DNA的重組與轉(zhuǎn)座培訓課程課件

一節(jié)DNA重組

同源重組特異位點重組二節(jié)DNA轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)座子的概念轉(zhuǎn)座子的分類轉(zhuǎn)座過程發(fā)生和機制轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座的特征真核生物的轉(zhuǎn)座因子第六章DNA的重組與轉(zhuǎn)座一節(jié)DNA重組第六章DNA的重組與轉(zhuǎn)座1

重組和突變是產(chǎn)生遺傳變異的兩大主要因素，但二者的分子機制截然不同：重組是已經(jīng)存在的遺傳信息發(fā)生重排，而突變是改變基因組中的堿基。但二者在分子機制上又是相互影響的。

一概念

DNA分子內(nèi)或分子間發(fā)生遺傳信息的重新組合稱為DNA的重組(遺傳重組或基因重排)。

第一節(jié)DNA的重組重組和突變是產(chǎn)生遺傳變異的兩大主要因素，但二者2

二DNA重組的意義對生物進化起著關(guān)鍵作用。能迅速增加群體的遺傳多樣性(diversity)，使有利突變與不利突變分開，通過優(yōu)化組合積累有意義的遺傳信息；提供修復機制；調(diào)節(jié)基因表達等。二DNA重組的意義3

三重組主要類型

1同源重組2特異位點重組3異常重組

其共同點是雙股DNA間的物質(zhì)交換，但發(fā)生的情況不同。三重組主要類型其共同點是雙股DNA間的物41同源重組

◎發(fā)生在同源序列間的重組稱為同源重組(homologousrecombination)，又稱基本重組。是最基本的DNA重組方式，通過鏈的斷裂和再連接，在兩個DNA分子同源序列間進行單鏈或雙鏈片段的交換。1同源重組5

◎Holliday重組模型

RobinHolliday于1964年提出了重組的雜合DNA模型，又稱Holliday模型。該模型對重組過程的解釋如下：同源的非姐妹染色單體聯(lián)會；同源非姐妹染色單體DNA中兩個方向相同的單鏈，在DNA內(nèi)切酶的作用下，在相同位置同時切開；切開的單鏈交換重接;形成交聯(lián)橋結(jié)構(gòu)；交聯(lián)橋沿配對DNA分子“移動”。兩個親本DNA分子間造成一大段異源雙鏈DNA（Holliday結(jié)構(gòu)）繞交聯(lián)橋旋轉(zhuǎn)180度；形成Holliday異構(gòu)體；通過兩種方式之一切斷DNA單鏈，若左右切，則形成非重組體，若上下切則形成重組體。

◎Holliday重組模型6片段重組體拼接重組體

無論Holliday結(jié)構(gòu)斷裂是否導致旁側(cè)遺傳標記的重組，他們都含有一個異源雙鏈DNA區(qū)。片段重組體拼接重組體無論Holliday結(jié)構(gòu)斷裂是7◎異源雙鏈與基因轉(zhuǎn)變

異源雙鏈DNA：由不同親本雙鏈分子中的互補單鏈產(chǎn)生堿基配對的雙鏈DNA，在遺傳重組中產(chǎn)生?；蜣D(zhuǎn)變：一個基因轉(zhuǎn)變?yōu)樗牡任换虻倪z傳學現(xiàn)象?！虍愒措p鏈與基因轉(zhuǎn)變8

基因轉(zhuǎn)變的實質(zhì)：重組過程中留下的局部異源雙鏈區(qū)，在細胞內(nèi)的修復系統(tǒng)識別下不同的酶切/不酶切產(chǎn)生的結(jié)果。不同的切除會產(chǎn)生不同的結(jié)果?！粱蜣D(zhuǎn)變的實質(zhì)：重組過程中留下的局部異源雙鏈區(qū)，9◎細菌的基因轉(zhuǎn)移與重組機制

細菌接合：指通過細菌細胞的直接接觸，遺傳信息從供體單向轉(zhuǎn)移到受體的過程。致育因子：能夠促使染色體基因轉(zhuǎn)移的接合質(zhì)粒稱為致育因子。簡稱性因子或F因子。

轉(zhuǎn)化(transformation)：指細菌品系吸收了外源DNA(轉(zhuǎn)化因子)而發(fā)生遺傳性狀改變的現(xiàn)象。具有攝取環(huán)境中游離DNA分子能力的細菌稱為感受態(tài)細胞(competentcell)。有些細菌在自然條件下就可成為感受態(tài)；在實驗室也可用高濃度Ca2+誘導細菌成為感受態(tài)?！痢蚣毦幕蜣D(zhuǎn)移與重組機制致育因子：能夠促使染10

轉(zhuǎn)導作用:當病毒從被感染的供體細胞釋放出來﹑再次感染另一細胞時,發(fā)生在供體細胞和受體細胞之間的DNA轉(zhuǎn)移及基因重組.整合

細菌的融合(transduction)：細菌細胞膜融合導致的基因轉(zhuǎn)移和重組叫細胞融合?！赁D(zhuǎn)導作用:當病毒從被感染的供體細胞釋放出來﹑再11

