生物技術(shù)制藥專業(yè)課件

生物技術(shù)制藥生物技術(shù)制藥第一章現(xiàn)代生物技術(shù)一、現(xiàn)代生物技術(shù)的定義與主要內(nèi)容生物技術(shù)(BiotechnologyorBioengineering）:

對生物有機體（微生物至高等動、植物）或其組成部分（器官、組織、細胞或細胞器等），運用分子生物學(xué)、細胞生物學(xué)、生物化學(xué)、生物物理學(xué)、生物信息學(xué)等手段，研究、設(shè)計、改造，以改良生物乃至創(chuàng)造新的生物品種的一種技術(shù)體系。第一章現(xiàn)代生物技術(shù)一、現(xiàn)代生物技術(shù)的定義與主要內(nèi)容生物技術(shù)現(xiàn)代生物技術(shù)包括四個方面：（1）基因工程：生物遺傳物質(zhì)——核酸的分離、提取、體外剪切、拼接重組以及擴增與表達等技術(shù)。（2）細胞工程：細胞（也包括器官或組織）的離體培養(yǎng)、繁殖、再生、融合及細胞核、細胞質(zhì)及染色體與細胞器（如線粒體、葉綠體等）的移植與改建等操作技術(shù)。現(xiàn)代生物技術(shù)包括四個方面：（1）基因工程：生物遺傳物質(zhì)——核（3）酶工程：利用酶，借助固定化、生物反應(yīng)器和生物傳感器等新技術(shù)、新裝置，高效優(yōu)質(zhì)地生產(chǎn)特定產(chǎn)品的技術(shù)。（4）發(fā)酵工程（微生物工程）：給微生物提供最適宜的發(fā)酵條件以生產(chǎn)特定產(chǎn)品的技術(shù)。（3）酶工程：利用酶，借助固定化、生物反應(yīng)器和生物傳感器等新

生物技術(shù)的依據(jù)和出發(fā)點：生物有機體的種種機能，是生物在生長、發(fā)育與繁殖過程中進行物質(zhì)合成、降解和轉(zhuǎn)化的能力（即利用其新陳代謝的能力），反應(yīng)器、代謝反應(yīng)、酶、特定的遺傳基因核心基礎(chǔ)：基因工程和細胞工程“工程菌株”或“工程細胞株”

使酶工程或發(fā)酵工程生產(chǎn)出更多、更好的產(chǎn)品，發(fā)揮出更大的經(jīng)濟效益。酶工程和發(fā)酵工程

現(xiàn)代生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化，特別是發(fā)展大規(guī)模生產(chǎn)的最關(guān)鍵環(huán)節(jié)。生物技術(shù)的依據(jù)和出發(fā)點：生物有機體的種種機能，是生物二、現(xiàn)代生物技術(shù)的優(yōu)越性（一）不可取代性植物品種改良雜交育種基因工程改良品種基因資源的來源可不受限制牛(豬)

生長激素基因魚

生長、發(fā)育快，體重速增

人血紅蛋白基因豬體內(nèi)

生產(chǎn)人的血紅蛋白，分離，可作為人血液的替代物。

生長激素釋放抑制因子（抑制生長激素不合時宜的分泌，“肢端肥大癥”的特效藥）

50萬個羊腦

5mg樣品，化學(xué)法300多美元/5mg

基因工程7.5升大腸桿菌發(fā)酵5mg,成本幾十美分。二、現(xiàn)代生物技術(shù)的優(yōu)越性（一）不可取代性生長激素（二）快速、精確試劑盒有效的早期診斷（遺傳病、病毒引起的疾病和癌癥等）。McAb檢查婦女妊娠比用抗血清法檢查提高了靈敏度，懷孕后8天得知，準確率100％（二）快速、精確McAb檢查婦女妊娠（三）低耗、高效“酶”催化化學(xué)效應(yīng)，無需高溫、高壓和強酸堿等→大大降低能耗的成本、能耗。例：L-蘋果酸生產(chǎn)（生物技術(shù)）產(chǎn)氨短桿菌→收集菌體→固定化細胞→→L-蘋果酸原理：延胡索酸→

L-蘋果酸成本比化學(xué)合成降低幾十倍。人生長激素（治療侏儒?。┮粋€患者每年需用量

50個死人的垂體中提取基因工程生產(chǎn)價格為1／4提取，不需依賴死人腦。

（三）低耗、高效人生長激素（治療侏儒病）（四）副產(chǎn)物少、不良反應(yīng)小、安全性好疫苗的生產(chǎn)常規(guī)方法用血液，成本高，可帶來病毒感染的危險性?，F(xiàn)代生物技術(shù)用大腸桿菌如乙肝疫苗，凝血因子等→大大改進使用的安全性。（四）副產(chǎn)物少、不良反應(yīng)小、安全性好2.“生物導(dǎo)彈”

