化學(xué)小分子探針在藥物發(fā)現(xiàn)中的應(yīng)用

格式支持編輯，如有幫助歡迎下載支持。PAGEPAGE7word格式支持編輯，如有幫助歡迎下載支持。化學(xué)小分子探針在藥物發(fā)現(xiàn)中的應(yīng)用仇文衛(wèi)，湯杰華東師范大學(xué)化學(xué)系、藥物化學(xué)研究所當(dāng)今創(chuàng)新藥物的發(fā)現(xiàn)越來(lái)越依賴于靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)以及靶點(diǎn)與活性化合物作用熱點(diǎn)。1、創(chuàng)新藥物的發(fā)現(xiàn)、靶點(diǎn)與化學(xué)小分子探針10-12年之久（1。因此新藥研發(fā)迫切需要新技術(shù)、新理論，以提高效率、縮短周期。圖1. 新藥研發(fā)過(guò)程現(xiàn)代藥物的發(fā)現(xiàn)過(guò)程主要包括靶點(diǎn)(target)的識(shí)別、先導(dǎo)物的發(fā)現(xiàn)、結(jié)構(gòu)優(yōu)recepto，是指與藥物分子在體內(nèi)相互作用的功能性大分子，通常是某種蛋白質(zhì)（絕大部分靶點(diǎn)是蛋白質(zhì)、核酸、離子通道或DNA那么如何解決藥物靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)問(wèn)題呢？雖然，生命科學(xué)領(lǐng)域的研究近年來(lái)取得了巨大成就，2001在藥物發(fā)現(xiàn)過(guò)程中，化學(xué)小分子探針主要有以下幾個(gè)方面的作用（圖2：(1)解藥物分子與靶點(diǎn)作用部位的結(jié)構(gòu)信息，為進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)改造提供幫助；(2)利能；(3)利用探針?lè)肿舆M(jìn)行細(xì)胞或體內(nèi)的標(biāo)記實(shí)驗(yàn)，可能會(huì)發(fā)現(xiàn)一些與活性化合測(cè)。2.對(duì)于體內(nèi)作用靶點(diǎn)未知，有藥理活性的化合物，特別是來(lái)自天然產(chǎn)物的圖2. 化學(xué)小分子探針在藥物靶點(diǎn)鑒別及靶點(diǎn)蛋白活性位點(diǎn)結(jié)構(gòu)信息研究中的作用示意圖化學(xué)小分子探針的設(shè)計(jì)探針?lè)肿右话闶且云淠阁w化合物（最初的活性化合物）為基礎(chǔ)，根據(jù)初步偶極-偶極相互作用、范德華力、氫鍵等分子間引力相互吸引，形成復(fù)合物，這種作用相對(duì)較弱、不穩(wěn)定，是可逆的。ABPPPAL-ABPP化學(xué)小分子探針及其功能部位針對(duì)能與靶點(diǎn)蛋白形成共價(jià)作用的活性化合物設(shè)計(jì)的探針?lè)肿右话惆ㄋ膫€(gè)功能部位：結(jié)合基團(tuán)(bindinggroup,BG)，反應(yīng)基團(tuán)(reactivegroup,RG)部位(linkerunit)(reportergroup)通常也稱標(biāo)簽(tag)主要用于包括靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)在內(nèi)的蛋白質(zhì)功能的研究，是一種活性基于蛋白譜技術(shù)（activity-basedproteinprofiling,ABPP）的探針?lè)肿?，因此人們將這種探針?lè)肿臃Q為ABPP探針?lè)肿?圖3A)。圖3. ABPP及PAL-ABPP探針?lè)肿訕?biāo)記靶點(diǎn)蛋白針對(duì)不能與靶點(diǎn)形成共價(jià)鍵，只能通過(guò)離子鍵、偶極-偶極相互作用、范德因此就需要引入光親和標(biāo)記基團(tuán)(photoaffinitylabelinggroup,(共價(jià)修飾)在靶點(diǎn)蛋白的活性部位，這種探針?lè)肿涌煞Q為PAL-ABPP探針?lè)肿?，也包括四個(gè)功能部位：結(jié)合基團(tuán)、光親和標(biāo)記基團(tuán)、鏈接部位、報(bào)告基團(tuán)(圖3B)。結(jié)合基團(tuán)結(jié)合基團(tuán)(BG)是探針?lè)肿幼钪匾牟糠?，理想情況下它必須將探針?lè)肿犹夭慌c環(huán)境中的其他生物分子作用。反應(yīng)基團(tuán)反應(yīng)基團(tuán)(RG)的作用是在探針?lè)肿舆M(jìn)入靶點(diǎn)蛋白活性中心后，通過(guò)反應(yīng)將探針?lè)肿庸矁r(jià)修飾在靶點(diǎn)蛋白的活性中心，使探針?lè)肿优c蛋白質(zhì)的牢固連接。光親和標(biāo)記基團(tuán)光親和標(biāo)記基團(tuán)可以在紫外光照射下將探針?lè)肿庸矁r(jià)修飾在靶點(diǎn)蛋白上。通常被引入的光親和基團(tuán)包括苯基疊氮類(phenylazides)吖丙啶類(trifluoromethylphenyldiazirine)、二苯甲酮類(benzophenone)等(圖4)圖4. 各種光親和標(biāo)記基團(tuán)的標(biāo)記反應(yīng)三者之中，三氟甲基苯基雙吖丙啶是最接近理想的光親和基團(tuán)。連接部位連接部位是連接結(jié)合基團(tuán)、反應(yīng)基團(tuán)與報(bào)告基團(tuán)的一段柔性的鏈狀結(jié)構(gòu)，細(xì)胞膜，后者對(duì)于疏水性的探針?lè)肿觼?lái)說(shuō)可以增強(qiáng)其水溶性。報(bào)告基團(tuán)報(bào)告基團(tuán)(Tag)的作用是方便人們簡(jiǎn)單快速的識(shí)別或純化被標(biāo)記的蛋白。最常用的報(bào)告基團(tuán)有熒光基團(tuán)(fluorescencegroup)及生物素(Biotin)等。熒光素如Rhodamine、、FITC、BODIPY、Cy3、Cy5等具有靈敏性高的特點(diǎn)，同時(shí)可以利用現(xiàn)代質(zhì)譜技術(shù)定量檢測(cè)標(biāo)記蛋白。生物素(biotin)由于其與Avidin有很強(qiáng)的特異性結(jié)合能力(1015M-1)，因此可以富集、純化或識(shí)別被標(biāo)記蛋白，Biotin與Avidin的復(fù)合物通常可使用鹽酸胍溶液(guanidine-HCl)、SDSBiotin溶液等使其解析。圖5.生物素(biotin)富集、純化、識(shí)別被標(biāo)記的蛋白及肽片段“點(diǎn)擊化學(xué)”（ClickChemistry）在化學(xué)小分子探針合成中的應(yīng)用Clickchemistry(合成新技術(shù)，click是點(diǎn)擊鼠標(biāo)的聲音，意思是這個(gè)反應(yīng)非常容易而且可靠，就2001ScrippsSharplessCC這一概念，是指具有以下特征的化學(xué)反應(yīng)：反應(yīng)原料易得，反應(yīng)非?？煽?，Cu(I)1,2,3-三氮唑化合物(Huisgen1,3-偶極環(huán)加成)的反應(yīng)，在組合化學(xué)、靶點(diǎn)導(dǎo)向的活性小分子合成及生物偶聯(lián)技術(shù)等方面有著較好的應(yīng)用。CC技術(shù)的出現(xiàn)也極大地促進(jìn)了化學(xué)小分子探針技術(shù)的發(fā)展。ABPP探針?lè)肿訕?biāo)記實(shí)驗(yàn)一直是在細(xì)胞或組織勻漿液中進(jìn)行的()個(gè)主要的原因是報(bào)告基團(tuán)體積很大使得小分子探針的分子量通常在7001000Da，限制了探針?lè)肿拥奈铡⒎植?，甚至可能改變探針?lè)肿拥淖饔媚Ｊ健?美國(guó)Scripps研究所Cravatt等最早將CC與ABPPCC-ABPP(PS-NCu(I)催化下與標(biāo)簽分子發(fā)生環(huán)加成反應(yīng)生成三氮唑分子將標(biāo)簽連接到探針?lè)肿由?圖6)，克服了ABPP探針?lè)肿拥纳鲜鋈秉c(diǎn)。CC-ABPP探針?lè)肿釉O(shè)計(jì)包括結(jié)合基團(tuán)、反應(yīng)基團(tuán)、連接部()。3CC-ABPP策略與ABPP策略的主要區(qū)別在于其報(bào)告基團(tuán)是在探針?lè)肿訕?biāo)記了靶”反應(yīng)引入的，這樣就避免了ABPP積過(guò)大所造成的一些不足。同理對(duì)于與靶點(diǎn)蛋白非共價(jià)作用的活性化合物，CravattPAL-CC-ABPP記基團(tuán)、連接部位、潛在的報(bào)告基團(tuán)。NuNuNuNNNuNNN

