胰島素重組技術(shù)課件

重組人胰島素生產(chǎn)工藝重組人胰島素定義：

胰島素：是由胰島β細(xì)胞受內(nèi)源性或外源性物質(zhì)如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸等的刺激而分泌的一種蛋白質(zhì)激素。重組人胰島素（現(xiàn)階段臨床最常使用的胰島素）：利用生物工程技術(shù)，獲得的高純度的生物合成人胰島素，其氨基酸排列順序及生物活性與人體本身的胰島素完全相同。

結(jié)構(gòu)：

胰島素由A、B兩個肽鏈組成。A鏈有11種21個氨基酸，B鏈有15種30個氨基酸，共26種51個氨基酸組成。其中A7(Cys)-B7(Cys)、A20(Cys)-B19(Cys)四個半胱氨酸中的巰基形成兩個二硫鍵，使A、B兩鏈連接起來。此外A鏈中A6(Cys)與A11(Cys)之間也存在一個二硫鍵。胰島素的性質(zhì)

胰島素的功能

胰島素是機體內(nèi)唯一降低血糖的激素，也是唯一同時促進糖原、脂肪、蛋白質(zhì)合成的激素。藥理作用

治療糖尿病、消耗性疾病。胰島素的研究歷史

1921年----從動物胰腺中提取出胰島素，開創(chuàng)了人類胰島素治療的歷史。

1926年----重結(jié)晶胰島素

1930s----傳統(tǒng)中、長效動物胰島素

1970s----單峰胰島素和單組分胰島素

70年代末----半合成胰島素

1982年----采用基因重組技術(shù)生產(chǎn)的人胰島素正式上市。90年代至今----重組人胰島素類似物成功研發(fā)上市，包括超短效和長效人胰島素類似物。胰島素制備工藝

以動物胰臟為原料提取胰島素

----酸醇提取法

※傳統(tǒng)胰島素---豬、牛胰臟提取，只經(jīng)一步重結(jié)晶

※單峰胰島素----凝膠過濾純化

※單組分胰島素---凝膠過濾、離子交換純化

半合成胰島素----以豬胰島素為原料，酶修飾后得到人胰島素重組DNA技術(shù)生產(chǎn)人胰島素

※AB鏈合成：分別表達AB鏈，化學(xué)方法連接

※逆轉(zhuǎn)錄法：表達胰島素原，酶切得到重組人胰島素InsA鏈InsB鏈轉(zhuǎn)化大腸桿菌發(fā)酵A鏈B鏈純化二硫鍵活性胰島素AB鏈合成人胰島素AB鏈合成法提取目的基因：既從人的DNA中提取胰島素基因，可使用限制性內(nèi)切酶將目的基因從原DNA中分離。主要有如下4種方法：（1）鳥槍法：用一大堆限制性核酸內(nèi)切酶對附近基因進行剪切，再提取所需要的。至于如何篩選，用DNA分子雜交，即DNA探針（2）人工合成法：根據(jù)轉(zhuǎn)錄蛋白或者mRNA推導(dǎo)出基因序列，然后人工合成，沒有內(nèi)含子。（3）從基因文庫中提?。阂簿褪鞘孪纫呀?jīng)提取完畢的拿來用（4）PCR擴增技術(shù)：用于大量生產(chǎn)該段基因片段，用于商業(yè)化運作……

基因重組：取出目的基因與質(zhì)粒，先利用同種限制性內(nèi)切酶將質(zhì)粒切開，再使用DNA連接酶將目的基因與質(zhì)?！翱p合”，形成一個能表達出胰島素的DNA質(zhì)粒。將質(zhì)粒送回大腸桿菌：在大腸桿菌的培養(yǎng)液中加入含有Ca+的物質(zhì)，如CaCl2,這使細(xì)胞會吸收外源基因，此時將重組的質(zhì)粒也放入培養(yǎng)液中，大腸桿菌便會將重組質(zhì)粒吸收。將大腸桿菌用氯化鈣處理，以增大大腸桿菌細(xì)胞壁的通透性，使含有目的基因的重組質(zhì)粒能夠進入受體細(xì)胞，此時的細(xì)胞處于感受態(tài)（理化方法誘導(dǎo)細(xì)胞，使其處于最適攝取和容納外來DNA的生理狀態(tài)）。胰島素的產(chǎn)生：再大腸桿菌內(nèi)，質(zhì)粒通過表達轉(zhuǎn)錄與翻譯后，便產(chǎn)生出胰島素蛋白質(zhì)。通過大腸桿菌的大量繁衍，便可大量生產(chǎn)出胰島素。（注意：大腸桿菌產(chǎn)出的是多肽鏈，因為原核生物沒有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等，不能進行多肽的折疊、修飾等，還需人為進行菌體外加工。）質(zhì)粒InsmRNA反轉(zhuǎn)錄InscDNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌PCR連接胰島素原活性胰島素二硫鍵酶切

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