DNA電泳實驗報告楊家慶

o浙江農(nóng)林大學(xué)1958實驗室開放項目DNA和蛋白質(zhì)的電泳技術(shù)姓名：楊家慶班級：測繪工程151班學(xué)號:201518080113指導(dǎo)老師：楊仙玉完成時間：2016年11月23日一?實驗名稱：DNA的電泳技術(shù)二實驗?zāi)康模涵傊悄z電泳是常用的檢測核酸的方法，學(xué)D1NA瓊脂糖凝膠電泳的使用技術(shù)，掌握有關(guān)的技術(shù)和識讀電泳圖譜的方法。三實驗原理：瓊脂糖凝膠電泳是常用的用于分離、鑒定DNA、RNA分子混合物的方法，這種電泳方法以瓊脂凝膠作為支持物，利用DNA分子在泳動時的電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，達到分離混合物的目的。DNA分子在高于其等電點的溶液中帶負電，在電場中向陽極移動。在一定的電場強度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即分子本身的大小和構(gòu)型是主要的影響因素。DNA分子的遷移速度與其相對分子量成反比。不同構(gòu)型的DNA分子的遷移速度不同。儀器：制膠模具、電泳槽、電泳儀、燒杯、錐形瓶、移液槍、手套、微波爐、凝膠成像儀、分析天平、鑰匙、離心機、紫外線透射儀、干式恒溫器等。試劑：瓊脂糖（白色粉末'TAE緩沖液、EB（漠化乙錠-致癌劑，操作中要嚴格戴手套）；五■實驗步驟：（一）。皿電泳實驗?zāi)０迥z的制作：.稱取1g瓊脂糖加入盛有100mL的1*TAE溶液中，混合均勻后用微波爐加熱至沸騰，加熱2-3次，每次沸騰之后取出搖勻，直至混合均勻；.待溶液冷卻至40-501時，倒入制膠模具內(nèi)（注意要快速倒入，以防倒入的過程中溶液凝膠），凝固后，上DNA樣品；.上樣后，將模具移入電泳槽，將樣品端上到負極，通電，恒壓120V,25-30min;.將膠移入凝膠成像儀，用紫外光觀察，拍照存檔，保存圖片；.清理實驗相關(guān)物品，整理實驗器材，實驗結(jié)束。DNA凝膠回收：.稱量凝膠重量，按質(zhì)量：體積=1:1換算，再按凝膠：BufferG=1:3加入3倍的BufferG溶液放入干濕恒溫機中加熱融化；.將溶液轉(zhuǎn)入2ml離心管中，離心30s（13200rmp/min）；在離心管中再加入500微升的BufferWS溶液，離心30s；.加入700微升的WG溶液，離心30s；.離心結(jié)束后倒掉廢液將空的離心管放入離心機空轉(zhuǎn)30s或1min,將DNA中的殘留液體甩干凈；.離心結(jié)束后，將含有DNA的薄片快速取出（為防止剩余的酒精再次揮發(fā)進入）；.在放置DNA薄片的離心管中加入20微升的水（水要從中間加入，打在DNA薄片上，待DNA溶于水），靜置1min，離心；.清理實驗相關(guān)物品，整理實驗器材，實驗結(jié)束。凝膠回收后DNA片段的電泳：.將膠從凝膠成像儀中取出，在相對黑暗的條件下用紫外光照射，看到清晰地六條條帶之后，將相應(yīng)的條帶逐條切下（切的時候盡可能薄，每個條帶的重量不要超過0.3g），做凝膠回收，得到相應(yīng)的DNA分子；.重復(fù)制膠過程，在得到的模具中重復(fù)上樣過程，在第一個孔內(nèi)上標準DNA樣品，其余孔內(nèi)加入相應(yīng)波長DNA樣品；.上樣后，將模具移入電泳槽』各樣品端上到負極，通電，恒壓120V,25-30min;.將膠移入凝膠成像儀，用紫外光觀察，拍照存檔，保存圖片；.