谷物和飼料中賴氨酸的測定(染料結(jié)合賴氨酸法一DBL法)

谷物和飼料中賴氨酸的測定（染料結(jié)合賴氨酸法—DBL法）賴氨酸是一種必須的氨基酸。缺乏賴氨酸，人與動物不僅不能正常發(fā)育，還會引起某些疾病。在絕大多數(shù)谷物中，賴氨酸是最缺乏的氨基酸，被稱為“第一限制氨基酸”。它在谷物貯存、加工過程中，又很不穩(wěn)定，易于脫去氨基、被氧化或是發(fā)生變質(zhì)而損失破壞，或變成營養(yǎng)上的“無效”。因此賴氨酸的實際含量已成為衡量谷物、飼料蛋白質(zhì)的重要指標。測定賴氨酸的方法很多，屬于化學的方法有2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS法）、1-氟-2，4-二硝基苯法（FDNB法）3）、2-氯-3，5-二硝基吡啶法（CNPY法）等。這些方法共同缺點是操作手續(xù)繁長費時，還需要某些特殊的試劑，不適用于成批樣品的分析。離子交換色譜法（氨基酸自動分析儀法）仍被認為是標準法，但儀器昂貴不能普及?，F(xiàn)介紹在國內(nèi)外應用較廣泛的、簡便易行的賴氨酸測定法。方法原理染料結(jié)合法可用于測定樣品中蛋白質(zhì)的堿性氨基酸，包括賴氨酸、精氨酸和組氨酸。如果先將樣品用丙酸酐處理，丙酸酐便將賴氨酸的-NH2的?；诒?，使其失去了和染料結(jié)合的能力。其反應如下∶然后分別測定?；昂蟮腄BC值。?；暗臏y定值為賴氨酸+組氨酸+精氨酸。而?；笾皇墙M氨酸+精氨酸，以上兩項測定結(jié)果的差值，就可計算出賴氨酸的含量。主要儀器：萬分之一天平、水平振蕩器、離心機、GXD-201型蛋白質(zhì)分析儀或721型分光光度計。試劑（1）磷酸鹽緩沖溶液。稱取KH2PO4（分析純）3.40g，H2C2O4·2H2O（分析純）20.0g，分別溶于水中，定量地轉(zhuǎn)入1000mL容量瓶中。然后再加入H3PO4（850gL-1，分析純）1.7mL，冰醋酸60mL和丙酸（分析純）1mL，用水定容。（2）染料溶液。稱取酸性橙12°1.363g，用磷酸鹽緩沖液溶解并稀釋至1000mL。此溶液的濃度為3.89mmol·L~1，染料的來源和純度不同，須對染料的濃度進行校正。（3）半飽和醋酸鈉溶液。取一定量的無水NaOAc或NaOAc·3H2O（分析純），先配成飽和溶液，再用等體積水稀釋為半飽和溶液。（4）丙酸酐（化學純）。操作步驟（1）繪制標準曲線。在樣品分析的同時，分別吸取3.89mmol·L染料溶液28.3、30.9、33.4、36.0、14.6、41.1、43.7、46.3、48.9mL置于100mL容量瓶中，用磷酸鹽緩沖液或水定容，即得濃度為1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9mmol·L-1的染料工作溶液。吸取各工作液20.00mL分別加入半飽和NaOAc溶液2.00mL及磷酸鹽緩沖液0.20mL，充分混勻，在GXD-201型蛋白質(zhì)分析儀上測定透光率T值。在半對數(shù)坐標紙上，以透光率為縱坐標，染料濃度為橫坐標，繪制工作曲線（也可以用磷酸鹽溶液稀釋50倍后，用0.5cm比色杯和482mm波長，以721型分光光度計測吸收值A，用普通直線坐標紙繪制工作曲線）。（2）樣品的測定。按表14-5稱取已粉碎過60目篩?；筒货；瘶悠犯鲀煞荩ㄗⅲ瑴蚀_至0.4mg。分別加入30～35mL具塞玻璃的或聚四氟乙烯的試管中，標明為A、B管（?；瘶悠罚┖虲、D管（不?；瘶悠罚?。同時應另稱樣品測定水分含量。丙?；磻?。各管分別加入160g·L~乙酸鈉溶液2.00mL（秈稻加80g·L-1乙酸鈉溶液），然后加丙酸酐0.20mL于A、B管中，加緩沖溶液0.20mL于C、D管中。蓋緊塞子，置于往復振蕩機上振蕩10min。染料結(jié)合反應。向A、B、C、D管中各加入3.89mmol·L二染料溶液20.00mL，蓋緊塞子，放置振蕩機上振蕩1h（秈稻、豆類2h，油料種子2h或更長），使染料結(jié)合反應達到平衡。離心。將以上反應液在3000～4000r-min-'下離心10min。測定。在GXD-201型蛋白質(zhì)分析儀上測透光率T值或721型分光光度計上測吸收值A值【同上操作步驟（1）】。結(jié)果計算由測得透光率T或吸收值A，在標準曲線上查得或由回歸線計算得到的剩余染料溶液的濃度（mmol·L-'），樣品中的賴氨酸的濃度按下公式計算∶注釋注1.殘余染料濃度的大小對測定結(jié)果有影響。在染料結(jié)合反應中，當染料溶液的濃度和體積一定時，反應后殘余染料的濃度決定于樣品中堿性氨基酸的含量及樣品稱樣量。因此要調(diào)節(jié)稱樣量，使染料結(jié)合反應后殘余染料的濃度在1.2～1.8mmol·L·|的范圍內(nèi)。而且為了獲得可比較的結(jié)果，消除各種影響因素的干擾，加入丙酸酐（樣品A、B）及未加入丙酸酐（樣品C、D）的兩份樣品的