cy=A2/β2[b(m-a)/m(b-a)]ma1=aα1Cx+bβ1Cy(3)2.雙波長(zhǎng)吸光光度法目的：解決渾濁樣品光度分析消除背景吸收的干擾多組分同時(shí)檢測(cè)原理：A=Al1-Al2=（l1-l2）bc波長(zhǎng)對(duì)的選擇：a.等吸光度點(diǎn)法，b.系數(shù)倍率法3.導(dǎo)數(shù)吸光光度法2.雙波長(zhǎng)吸光光度法3.導(dǎo)數(shù)吸光光度法選l1為參比波長(zhǎng),l2為測(cè)量波長(zhǎng)得Al1=xl1bcx+

yl1bcyAl2=

xl2bcx+

yl2bcyΔA=Al2-Al1=(

xλ2bcx+

yl2bcy)-(

xl1bcx+

yl1bcy)在等吸光度的位置(G,F),

yl2＝

yl1，則上式成為

ΔA=(

xl2-

xl1）bcxΔA與cx成正比,可用于測(cè)定例,苯酚與2,4,6-三氯苯酚(y)混合物中苯酚(x)的雙波長(zhǎng)分光光度法測(cè)定。選l1為參比波長(zhǎng),l2為測(cè)量波長(zhǎng)例,苯酚與2,4,6-三氯3.導(dǎo)數(shù)吸光光度法目的：提高分辨率去除背景干擾

原理：dnA/dln~l

3.導(dǎo)數(shù)吸光光度法目的：提高分辨率12.8吸光光度法的應(yīng)用1測(cè)定弱酸和弱堿的離解常數(shù)

AHB和AB-分別為有機(jī)弱酸HB在強(qiáng)酸和強(qiáng)堿性時(shí)的吸光度，它們此時(shí)分別全部以[HB]或[B-]形式存在。HB＝H++B-[H+][B-]Ka

=[HB]pKa=pH+lg

[HB][B-]A=AHB+AB-pKa=pH+lg

AB--AA-AHBlg

AB--AA-AHB對(duì)pH作圖即可求得pKa

12.8吸光光度法的應(yīng)用1測(cè)定弱酸和弱堿的離解常數(shù)AH2絡(luò)合物組成確定

飽和法（摩爾比法）制備一系列含釕3.0×10-5mol/L(固定不變)和不同濃度（小于12.0×10-5mol/L）的PDT溶液，按實(shí)驗(yàn)條件，485nm測(cè)定吸光度,作圖。PDT:Ru=2:12絡(luò)合物組成確定飽和法（摩爾比法）制備一系列含釕3.0×等摩爾連續(xù)變化法固定[M]+[L],改變[M],獲得一系列吸光度值，吸光度最大的值所對(duì)應(yīng)的[M]與[L]的比值，即獲得M:L比值。Co(III)與3，5－二氯－PADAT的比值為1:2等摩爾連續(xù)變化法固定[M]+[L],改變[M],獲得一系列吸平衡移動(dòng)法固定[M],不斷改變[L]，以lg[MLn]/[M]為縱坐標(biāo)，lg[L]為橫坐標(biāo)，作圖，斜率n即是絡(luò)合物中L:M的比值；縱軸上的截距l(xiāng)gK是絡(luò)合物的穩(wěn)定常數(shù)。lgK+nlg[L]=lg([MLn]/[M])[MLn]K

=[M][L]nlgK+nlg[L]=lgA/(Amax-A)平衡移動(dòng)法固定[M],不斷改變[L]，以lg[MLn]/[Mc.平衡移動(dòng)法（對(duì)數(shù)作圖法）M+nL＝MLn固定[M],不斷改變[L]，并以lg[MLn]/[M]為縱坐標(biāo)，lg[L]為橫坐標(biāo)，（10）式為一直線方程，斜率n即是絡(luò)合物中L:M的比值；縱軸上的截距l(xiāng)gK是絡(luò)合物的穩(wěn)定常數(shù)。c.平衡移動(dòng)法（對(duì)數(shù)作圖法）M+nL＝MLn固定[M],上式中，[M],[L]和[MLn]為平衡時(shí)各組分的摩爾濃度，[L]濃度由實(shí)驗(yàn)可知，由加入的L的總濃度減去形成絡(luò)合物消耗的L濃度之差計(jì)算，一般形成絡(luò)合物消耗的L與L總濃度相比不大，可忽略。[MLn]可由測(cè)得吸光度Ax計(jì)算，[M]可由Amax-Ax求得，上式變?yōu)椋荷鲜街?，[M],[L]和[MLn]為平衡時(shí)各組分的摩爾濃度，Vx是由試劑L溶液某次所取的體積。[L]o是試劑原始濃度，VMK是實(shí)驗(yàn)時(shí)的容量