清理實驗相關(guān)物品，整理實驗器材，實驗結(jié)束。（二）PCR（Polymerasechainreaction,聚合酶鏈式反應(yīng)）實驗：1、配置反應(yīng)所需試劑：反應(yīng)體系為20微升，首先加入14微升水，然后依次加入2微升10*B（buffer%0.8微升DNTPs（四種脫氧核苷酸混合物\1微升cDNA（模板DNA'1微升引物1、1微升引物2（引物1、2方向相反）以及0.2微升Ta（DNA聚合酶）;2、溶液配置好之后，對溶液溶液進行預(yù)變性處理，條件95^,時間2-5min;3、預(yù)處理過后，進行變性操作，條件94^,時間30s,之后，進行退活，條件58°C時間30s，然后延長反應(yīng)，72偵30s;4、重復(fù)步驟3,共循環(huán)35次；5、循環(huán)過程結(jié)束，在72C下保存8min;6、制作瓊脂糖凝膠，將樣品與5微升loadingbuffer溶液混合，上樣，進行電泳；7、將膠移入凝膠成像儀，用紫外光觀察，拍照存檔，保存圖片；8、清理實驗相關(guān)物品，整理實驗器材，實驗結(jié)束。六、實驗結(jié)果：標準DNA上樣后成像為（如下左圖）：從上到下六條分帶分別代表不同大小的DNA分子片段，帶的粗細表現(xiàn)該片段的含量的多少，如圖從上到下每個條帶一次對應(yīng)的DNA分子片段的大小為:2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。凝膠回收后，各個不同片段的條帶與MARKER帶的對比成像為（如下右圖），其中，最亮的條帶對應(yīng)的DNA量是150ng,其余的均為50ngPCR實驗結(jié)果成圖為結(jié)果討論:影響實驗結(jié)果的因素有：實驗過程中儀器操作不當；實驗過程中液體漏加或加錯；電泳時電場強度以及電泳液的導(dǎo)電性能的影響；實驗中所需溶液不同濃度所帶來的影響；上樣時在注入樣品的過程中沒有成功注入；凝膠成像儀使用不當?shù)?。八、實驗感想和建議：通過一學(xué)期的實驗，我越發(fā)的明白實驗操作對于結(jié)果的重要性。實驗操作可以說是實驗成功與否的關(guān)鍵部分，可是馬虎不得。對于需要團隊合作的實驗，個人認為要有強勢的人員搭檔，不說是精通實驗操作規(guī)程，最少也得知道實驗的基本操作，掌握要做實驗的操作方法，這對于后續(xù)的實驗無疑是與決定性作用的。對于個人的實驗?zāi)芰?，關(guān)鍵還是要看平時的積累，有些實驗操作繁瑣復(fù)雜，需要極大的耐心，這些都應(yīng)該是逐漸培養(yǎng)起來的。通過這次實驗的學(xué)習(xí)，使我學(xué)到了不少實用的知識更重要的是,做實驗的過程，思考問題的方法，這與做其他的實驗是通用的，加強了我的動手能力，并且培養(yǎng)了我的獨立思考能力，使我受益匪淺.通過這次實驗的學(xué)習(xí)，我學(xué)到了很多，得到了很多，有些是書本上學(xué)不到的，只有自己參與了，操作了，才會知道。也要感謝老師對我們的照顧。蛋白質(zhì)的電泳實驗一?實驗名稱：蛋白質(zhì)的電泳技術(shù)（SDS電泳）二實驗?zāi)康模簩W(xué)習(xí)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法（SDS—PAGE）測定蛋白質(zhì)的分子量的原理和基本操作技術(shù)。