◎同源重組的酶學機制DNA分子之間的交換僅涉及DNA分子重組機制和限制區(qū)域的這一部分，而不是整個染色體。有三種情況:由斷裂分子產(chǎn)生的單鏈與非姊妹染色單體的雙鏈相互作用；單鏈侵入雙鏈異源雙鏈結(jié)構(gòu)的形成。

以上每一步都需要酶的催化◎同源重組的酶學機制由斷裂分子產(chǎn)生的單鏈與非姊妹染色單體的12

Chi位點和RecBCD核酸酶(外切酶)

Chi位點：它由于單個堿基對的改變產(chǎn)生了刺激重組的位點。這一位點是由8個堿基組成的非對稱序列：5′GCTGGTGG3′3′CGACCACC5′●由斷裂分子產(chǎn)生的單鏈與非姊妹染色單體的雙鏈相互作用Chi序列天然存在于大腸桿菌的DNA中,每5-10kb長的序列出現(xiàn)一次.

Chi位點是recBCD編碼的RecBCD核酸酶的靶序列Chi位點和RecBCD核酸酶(外切酶)5′GCTGGTG13RecBCD酶是一種強的核酸酶，可降解DNA，具有解旋酶活性，在SSB存在時它可以解開雙鏈；具有ATPase活性。在重組中的作用是提供帶有游離端的單鏈區(qū)。RecBCD酶14

當RecBCD結(jié)合在DNAChi位點右側(cè)的短裂端時，它沿著DNA移動，使DNA解旋。當?shù)竭_Chi位點3′端4-6pb時它停頓下來，并切開單鏈DNA,產(chǎn)生具有3′端的游離單鏈.引發(fā)異源雙鏈的形成.Chi位點的識別導致RecBCD核酸酶失去的活性，但繼續(xù)發(fā)揮其解旋酶的作用。當RecBCD結(jié)合在DNAChi位點右側(cè)的15RceA蛋白有兩個主要功能：誘發(fā)SOS反應；促進DNA單鏈的同化,即單鏈與同源雙鏈發(fā)生鏈的交換。

RecA能使單鏈DNA取代雙鏈分子中同源的鏈，一般要具備三個條件：①其中一個DNA分子必須要有一個單鏈區(qū)域；②其中一個DNA分子必須要有一個游離的3′末端；③此單鏈區(qū)域和3′末端必須和另一個DNA分子有互補區(qū)?！駟捂溓秩腚p鏈

RecA蛋白與Holliday中間體的形成RceA蛋白有兩個主要功能：RecA能使單16RecA蛋白與單鏈DNA結(jié)合；復合物與同源雙鏈DNA結(jié)合；入侵單鏈與雙鏈中互補鏈配對，同源鏈被轉(zhuǎn)換出來RecA蛋白與單鏈DNA結(jié)合；17

RuvA和RuvB蛋白可促進異源雙鏈結(jié)構(gòu)的形成。RuvA可識別Holliday連接的結(jié)構(gòu),形成一個四面構(gòu)象,促進分支點移動；RuvB是一種解旋酶，它可發(fā)動遷移反應。RuvC將Holliday中間體切開,由DNA聚合酶和連接酶修復合成.●異源雙鏈結(jié)構(gòu)的形成Ruv蛋白和Holliday中間體的拆分RuvA和RuvB蛋白可促進異源雙鏈結(jié)構(gòu)的形成18大腸桿菌中涉及產(chǎn)生重組DNA的重組基因基因功能RecBCD系統(tǒng)具有核酸酶，解旋酶和ATPase活性。在Chi位點產(chǎn)生單鏈3ˊ游離未端RecB,RecC,RecDRecBCD是ATP依賴的外切酶和解旋酶(外切酶V)，它與雙鏈斷口結(jié)合，解開DNA并導入裂口，其傾向性位點稱為chi(參見重組熱點)。RecBCD酶產(chǎn)生RecA可以作用的底物RceA(1)具有蛋白酶活性;(2)在單鏈DNA和ATP存在的條件下RecA能啟動DNA單鏈和與之互補的雙鏈分子進行堿基配對。RceG具有解旋酶活性，可解離Hollidy連接RuvAB系統(tǒng)具有解離Hollidy連接的活性RuvA

可識別Holliday連接的結(jié)構(gòu)RuvB

是一種ATPase，它可發(fā)動遷移反應RuvC具有內(nèi)切酶活性，可特異識別Hollidy分枝，它在體外可切這個連接體，解離重組中間體大腸桿菌中涉及產(chǎn)生重組DNA的重組基因基因功能RecBCD系192特異位點重組概念：指發(fā)生在一個特定的短DNA序列內(nèi)由特異的酶和輔助因子識別和作用的重組。2特異位點重組20