McAb接抗癌藥物→體內(nèi)McAb只與該腫瘤細胞特異性結(jié)合→抗癌藥物專一、靶向到腫瘤細胞小鼠的免疫球蛋白

McAb免疫球蛋白分子中含有人免疫球蛋白分子片段三、現(xiàn)代生物技術(shù)在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用（—）在疾病診斷與治療中的應(yīng)用1.單克隆抗體與疾病診斷妊娠試驗

FDA批準上市的McAb產(chǎn)品

已有幾十種。2.“生物導(dǎo)彈”三、現(xiàn)代生物技術(shù)在醫(yī)3.基因診斷

核酸分子雜交技術(shù)

80年代中期聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction,PCR）體外擴增基因的方法產(chǎn)前和癥狀前基因診斷:苯丙酮尿癥、珠蛋白合成障礙性貧血、假肥大型肌營養(yǎng)不良、甲型血友病、乙型血友病、成年型多囊腎、慢性進行性舞蹈病等遺傳病4.基因治療因單一結(jié)構(gòu)基因即編碼蛋白質(zhì)的基因缺陷所引起的遺傳病。治療:導(dǎo)入正?；颉Ｕ毕莼蛞鸬腄NA代謝異常及細胞突變→使之恢復(fù)正常功能。3.基因診斷4.基因治療因單一結(jié)構(gòu)基因即編碼蛋白質(zhì)（二）未來醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域中的生物技術(shù)展望轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)的“轉(zhuǎn)基因藥物”

1978年把人tPA基因轉(zhuǎn)入小鼠受精卵發(fā)育成轉(zhuǎn)基因小鼠并證明在其乳汁中能得到tPA

美國DNx公司的“制藥工廠”轉(zhuǎn)基因豬環(huán)球基因藥物公司轉(zhuǎn)基因奶?；蛎腹?/p>

轉(zhuǎn)基因山羊英國藥物蛋白公司

轉(zhuǎn)基因綿羊“轉(zhuǎn)基因藥物”與基因工程藥物相比,

產(chǎn)量高，成本低,具有與人體自身產(chǎn)生的蛋白相同的生物學(xué)活性。乳腺細胞能進行一系列的翻譯后修飾作用，包括糖基化作用等，正確地產(chǎn)生人體蛋白。（二）未來醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域中的生物技術(shù)展望2.人型McAb(monoclonalantibody)的制備技術(shù)路線：

鼠型McAb分子中更換一段人抗體分子中與抗原結(jié)合的鏈段（用蛋白質(zhì)工程的方法）；

從人鼠雜交瘤細胞中直接克隆人抗體基因，并使之在細菌中得到表達；

將人免疫球蛋白重鏈C區(qū)基因轉(zhuǎn)入小鼠受精卵，發(fā)育成轉(zhuǎn)基因小鼠，用特定抗原免疫→得人型化McAb。3.基因治療“基因打靶”技術(shù)將外源基因定點整合到細胞基因組的某一確定位點上，因而能對缺陷基因進行原位修復(fù)。2.人型McAb(monoclonalantibody)聚合酶鏈反應(yīng)及其他不斷涌現(xiàn)的分子生物學(xué)新技術(shù)將得到廣泛應(yīng)用。在細菌、酵母菌、昆蟲細胞、哺乳動物細胞等不同的細胞內(nèi)能得到高效表達的載體將不斷地構(gòu)建成功，大幅提高基因工程的生產(chǎn)效率。生物技術(shù)后處理工程和蛋白質(zhì)工程將迅速發(fā)展有目的地修飾、改造乃至重新組建4.生物技術(shù)的各個環(huán)節(jié)聚合酶鏈反應(yīng)及其他不斷涌現(xiàn)的分子生物學(xué)新技術(shù)在細菌、酵母菌、第一節(jié)生物藥物(biopharmaceutics)一、概念利用生物體及其成分綜合利用生物學(xué)、生物化學(xué)、微生物學(xué)、生物組織免疫學(xué)、物理化學(xué)、藥學(xué)原理、方法加工制造的預(yù)防診斷疾病的制品治療第二章生物藥物與生物技術(shù)藥物概述第一節(jié)生物藥物(biopharmaceutics)第二（一）按來源和制造方法1.動物來源動物臟器資源豐富家畜：豬、馬、牛、羊家禽：雞、鴨海洋生物：海帶、鯊魚、海蛇二、分類（一）按來源和制造方法二、分類2.微生物來源發(fā)酵法優(yōu)點：1）微生物及其代謝物資源豐富、開發(fā)潛力大2）培養(yǎng)、繁殖快、產(chǎn)量高、成本低，便于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)，不受原料、運輸、保存、季節(jié)和資源供應(yīng)影響3）生產(chǎn)的生物藥物可綜合利用代謝物和菌絲體;誘變選育良種;加入前體培養(yǎng)法4）體內(nèi)酶的轉(zhuǎn)化作用，使復(fù)雜、難反應(yīng)能專一、迅速