三實驗原理：蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，在一定的pH條件下解離而帶電荷。當溶液的pH大于蛋白質(zhì)的等電點（pI）時，蛋白質(zhì)本身帶負電，在電場中將向正極移動當溶液的pH小于蛋白質(zhì)的等電點時蛋白質(zhì)帶正電，在電場中將向負極移動；蛋白質(zhì)在特定電場中移動的速度取決于其本身所帶的凈電荷的多少、蛋白質(zhì)顆粒的大小和分子形狀、電場強度等。聚丙烯酰胺凝膠是由一定量的丙烯酰胺和雙丙烯酰胺聚合而成的三維網(wǎng)狀孔結(jié)構(gòu)。本實驗采用不連續(xù)凝膠系統(tǒng)，調(diào)整雙丙烯酰胺用量的多少，可制成不同孔徑的兩層凝膠；這樣，當含有不同分子量的蛋白質(zhì)溶液通過這兩層凝膠時，受阻滯的程度不同而表現(xiàn)出不同的遷移率。由于上層膠的孔徑較大，不同大小的蛋白質(zhì)分子在通過大孔膠時，受到的阻滯基本相同，因此以相同的速率移動；當進入小孔膠時，分子量大的蛋白質(zhì)移動速度減慢，因而在兩層凝膠的界面處，樣品被壓縮成很窄的區(qū)帶。這就是常說的濃縮效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。同時，在制備上層膠（濃縮膠）和下層膠（分離膠）時，采用兩種緩沖體系；上層膠pH=6.7—6.8，下層膠pH=8.9;Tris—HCI緩沖液中的Tris用于維持溶液的電中性及pH，是緩沖配對離子；CI-是前導(dǎo)離子。在pH6.8時，緩沖液中的Gly-為尾隨離子，而在pH=8.9時，Gly的解離度增加；這樣濃縮膠和分離膠之間pH的不連續(xù)性，控制了慢離子的解離度，進而達到控制其有效遷移率之目的。不同蛋白質(zhì)具有不同的等電點，在進入分離膠后，各種蛋白質(zhì)由于所帶的靜電荷不同，而有不同的遷移率。由于在聚丙烯酰胺凝膠電泳中存在的濃縮效應(yīng)，分子篩效應(yīng)及電荷效應(yīng)，使不同的蛋白質(zhì)在同一電場中達到有效的分離。如果在聚丙烯酰胺凝膠中加入一定濃度的十二烷基硫酸鈉(SDS)，由于SDS帶有大量的負電荷，且這種陰離子表面活性劑能使蛋白質(zhì)變性，特別是在強還原劑如巰基乙醇存在下，蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵被還原，肽鏈完全伸展，使蛋白質(zhì)分子與SDS充分結(jié)合，形成帶負電性的蛋白質(zhì)一SDS復(fù)合物；此時，蛋白質(zhì)分子上所帶的負電荷量遠遠超過蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，掩蓋了不同蛋白質(zhì)間所帶電荷上的差異。蛋白質(zhì)分子量愈小，在電場中移動得愈快；反之，愈慢。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)法測定蛋白質(zhì)的分子量具有簡便、快速、重復(fù)性好的優(yōu)點，是目前一般實驗室常用的測定蛋白質(zhì)分子量的方法。