λ噬菌體DNA進入大腸桿菌后存在溶源(CⅠ占優(yōu)勢)和裂解(Cro占優(yōu)勢)兩條途經(jīng)，二者都要求早期基因的表達。噬菌體的附著位點:attP細菌的附著位點：attBλ噬菌體整合酶：Intλ噬菌體編碼蛋白：Xis細菌的宿主整合因子：IHF◎λ噬菌體DNA的整合與切除λ噬菌體DNA進入大腸桿菌后存在溶源(CⅠ占優(yōu)勢)21◎細菌的特異位點重組

鼠傷寒沙門氏菌H1鞭毛蛋白和H2鞭毛蛋白抗原表達的互變，稱為鞭毛相轉(zhuǎn)變，這種轉(zhuǎn)變是由H片段倒位決定的，此倒位是由于特異重組位點hix發(fā)生重組后引起的。特異重組位點hix發(fā)生重組后，引起H片段倒位，使H2鞭毛蛋白不表達，H1表達?！蚣毦奶禺愇稽c重組鼠傷寒沙門氏菌H1鞭22◎基本概念

轉(zhuǎn)座子（transposon):是在基因組中可移動的一段ＤＮＡ序列。轉(zhuǎn)座：轉(zhuǎn)座子由基因組的一個位置轉(zhuǎn)移到另一個位置的過程叫轉(zhuǎn)座。

轉(zhuǎn)座過程有5大特點：轉(zhuǎn)移、不獨立、與轉(zhuǎn)座基因共存、隨機、引起基因產(chǎn)物改變。3轉(zhuǎn)座子重組(異常重組)◎轉(zhuǎn)座子的分類插入序列IS復合轉(zhuǎn)座子1同源重組2特異位點重組3異常重組◎基本概念轉(zhuǎn)座過程有5大特點：23插入序列(IS)

IS是基因組中可移動遺傳因子家族中的成員之一，它可以整合到宿主非同源位點上，若IS插入到某基因內(nèi)，通常這個基因就會失活。圖23-18

質(zhì)粒上有IS，那么經(jīng)變性和復性后，在電鏡下可以觀察到莖環(huán)結(jié)構(gòu)的存在(引自Griffithsetal1999)IS因子特點

只含有與轉(zhuǎn)座有關(guān)的酶基因，不含抗藥性及其它基因，兩端有15-25bp反向重復序列(IR)。插入序列(IS)圖23-18質(zhì)粒上有IS，那么經(jīng)變性24類插入序列（IS-likeelements）

是指IS10R，IR50R和IS903，它們的結(jié)構(gòu)和IS相似，但不獨立存在。而是作為復合轉(zhuǎn)座子兩臂的組件。表IS的結(jié)構(gòu)和功能

DR(bp)IR(bp)中心區(qū)域(bp)靶的選擇拷貝數(shù)插入序列:

IS1923768隨機5～8IS25411327熱點5(在F因子上為一)IS411~13181428AAN20TTT1或2IS54161195熱點？類插入序列:

IS10R9221329NGCTNAGCN

IS50R991531熱點

IS9039181057隨機

類插入序列（IS-likeelements）25ATGCATACGT987654321123456789987654321123456789987654321123456789987654321123456789ATGCATACGTATGCATACGT反向重復區(qū)靶序列順式重復區(qū)轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座子在靶位置插入前后的結(jié)構(gòu)ATGCA9876543211234567899876526復合型轉(zhuǎn)座子(Tn)

這類轉(zhuǎn)座子中除了轉(zhuǎn)座酶基因外，還有藥物抗性基因，結(jié)構(gòu)較大而復雜，故稱為復合轉(zhuǎn)座子。有Ⅰ和Ⅱ兩種類型。Ⅰ型：兩末端有相同的IS序列，或正向，或反向。Ⅱ型：末端有38bp的反向重復序列。復合型轉(zhuǎn)座子(Tn)Ⅰ型：兩末端有相同的IS序列，或正向，或27

圖兩種不同的轉(zhuǎn)座子含有不同的IR區(qū)域和不同的抗性基因。(a)Tn9含有一個短的IR區(qū)。因兩個IS1元件以相同的方向排列，每個元件都有一個IR序列(b)Tn10含有一個長的IR區(qū)。兩個IS成分方向相反(引自Griffithsetal1999)圖兩種不同的轉(zhuǎn)座子含有不同的IR區(qū)域和不同的抗性基因。28轉(zhuǎn)座因子

長度(bp)遺傳標記

末端組件方向Tn9033100KanRIS903反向Tn92500CamRIS1正向Tn109300TetRIS10R

IS10L反向Tn55700KanRIS50R

IS50L反向表復合轉(zhuǎn)座子的結(jié)構(gòu)

轉(zhuǎn)座因子

長度(bp)遺傳標記末端組件方向Tn90329◎轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座機制自學轉(zhuǎn)座子插入到DNA上新的位點，首先交錯切開靶DNA，再將轉(zhuǎn)座子連接到靶的凸出單鏈上，最后填補空缺完成轉(zhuǎn)座。按在轉(zhuǎn)座過程中是否發(fā)生復制，可以分為：復制型轉(zhuǎn)座非復制型轉(zhuǎn)座◎轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座機制自學復制型轉(zhuǎn)座301979年Shapiro提出了轉(zhuǎn)座模型