OPhSO(CH2)6O(PS-N3)

(CH2)6N3Nu6CC-ABPPNu

Cu(I)

Tag

(CH2)6

TagPS-N3是一個(gè)活性導(dǎo)向的多靶點(diǎn)探針?lè)肿?，它可用于?duì)谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GSTO1-1)、醛脫氫酶(ALDH-1)、巴豆酸酶(ECH-1)等的標(biāo)記。Cravatt等運(yùn)用CC-ABPP策略將PS-N3與COS細(xì)胞孵育細(xì)胞勻漿后加入炔基羅丹（Rh 在Cu(I)催化下發(fā)生“click”反應(yīng)，將熒光素羅丹明引入到探針?lè)肿又蟹奖銟?biāo)記后的檢測(cè)結(jié)果顯示PS-N3能夠在原位(insitu)標(biāo)記GSTO它們甚至將PS-N3注射到老鼠體內(nèi)，處死老鼠后取其心臟組織勻漿后加入炔基羅丹明進(jìn)行“click”反應(yīng)，結(jié)果顯示探針?lè)肿幽軌蛟趧?dòng)物體內(nèi)標(biāo)記ECH-1(圖7)。小分子探針PS-N3Cravatt等將其與乳腺癌細(xì)胞株(MDA-MB-231)孵育后細(xì)胞勻漿，加入炔基羅丹明進(jìn)行“click示運(yùn)用CC-ABPP策略針對(duì)MDA-MB-231標(biāo)記到的一些靶點(diǎn)蛋白，是以前運(yùn)用ABPP策略在體外(invitro)標(biāo)記從