果蔬中β-1,3-葡聚糖酶活性測(cè)定

果蔬中β-1,3-葡聚糖酶活性測(cè)定一、目的要求了解植物體內(nèi)β-1,3-葡聚糖酶的作用，學(xué)習(xí)果蔬組織中β-1,3-葡聚糖酶活性的測(cè)定原理和方法。二、基本原理葡聚糖是葡萄糖殘基以β-1,3-糖苷鍵連接起來的多聚糖化合物，是絕大多數(shù)真菌細(xì)胞壁的主要成分。植物中的葡聚糖酶能以隨機(jī)作用方式將多聚糖水解成為糊精或寡聚糖，使真菌細(xì)胞壁受到損壞，從而抑制真菌的生長(zhǎng)繁殖和對(duì)植物的侵染能力，特別是在與幾丁質(zhì)酶的協(xié)同作用下，可明顯抑制真菌的生長(zhǎng)。在正常情況下，高等植物體中葡聚糖酶表達(dá)水平很低，而當(dāng)植物體被真菌、細(xì)菌、病毒侵染或受到機(jī)械損傷時(shí)，其含量和活性可提高幾十倍至上百倍，以增強(qiáng)植物體對(duì)不良外界刺激產(chǎn)生抗性反應(yīng)。高等植物體內(nèi)廣泛存在著β-1,3-葡聚糖酶（β-1,3-glucanase）。β-1,3-葡聚糖酶能夠作用于葡聚糖的β-1,3-糖苷鍵，產(chǎn)生還原性末端。因此，利用3,5-二硝基水楊酸（DNS）試劑測(cè)定生成還原糖的量，可以用來表示β-1,3-葡聚糖酶活性。三、材料、儀器及試劑（一）材料梨、番茄、芒果、香蕉等。（二）儀器及用具研缽、高速冷凍離心機(jī)、分光光度計(jì)、計(jì)時(shí)器、移液器、離心管、水浴鍋、具塞刻度試管（25mL）、容量瓶（100mL、1000mL）。（三）試劑1．100mmol/L、pH5.2醋酸緩沖液母液A（200mmol/L醋酸溶液）：量取11.55mL冰醋酸，加蒸餾水稀釋至1000mL。母液B（200mmol/L醋酸鈉溶液）：稱取16.4g無水醋酸鈉（或稱取27.2g三水合乙酸鈉），用蒸餾水溶解后定容至1000mL。取105mL母液A和395mL母液B混合后，調(diào)節(jié)pH至5.2，稀釋至1000mL，即為100mmol/L、pH5.2醋酸緩沖液。2．提取緩沖液稱取29mgEDTA，0.1gL-抗壞血酸，吸取35μLβ-巰基乙醇，加入到100mmol/L、pH5.2醋酸緩沖液中，定容至100mL，搖溶，即得提取緩沖液（含1mmol/LEDTA、5mmol/Lβ-巰基乙醇和0.1%(w/v)L-抗壞血酸），低溫（4℃）貯藏備用。3．0.4%昆布多糖溶液稱取100mg昆布多糖（Sigma）加到25mL100mmol/L、pH5.2醋酸緩沖液中，溶解后低溫（4℃）貯藏備用。4．3,5-二硝基水楊酸（DNS）試劑（1）配制500mL含有185g酒石酸鉀鈉的熱水溶液；（2）配制262mL的2mol/LNaOH溶液；（3）稱取6.3g的3,5-二硝基水楊酸；（4）稱取5.0g結(jié)晶酚；（5）稱取5.0g亞硫酸鈉；（6）將（2）、（3）、（4）、（5）各成分加入到（1）中，攪拌，使之溶解。待冷卻后，轉(zhuǎn)入到1000mL容量瓶中，并用蒸餾水定容至刻度，貯于棕色瓶中備用。蓋緊瓶塞，勿使CO2進(jìn)入。若溶液混濁可過濾后使用。5．1mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液準(zhǔn)確稱取100mg分析純葡萄糖（預(yù)先在80℃烘至恒重），置于小燒杯中，用少量蒸餾水溶解后，轉(zhuǎn)移到100mL的容量瓶中，以蒸餾水定容至刻度，搖勻，冰箱中保存?zhèn)溆?。四、?shí)驗(yàn)步驟（一）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取7支具塞刻度試管，編號(hào)，按表23所示的量，精確加入濃度為1mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液和3,5-二硝基水楊酸試劑。表23.繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的試劑量項(xiàng)目管號(hào)0123456葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液/mL00.20.40.60.81.01.2蒸餾水/mL2.01.81.61.41.21.00.83,5-二硝基水楊酸試劑/mL1.51.51.51.51.51.51.5相當(dāng)于葡萄糖量/mg00.20.40.60.81.01.2將各管搖勻，在沸水浴中加熱5min，取出后立即放入盛有冷水的燒杯中冷卻至室溫，再用蒸餾水稀釋至25mL刻度處，混勻。在540nm波長(zhǎng)下，用0號(hào)管做為參比調(diào)零，測(cè)定顯色液的吸光度值。以吸光度值為縱坐標(biāo)，葡萄糖毫克數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得線性回歸方程。（二）酶液提取、制備稱取10.0g果蔬組織樣品，置于研缽中，加入10mL經(jīng)預(yù)冷的提取緩沖液，在冰浴條件下研磨成勻漿。將勻漿液全部轉(zhuǎn)入到離心管中，于4℃、12000×g離心30min，收集上清液，低溫保存?zhèn)溆?。并按照幾丁質(zhì)酶測(cè)定方法中酶液制備方法，進(jìn)行酶液的脫鹽處理。（四）活性測(cè)定取兩支反應(yīng)管，分別加入100μL0.4%的昆布多糖溶液。然后，向一支管中加入100μL酶液，向另一支管中加入100μL經(jīng)煮沸5min的酶液作為對(duì)照，混勻。將反應(yīng)管置于37℃保溫40min。保溫后向反應(yīng)管中加入1.8mL蒸餾水和1.5mLDNS試劑，在沸水浴中加熱3min。再用蒸餾水將顯色的反應(yīng)液稀釋至25mL，混勻。測(cè)定混合液在540nm處吸光度值。重復(fù)三次。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與計(jì)算1．將測(cè)定的數(shù)據(jù)填入下列表重復(fù)次數(shù)樣品重量W(g)提取液體積V(mL)吸取樣品液體積Vs(mL)540nm吸光度值由標(biāo)曲查得葡萄糖胺的量C(mg)樣品中β-1,3-葡聚糖酶活性(1×10-9mol·s-1·g-1FW)ODCODSODS-ODC計(jì)算值平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差123注：ODS表示樣品管反應(yīng)液的吸光度值，ODC表示空白管反應(yīng)液的吸光度值。2．計(jì)算結(jié)果根據(jù)樣品管反應(yīng)液和對(duì)照管反應(yīng)液的吸光度值的差值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的葡萄糖毫克數(shù)，以每秒鐘每克鮮重樣品中酶分解昆布多糖產(chǎn)生1×10-9mol葡萄糖為一個(gè)β-1,3-葡聚糖酶活性單位（U），U=1×10-9mol·s-1·g-1FW。計(jì)算公式：式中：C——從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的葡萄糖量，mg；V——樣品提取液總體積，mL；Vs——測(cè)定時(shí)所取樣品提取液體積，mL；t——酶促反應(yīng)時(shí)間，h；W——樣品重量，g；180——葡萄糖相對(duì)分子質(zhì)量。也可以每秒鐘分解昆布多糖產(chǎn)生1×10-9mol葡萄糖所需酶量為一