這個過程開始是形成單鏈轉(zhuǎn)移復合體[有時也稱為交換復合體]，供體和靶的單鏈連接，這樣轉(zhuǎn)座子的兩個末端分別與靶及供體單鏈相連接。連接轉(zhuǎn)移復合體產(chǎn)生了一個交換形成的結(jié)構(gòu)在雙鏈轉(zhuǎn)座子處結(jié)合在一起，這個交換結(jié)構(gòu)（即共同中間體）決定了轉(zhuǎn)座方式的命運。交換結(jié)構(gòu)的每個交錯末端含有一個單鏈區(qū)。這個區(qū)域是個假的復制叉。它提供了DNA合成的模板。若復制繼續(xù)，那么它的延伸將經(jīng)過轉(zhuǎn)座子，將它的鏈分開，在其末端終止復制，然后由連接酶封閉缺口。這個結(jié)構(gòu)變成了共合體。在轉(zhuǎn)座子與復制子之間的連接處有DR。復制可能由宿主編碼的酶來完成。這個模型解釋了：復制性轉(zhuǎn)座在原來的位置上保留原有的Tn；在新位置上轉(zhuǎn)座子的兩端出現(xiàn)正向重復靶序列；轉(zhuǎn)座過程中出現(xiàn)共合體。1979年Shapiro提出了轉(zhuǎn)座模型這個模型解釋了：31復制型轉(zhuǎn)座

在復制型轉(zhuǎn)座中，整個轉(zhuǎn)座子被復制了，一個拷貝保留在供體的原來部位不變，另一個拷貝即原轉(zhuǎn)座子的拷貝則插入到受體的位點上，供體和受體都有一個轉(zhuǎn)座子的拷貝，所以，通過轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)座子的拷貝數(shù)得到了擴增。轉(zhuǎn)座酶和解離酶在轉(zhuǎn)座過程中分別作用于原始轉(zhuǎn)座子和復制轉(zhuǎn)座子。復制型轉(zhuǎn)座32非復制型轉(zhuǎn)座在非復制型轉(zhuǎn)座中，轉(zhuǎn)座子可以直接地從供體的一個位點轉(zhuǎn)移到受體的新位點處，此類轉(zhuǎn)座子的特點是兩端具有20bp左右的反向重復序列，特異的轉(zhuǎn)座酶附著于此而使轉(zhuǎn)座子切離下來，整合到另一個位點上。供體在切離后留下的缺口被銜接起來，但往往在銜接處的序列發(fā)生改變而產(chǎn)生突變。

非復制型轉(zhuǎn)座33◎轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座的特征☆

轉(zhuǎn)座不依賴靶序列的同源性☆轉(zhuǎn)座后靶序列重復☆轉(zhuǎn)座子的插入具有專一性☆轉(zhuǎn)座具有排他性☆轉(zhuǎn)座具有極性效應☆活化臨近的沉默基因☆區(qū)域性優(yōu)化◎轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座的特征34◎DNA轉(zhuǎn)座引起的遺傳學效應☆可導致突變；☆出現(xiàn)新基因；☆影響插入部位鄰近基因的表達，改變宿主表型；☆引起染色體畸變?！駾NA轉(zhuǎn)座引起的遺傳學效應35

40年代，BarbaraMcClintock，研究發(fā)現(xiàn)：玉米籽粒有色（紅、紫），但有一些籽粒出現(xiàn)花斑及條紋，花斑有大有小。早期有顏色者，花斑大，后期有色者，花斑很小.控制元件，可以在基因組內(nèi)轉(zhuǎn)移，并能改變基因的活性引起功能的改變.◎真核生物的轉(zhuǎn)座子

玉米的控制因子

果蠅的轉(zhuǎn)座元件自學40年代，BarbaraMcClintock，36◆玉米的控制原件

Ac-Ds控制系統(tǒng)Ac(autonomouselement)，即自主控制因子:

含有2個轉(zhuǎn)座酶基因、3個非編碼區(qū)，兩端有11bpIR。Ac可自主轉(zhuǎn)座，能使Ds因子活化，通過Ds控制結(jié)構(gòu)基因的表達。Ds(noautonomouselement),又稱解離因子:

