氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量檢測(cè)試劑盒說明書- 可見分光光度法UPLC-MS-4488

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可見分光光度法產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系工作人員。試劑名稱規(guī)格保存條件試劑一液體50mL×1瓶4℃保存試劑二液體170μL×1支4℃保存試劑三液體60mL×1瓶4℃保存試劑四液體8mL×1瓶4℃保存試劑五粉劑×1瓶4℃保存試劑六液體40μL×1瓶4℃保存標(biāo)準(zhǔn)品粉劑10mg×1支4℃保存溶液的配制：1、試劑二：有毒易揮發(fā)試劑，涉及該試劑的步驟建議在通風(fēng)櫥內(nèi)操作。2、試劑五：臨用前加入8mL蒸餾水，溶解后-20℃分裝保存；3EP現(xiàn)用現(xiàn)配；4、標(biāo)準(zhǔn)品：用1mL蒸餾水溶解，濃度為10mg/mL，4℃保存。產(chǎn)品說明：氧化型谷胱甘肽（GSSG）是谷胱甘肽（GSH）的氧化形式，又稱為二硫代谷胱甘肽，是兩分子的谷胱甘肽氧化而成。GSSGGSHGSHGSSGGSH/GSSG二硫代-雙-（2-硝基苯甲酸（5,5’-dithobis-2-nitrobenoicacid，）2-硝基-5-巰基苯甲酸，2-硝基-5-412nm2-GSSGGSH，借此測(cè)定氧化型谷胱甘肽的含量。技術(shù)指標(biāo)：最低檢出限：1.369μg/mL線性范圍：1.5625-50μg/mL注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。需自備的儀器和用品：分析天平、勻漿器/研缽、低溫離心機(jī)、水浴鍋、移液器、可見分光光度計(jì)、1mL玻璃比色皿。操作步驟：一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）組織處理PBS20.1g（勻漿器提前放冰上預(yù)冷1mL試劑一（組織試劑一比例保持不變即可，迅速冰上充分研磨（使用液氮研磨效果更好8000g，4℃10min4℃待測(cè)，若暫時(shí)不能完成測(cè)試可放于-80℃保存（10天。血液處理10104℃待測(cè)，若暫時(shí)不能完成測(cè)試可放于-80℃保存（10天4℃，600g103PBS3次（PBS600g10分鐘4℃108000g10待測(cè)，若暫時(shí)不能完成測(cè)試可放于-80℃保存（10天。細(xì)胞處理500S2次（S重懸細(xì)胞，600g10分鐘1mL試劑2-3（水浴中溶解次，8000g104℃待測(cè)，若暫時(shí)不能完成測(cè)試可放于-80℃保存（10天。二、測(cè)定步驟1、分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至412nm，蒸餾水調(diào)零。2、試劑二放置37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（一般物種）水浴中保溫30min。350μg/mL25μg/mL12.5μg/mL6.25μg/mL3.125μg/mL1.5625μg/mL、0μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品（試劑一十倍稀釋后進(jìn)行稀釋。4、取1.5mL離心管，加入100μL稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品或樣本，加入2μL試劑二，混勻后37℃孵育30分鐘。5、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線孵育完成后標(biāo)準(zhǔn)管（0μg/mL為空白管）700μL試劑三，100μL試劑四，100μL試劑五，10μL試劑六（加入試劑六即開始計(jì)時(shí)412nm30s150s1ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A2-A1。以吸光度（A標(biāo)準(zhǔn)-ΔA空白）為橫坐標(biāo)（x，濃度為縱坐標(biāo)（y）做標(biāo)準(zhǔn)曲線。6700μL100μL100μL10μL（加入試劑六即開始計(jì)時(shí)412nm30s150sA1A2，ΔA測(cè)定=A2-A1。三、GSSG含量計(jì)算根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，將樣本（ΔA測(cè)定-ΔA空白）帶入公式中（x），計(jì)算出樣本濃度y（μg/mL）。按蛋白濃度計(jì)算GSSG（μg/mgprot）=y×V樣÷(V樣×Cpr)=y÷Cpr按樣本質(zhì)量計(jì)算GSSG（μg/g質(zhì)量）=y×V樣÷(V樣÷V樣總×W)=y÷W按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算GSSG（μg/104cell）=y×V樣÷(V樣÷V樣總×細(xì)胞數(shù)量)=y÷細(xì)胞數(shù)量按液體體積計(jì)算GSSG（μg/mL）=2yV樣總：上清液總體積，1mL；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，100μL=0.1mL；W：樣本質(zhì)量，g；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；細(xì)胞數(shù)量：以106為單位計(jì)量；2：血漿（血細(xì)胞）稀釋一倍。注意事項(xiàng)：1、樣本處理需勻漿完全，若當(dāng)天不能完成測(cè)量，可放-80℃保存。2、若不確定樣本中GSSG含量的高低，可稀釋幾個(gè)梯度后再進(jìn)行測(cè)量。3、此方法利用酶促反應(yīng)速率計(jì)算底物濃度，盡量準(zhǔn)確在30秒和15