儀器：SDS制膠玻璃板、電泳槽、電泳儀、燒杯、移液槍、手套、微波爐、凝膠成像儀、紫外線透射儀、干式恒溫器、磁力攪拌機、磁力攪拌棒等試劑：1.5MTris-HCL（PH=8.8）、1.0MTris-HCL（PH=6.8）、10%SDS、10%APS、TEMED溶液、水五、實驗步驟：（一）分離膠的制備：將玻璃板對齊后放入夾中卡緊，然后垂直卡在架子上（操作時要使兩玻璃板對齊以免漏膠），再注入入少量瓊脂，將其放入恒溫振蕩器中預(yù)熱（預(yù)熱是為了防止因室內(nèi)溫度過低而導(dǎo)致瓊脂凝固：加入瓊脂是為了防止膠滲漏）；配置分離膠溶液按照：1.6ml?1.3ml1.5MTris-HCl（PH=8.8）、2mlaa（acrylaimde30%X0.05ml10%SDS的量以及順序配置溶液，并在配置過程中放入磁力攪拌機不停攪拌是混合均勻；待玻璃板預(yù)熱完畢，取出玻璃板，再向溶液中加入0.05ml10%APS（過硫酸銨，催化劑）以及0.02mlTEMED原液（催化劑），加好后，盡快地倒入玻璃板制膠模具中；注入約一半分離膠之后，用蒸餾水注滿玻璃板，液封后凝膠更快，靜置待其凝膠，若滲漏嚴重，則需重新制膠。（二）濃縮膠制作配置分離膠溶液，按照：1.4ml水、0.25ml1.0MTris-HCl（PH=6.8）、0.33mlaa（acrylaimde30%X0.02ml10%SDS的量以及順序配置溶液，并在配置過程中放入磁力攪拌機不停攪拌是混合均勻；待分離膠凝膠成功后，倒掉上方蒸餾水，此時，再向濃縮膠溶液中加入0.02ml10%APS（過硫酸銨，催化劑）以及0.002mlTEMED原液（催化劑），加好后，盡快地倒入玻璃板制膠模具中；注入濃縮膠至注滿玻璃板后，插好梳子，等待凝膠。（三）蛋白質(zhì)電泳靜置30分鐘左右，待凝膠結(jié)束后，拔出梳子，在孔內(nèi)加入maker樣品；加樣時，用手夾住兩塊玻璃板，上提斜插板使其松開，然后取下玻璃膠室去掉密封用硅膠框，再將玻璃膠室凹面朝里置入電泳槽，插入斜板，將緩沖液加至內(nèi)槽玻璃凹面以上,外槽緩沖液加到距平板玻璃上沿3mm處即可，注意避免在電泳槽內(nèi)出現(xiàn)氣泡；加樣后，通電，在恒流狀態(tài)下進行電泳，時間90min；電泳結(jié)束后，關(guān)掉電源，取出玻璃板，在長短兩塊玻璃板下角空隙內(nèi)，用刀輕輕撬動，即將膠面與一塊玻璃板分開，然后輕輕將膠片托起，得到成膠；將膠體放入清水溶液中，用微波爐加熱10s左右至溫?zé)幔湃霌u床脫色10min，重復(fù)此過程3次，過程中要不斷換水，直至背景透明蛋白質(zhì)帶清晰為止。清理實驗相關(guān)物品，整理實驗器材，實驗結(jié)束。六、實驗結(jié)果：蛋白質(zhì)電泳SDS電泳實驗拍照結(jié)果為：其中，12%SDS各個條帶相對應(yīng)的蛋白質(zhì)分子量從上到下應(yīng)依次為：116kD、66.2kD、45.0kD、35.0kD、25.0kD、18.4kD、14.4kD七,結(jié)果討論：1、在第一次實驗中，制作分離膠失敗，失敗原因可能有：（1）制備瓊脂膠體時，膠體未將底部全部密封好；（2）在制備分離膠溶液過程中，溶液成分的量有可能添加錯誤;（3）制備過程中溶液未混合均勻；（4）在向玻璃板中倒入分離膠時，操作不當或有誤；（5）加入瓊脂后玻璃板預(yù)熱過程沒有完全預(yù)熱等。影響實驗結(jié)果的因素有：（1）實驗過程中儀器操作不當；（2）實驗過程中液體漏加或加錯；（3）電泳時電場強度以及電泳液的導(dǎo)電性能的影響；實驗中所需溶液不同濃度所帶來的影響；上樣時在注入樣品的過程中沒有成功注入八、實驗感想和建議：通過這次實驗的學(xué)習(xí)，使我學(xué)到了不少實用的知識更重要的是,做實驗的過程，思考問題的方法，這與做其他的實驗是通用的，加強了我的動手能力，并且培養(yǎng)了我的獨立思考能力，使我受益匪