Ac能活化Ds，使其在基因組內(nèi)轉(zhuǎn)座或插入結(jié)構(gòu)基因之內(nèi)。玉米Ds存在能抑制鄰近基因的表達?！粲衩椎目刂圃嗀c-Ds控制系統(tǒng)37CDsCDsAcCDsAcDs顯色基因不顯色顯色AsAcAc-Ds系統(tǒng)對玉米顏色的的控制有色基因C（顯性）可使籽粒有色，C旁Ds抑制了基因C的作用，使籽粒無色；當Ds從C上移走后，C作用恢復，出現(xiàn)顏色；Ds從C上移走的早，花斑就大，反之就??；因此花斑的大小是Ds從C上移走的早晚引起的。Ds的移動還受另一個因子（Ac）的控制，當Ac存在時，Ds可移動，Ac丟失，則Ds不能移動。CDsCDsAcCDsAcDs顯色基因不顯色顯色AsAcAc38作業(yè)1DNA的重組概念﹑類型及意義2簡述Holliday重組模型作業(yè)1DNA的重組概念﹑類型及意義39◆果蠅中的P因子“雜種不育”（hybriddysgenesis）。P型（父本貢獻的，paternalcontributing）M型（母本貢獻的，maternalcontributing）M（♂）×P（♀）后代不育P（♂）×M（♀）后代可育◆果蠅中的P因子40DNA的重組與轉(zhuǎn)座培訓課程課件4187kD轉(zhuǎn)座酶P因子誘發(fā)果蠅雜種不育P品系雄性×M品系雌性→子代生殖細胞發(fā)育不全。87kD轉(zhuǎn)座酶P因子誘發(fā)果蠅雜種不育42表

一些有代表性的真核轉(zhuǎn)座子的屬性物種II類轉(zhuǎn)座因子家族ITRTSDs果蠅PhoboMarinerFB311228大8829線蟲Tc1542玉米Ac/DsSpm/dsomMu/Mn10/1113?200839金魚草Tam1Tam313/141238/5一些真核生物TU/Puppy大8

表一些有代表性的真核轉(zhuǎn)座子的屬性物種II類轉(zhuǎn)ITRTS43第四節(jié)逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子（自學）第四節(jié)逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子（自學）441，名詞解釋：Holliday連接體，位點特異性重組，轉(zhuǎn)座,轉(zhuǎn)座子2，簡述原核同源重組涉及的主要酶系及各自在重組中的功能3，簡述原核生物轉(zhuǎn)座子的分類及各自的結(jié)構(gòu)特點。4，簡述玉米粒色斑現(xiàn)象的產(chǎn)生機制

作業(yè)1，名詞解釋：Holliday連接體，位點特異性重組，轉(zhuǎn)座45演講完畢，謝謝觀看！演講完畢，謝謝觀看！46一節(jié)DNA重組

同源重組特異位點重組二節(jié)DNA轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)座子的概念轉(zhuǎn)座子的分類轉(zhuǎn)座過程發(fā)生和機制轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座的特征真核生物的轉(zhuǎn)座因子第六章DNA的重組與轉(zhuǎn)座一節(jié)DNA重組第六章DNA的重組與轉(zhuǎn)座47

重組和突變是產(chǎn)生遺傳變異的兩大主要因素，但二者的分子機制截然不同：重組是已經(jīng)存在的遺傳信息發(fā)生重排，而突變是改變基因組中的堿基。但二者在分子機制上又是相互影響的。

一概念

DNA分子內(nèi)或分子間發(fā)生遺傳信息的重新組合稱為DNA的重組(遺傳重組或基因重排)。

第一節(jié)DNA的重組重組和突變是產(chǎn)生遺傳變異的兩大主要因素，但二者48

二DNA重組的意義對生物進化起著關(guān)鍵作用。能迅速增加群體的遺傳多樣性(diversity)，使有利突變與不利突變分開，通過優(yōu)化組合積累有意義的遺傳信息；提供修復機制；調(diào)節(jié)基因表達等。二DNA重組的意義49

三重組主要類型

1同源重組2特異位點重組3異常重組

其共同點是雙股DNA間的物質(zhì)交換，但發(fā)生的情況不同。三重組主要類型其共同點是雙股DNA間的物501同源重組

◎發(fā)生在同源序列間的重組稱為同源重組(homologousrecombination)，又稱基本重組。是最基本的DNA重組方式，通過鏈的斷裂和再連接，在兩個DNA分子同源序列間進行單鏈或雙鏈片段的交換。1同源重組51

◎Holliday重組模型

RobinHolliday于1964年提出了重組的雜合DNA模型，又稱Holliday模型。該模型對重組過程的解釋如下：同源的非姐妹染色單體聯(lián)會；同源非姐妹染色單體DNA中兩個方向相同的單鏈，在DNA內(nèi)切酶的作用下，在相同位置同時切開；切開的單鏈交換重接;形成交聯(lián)橋結(jié)構(gòu)；交聯(lián)橋沿配對DNA分子“移動”。兩個親本DNA分子間造成一大段異源雙鏈DNA（Holliday結(jié)構(gòu)）繞交聯(lián)橋旋轉(zhuǎn)180度；形成Holliday異構(gòu)體；通過兩種方式之一切斷DNA單鏈，若左右切，則形成非重組體，若上下切則形成重組體。

◎Holliday重組模型52片段重組體拼接重組體

無論Holliday結(jié)構(gòu)斷裂是否導致旁側(cè)遺傳標記的重組，他們都含有一個異源雙鏈DNA區(qū)。片段重組體拼接重組體無論Holliday結(jié)構(gòu)斷裂是53◎異源雙鏈與基因轉(zhuǎn)變

異源雙鏈DNA：由不同親本雙鏈分子中的互補單鏈產(chǎn)生堿基配對的雙鏈DNA，在遺傳重組中產(chǎn)生?；蜣D(zhuǎn)變：一個基因轉(zhuǎn)變?yōu)樗牡任换虻倪z傳學現(xiàn)象?！虍愒措p鏈與基因轉(zhuǎn)變54

基因轉(zhuǎn)變的實質(zhì)：重組過程中留下的局部異源雙鏈區(qū)，在細胞內(nèi)的修復系統(tǒng)識別下不同的酶切/不酶切產(chǎn)生的結(jié)果。不同的切除會產(chǎn)生不同的結(jié)果?！粱蜣D(zhuǎn)變的實質(zhì)：重組過程中留下的局部異源雙鏈區(qū)，55◎細菌的基因轉(zhuǎn)移與重組機制

細菌接合：指通過細菌細胞的直接接觸，遺傳信息從供體單向轉(zhuǎn)移到受體的過程。致育因子：能夠促使染色體基因轉(zhuǎn)移的接合質(zhì)粒稱為致育因子。簡稱性因子或F因子。

轉(zhuǎn)化(transformation)：指細菌品系吸收了外源DNA(轉(zhuǎn)化因子)而發(fā)生遺傳性狀改變的現(xiàn)象。具有攝取環(huán)境中游離DNA分子能力的細菌稱為感受態(tài)細胞(competentcell)。有些細菌在自然條件下就可成為感受態(tài)；在實驗室也可用高濃度Ca2+誘導細菌成為感受態(tài)?！痢蚣毦幕蜣D(zhuǎn)移與重組機制致育因子：能夠促使染56

轉(zhuǎn)導作用:當病毒從被感染的供體細胞釋放出來﹑再次感染另一細胞時,發(fā)生在供體細胞和受體細胞之間的DNA轉(zhuǎn)移及基因重組.整合

細菌的融合(transduction)：細菌細胞膜融合導致的基因轉(zhuǎn)移和重組叫細胞融合?！赁D(zhuǎn)導作用:當病毒從被感染的供體細胞釋放出來﹑再57

◎同源重組的酶學機制DNA分子之間的交換僅涉及DNA分子重組機制和限制區(qū)域的這一部分，而不是整個染色體。有三種情況:由斷裂分子產(chǎn)生的單鏈與非姊妹染色單體的雙鏈相互作用；單鏈侵入雙鏈異源雙鏈結(jié)構(gòu)的形成。

以上每一步都需要酶的催化◎同源重組的酶學機制由斷裂分子產(chǎn)生的單鏈與非姊妹染色單體的58

Chi位點和RecBCD核酸酶(外切酶)

Chi位點：它由于單個堿基對的改變產(chǎn)生了刺激重組的位點。這一位點是由8個堿基組成的非對稱序列：5′GCTGGTGG3′3′CGACCACC5′●由斷裂分子產(chǎn)生的單鏈與非姊妹染色單體的雙鏈相互作用Chi序列天然存在于大腸桿菌的DNA中,每5-10kb長的序列出現(xiàn)一次.

Chi位點是recBCD編碼的RecBCD核酸酶的靶序列Chi位點和RecBCD核酸酶(外切酶)5′GCTGGTG59RecBCD酶是一種強的核酸酶，可降解DNA，具有解旋酶活性，在SSB存在時它可以解開雙鏈；具有ATPase活性。在重組中的作用是提供帶有游離端的單鏈區(qū)。RecBCD酶60

當RecBCD結(jié)合在DNAChi位點右側(cè)的短裂端時，它沿著DNA移動，使DNA解旋。當?shù)竭_Chi位點3′端4-6pb時它停頓下來，并切開單鏈DNA,產(chǎn)生具有3′端的游離單鏈.引發(fā)異源雙鏈的形成.Chi位點的識別導致RecBCD核酸酶失去的活性，但繼續(xù)發(fā)揮其解旋酶的作用。當RecBCD結(jié)合在DNAChi位點右側(cè)的61RceA蛋白有兩個主要功能：誘發(fā)SOS反應；促進DNA單鏈的同化,即單鏈與同源雙鏈發(fā)生鏈的交換。

RecA能使單鏈DNA取代雙鏈分子中同源的鏈，一般要具備三個條件：①其中一個DNA分子必須要有一個單鏈區(qū)域；②其中一個DNA分子必須要有一個游離的3′末端；③此單鏈區(qū)域和3′末端必須和另一個DNA分子有互補區(qū)?！駟捂溓秩腚p鏈

RecA蛋白與Holliday中間體的形成RceA蛋白有兩個主要功能：RecA能使單62RecA蛋白與單鏈DNA結(jié)合；復合物與同源雙鏈DNA結(jié)合；入侵單鏈與雙鏈中互補鏈配對，同源鏈被轉(zhuǎn)換出來RecA蛋白與單鏈DNA結(jié)合；63

RuvA和RuvB蛋白可促進異源雙鏈結(jié)構(gòu)的形成。RuvA可識別Holliday連接的結(jié)構(gòu),形成一個四面構(gòu)象,促進分支點移動；RuvB是一種解旋酶，它可發(fā)動遷移反應。RuvC將Holliday中間體切開,由DNA聚合酶和連接酶修復合成.●異源雙鏈結(jié)構(gòu)的形成Ruv蛋白和Holliday中間體的拆分RuvA和RuvB蛋白可促進異源雙鏈結(jié)構(gòu)的形成64大腸桿菌中涉及產(chǎn)生重組DNA的重組基因基因功能RecBCD系統(tǒng)具有核酸酶，解旋酶和ATPase活性。在Chi位點產(chǎn)生單鏈3ˊ游離未端RecB,RecC,RecDRecBCD是ATP依賴的外切酶和解旋酶(外切酶V)，它與雙鏈斷口結(jié)合，解開DNA并導入裂口，其傾向性位點稱為chi(參見重組熱點)。RecBCD酶產(chǎn)生RecA可以作用的底物RceA(1)具有蛋白酶活性;(2)在單鏈DNA和ATP存在的條件下RecA能啟動DNA單鏈和與之互補的雙鏈分子進行堿基配對。RceG具有解旋酶活性，可解離Hollidy連接RuvAB系統(tǒng)具有解離Hollidy連接的活性RuvA

可識別Holliday連接的結(jié)構(gòu)RuvB

是一種ATPase，它可發(fā)動遷移反應RuvC具有內(nèi)切酶活性，可特異識別Hollidy分枝，它在體外可切這個連接體，解離重組中間體大腸桿菌中涉及產(chǎn)生重組DNA的重組基因基因功能RecBCD系652特異位點重組概念：指發(fā)生在一個特定的短DNA序列內(nèi)由特異的酶和輔助因子識別和作用的重組。2特異位點重組66

λ噬菌體DNA進入大腸桿菌后存在溶源(CⅠ占優(yōu)勢)和裂解(Cro占優(yōu)勢)兩條途經(jīng)，二者都要求早期基因的表達。噬菌體的附著位點:attP細菌的附著位點：attBλ噬菌體整合酶：Intλ噬菌體編碼蛋白：Xis細菌的宿主整合因子：IHF◎λ噬菌體DNA的整合與切除λ噬菌體DNA進入大腸桿菌后存在溶源(CⅠ占優(yōu)勢)67◎細菌的特異位點重組

鼠傷寒沙門氏菌H1鞭毛蛋白和H2鞭毛蛋白抗原表達的互變，稱為鞭毛相轉(zhuǎn)變，這種轉(zhuǎn)變是由H片段倒位決定的，此倒位是由于特異重組位點hix發(fā)生重組后引起的。特異重組位點hix發(fā)生重組后，引起H片段倒位，使H2鞭毛蛋白不表達，H1表達?！蚣毦奶禺愇稽c重組鼠傷寒沙門氏菌H1鞭68◎基本概念

轉(zhuǎn)座子（transposon):是在基因組中可移動的一段ＤＮＡ序列。轉(zhuǎn)座：轉(zhuǎn)座子由基因組的一個位置轉(zhuǎn)移到另一個位置的過程叫轉(zhuǎn)座。

轉(zhuǎn)座過程有5大特點：轉(zhuǎn)移、不獨立、與轉(zhuǎn)座基因共存、隨機、引起基因產(chǎn)物改變。3轉(zhuǎn)座子重組(異常重組)◎轉(zhuǎn)座子的分類插入序列IS復合轉(zhuǎn)座子1同源重組2特異位點重組3異常重組◎基本概念轉(zhuǎn)座過程有5大特點：69插入序列(IS)

IS是基因組中可移動遺傳因子家族中的成員之一，它可以整合到宿主非同源位點上，若IS插入到某基因內(nèi)，通常這個基因就會失活。圖23-18

質(zhì)粒上有IS，那么經(jīng)變性和復性后，在電鏡下可以觀察到莖環(huán)結(jié)構(gòu)的存在(引自Griffithsetal1999)IS因子特點

只含有與轉(zhuǎn)座有關(guān)的酶基因，不含抗藥性及其它基因，兩端有15-25bp反向重復序列(IR)。插入序列(IS)圖23-18質(zhì)粒上有IS，那么經(jīng)變性70類插入序列（IS-likeelements）

是指IS10R，IR50R和IS903，它們的結(jié)構(gòu)和IS相似，但不獨立存在。而是作為復合轉(zhuǎn)座子兩臂的組件。表IS的結(jié)構(gòu)和功能

DR(bp)IR(bp)中心區(qū)域(bp)靶的選擇拷貝數(shù)插入序列:

IS1923768隨機5～8IS25411327熱點5(在F因子上為一)IS411~13181428AAN20TTT1或2IS54161195熱點？類插入序列:

IS10R9221329NGCTNAGCN

IS50R991531熱點

IS9039181057隨機

類插入序列（IS-likeelements）71ATGCATACGT987654321123456789987654321123456789987654321123456789987654321123456789ATGCATACGTATGCATACGT反向重復區(qū)靶序列順式重復區(qū)轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座子在靶位置插入前后的結(jié)構(gòu)ATGCA9876543211234567899876572復合型轉(zhuǎn)座子(Tn)

這類轉(zhuǎn)座子中除了轉(zhuǎn)座酶基因外，還有藥物抗性基因，結(jié)構(gòu)較大而復雜，故稱為復合轉(zhuǎn)座子。有Ⅰ和Ⅱ兩種類型。Ⅰ型：兩末端有相同的IS序列，或正向，或反向。Ⅱ型：末端有38bp的反向重復序列。復合型轉(zhuǎn)座子(Tn)Ⅰ型：兩末端有相同的IS序列，或正向，或73

圖兩種不同的轉(zhuǎn)座子含有不同的IR區(qū)域和不同的抗性基因。(a)Tn9含有一個短的IR區(qū)。因兩個IS1元件以相同的方向排列，每個元件都有一個IR序列(b)Tn10含有一個長的IR區(qū)。兩個IS成分方向相反(引自Griffithsetal1999)圖兩種不同的轉(zhuǎn)座子含有不同的IR區(qū)域和不同的抗性基因。74轉(zhuǎn)座因子

長度(bp)遺傳標記

末端組件方向Tn9033100KanRIS903反向Tn92500CamRIS1正向Tn109300TetRIS10R

IS10L反向Tn55700KanRIS50R

IS50L反向表復合轉(zhuǎn)座子的結(jié)構(gòu)

轉(zhuǎn)座因子

長度(bp)遺傳標記末端組件方向Tn90375◎轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座機制自學轉(zhuǎn)座子插入到DNA上新的位點，首先交錯切開靶DNA，再將轉(zhuǎn)座子連接到靶的凸出單鏈上，最后填補空缺完成轉(zhuǎn)座。按在轉(zhuǎn)座過程中是否發(fā)生復制，可以分為：復制型轉(zhuǎn)座非復制型轉(zhuǎn)座◎轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座機制自學復制型轉(zhuǎn)座761979年Shapiro提出了轉(zhuǎn)座模型

這個過程開始是形成單鏈轉(zhuǎn)移復合體[有時也稱為交換復合體]，供體和靶的單鏈連接，這樣轉(zhuǎn)座子的兩個末端分別與靶及供體單鏈相連接。連接轉(zhuǎn)移復合體產(chǎn)生了一個交換形成的結(jié)構(gòu)在雙鏈轉(zhuǎn)座子處結(jié)合在一起，這個交換結(jié)構(gòu)（即共同中間體）決定了轉(zhuǎn)座方式的命運。交換結(jié)構(gòu)的每個交錯末端含有一個單鏈區(qū)。這個區(qū)域是個假的復制叉。它提供了DNA合成的模板。若復制繼續(xù)，那么它的延伸將經(jīng)過轉(zhuǎn)座子，將它的鏈分開，在其末端終止復制，然后由連接酶封閉缺口。這個結(jié)構(gòu)變成了共合體。在轉(zhuǎn)座子與復制子之間的連接處有DR。復制可能由宿主編碼的酶來完成。這個模型解釋了：復制性轉(zhuǎn)座在原來的位置上保留原有的Tn；在新位置上轉(zhuǎn)座子的兩端出現(xiàn)正向重復靶序列；轉(zhuǎn)座過程中出現(xiàn)共合體。1979年Shapiro提出了轉(zhuǎn)座模型這個模型解釋了：77復制型轉(zhuǎn)座

在復制型轉(zhuǎn)座中，整個轉(zhuǎn)座子被復制了，一個拷貝保留在供體的原來部位不變，另一個拷貝即原轉(zhuǎn)座子的拷貝則插入到受體的位點上，供體和受體都有一個轉(zhuǎn)座子的拷貝，所以，通過轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)座子的拷貝數(shù)得到了擴增。轉(zhuǎn)座酶和解離酶在轉(zhuǎn)座過程中分別作用于原始轉(zhuǎn)座子和復制轉(zhuǎn)座子。復制型轉(zhuǎn)座78非復制型轉(zhuǎn)座在非復制型轉(zhuǎn)座中，轉(zhuǎn)座子可以直接地從供體的一個位點轉(zhuǎn)移到受體的新位點處，此類轉(zhuǎn)座子的特點是兩端具有20bp左右的反向重復序列，特異的轉(zhuǎn)座酶附著于此而使轉(zhuǎn)座子切離下來，整合到另一個位點上。供體在切離后留下的缺口被銜接起來，但往往在銜接處的序列發(fā)生改變而產(chǎn)生突變。

非復制型轉(zhuǎn)座79◎轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座的特征☆

轉(zhuǎn)座不依賴靶序列