2.微生物來源發(fā)酵法4.化學(xué)合成氨基酸、多肽、核酸降解物及其衍生物、維生素、激素結(jié)構(gòu)改造以高效，長效和高專一性3.植物來源植物中的蛋白質(zhì)、多糖、脂類、核酸等生物大分子的研究和利用4.化學(xué)合成3.植物來源5.現(xiàn)代生物技術(shù)產(chǎn)品基因工程技術(shù)生產(chǎn)的重組活性多肽活性蛋白質(zhì)類基因工程疫苗

McAb

多種細胞生長因子利用轉(zhuǎn)基因動、植物生產(chǎn)的生物藥物利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)改造天然蛋白質(zhì)創(chuàng)造自然界沒有的而功能上更優(yōu)良的蛋白質(zhì)類生物藥物5.現(xiàn)代生物技術(shù)產(chǎn)品生物技術(shù)藥物（基因工程藥物，BiotechDrugs）:以DNA重組技術(shù)（包括基因工程技術(shù)、蛋白質(zhì)工程技術(shù)）生產(chǎn)的蛋白質(zhì)、多肽、酶、激素、疫苗、單克隆抗體和細胞生長因子類藥物。細胞因子干擾素類：IFN-、IFN-β和IFN-。

IFN-有

lb，

2a，

2b等2.細胞因子白介素類和腫瘤壞死因子類：IL-2和突變型白介素-2；TNF-和TNF受體。二、生物技術(shù)藥物的主要類型第二節(jié)生物技術(shù)藥物一、概念生物技術(shù)藥物（基因工程藥物，BiotechDrugs）:以3.造血系統(tǒng)生長因子類：粒細胞集落刺激因子（G-CSF）、巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）、巨噬細胞粒細胞集落刺激因子（GM-CSF）、紅細胞生成素（EPO）、促血小板生成素（TPO)、干細胞生長因子（SCF）等。4.生長因子類：促進細胞生長、組織再生和創(chuàng)傷治療。胰島素樣生長因子（ICF）、表皮生長因子（ECF）、血小板衍生生長因子（PDGF）、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-與TGF-β）、神經(jīng)生長因子（NGF）及各種神經(jīng)營養(yǎng)因子。5.重組蛋白質(zhì)與多肽類激素：人重組胰島素（Humulin）、人生長激素（rhGH）、促卵泡激素（FSH）、促黃體生成素（LH）、絨毛膜促性腺激素（HCG）等。3.造血系統(tǒng)生長因子類：4.生長因子類：促進細胞生長、組6.心血管病治療劑與酶制劑：心血管疾病和抗腫瘤治療Ⅶ因子、水蛭素、組織纖溶酶原激活劑（tPA）、尿激酶、鏈激酶、葡激酶、門冬酰胺酶、超氧化物歧化酶（SOD）、葡萄糖腦苷酶及DNase等。7.重組疫苗與單抗制品：重組乙肝表面抗原疫苗（酵母）、乙肝基因疫苗（重組乙肝表面抗原疫苗、CHO細胞）、艾滋病疫苗和腫瘤疫苗等。己開發(fā)的McAb有72種，多用于治療難治性疾病如預(yù)防移植物急性排斥、免疫性疾病和腫瘤等。6.心血管病治療劑與酶制劑：7.重組疫苗與單抗制品：8.基因藥物：應(yīng)用于基因治療目的的DNA片段重組藥物?；蛑委?將外源基因?qū)霗C體以達到治療疾病目的。遺傳性疾病、腫瘤、艾滋病、囊性纖維變性、糖尿病和心血管病等。

我國已批準上市品：IFN-1b（自研），IFN-2a，IFN-2b，IFN-，IL-2，IL-2－125Ser，G-CSF，GM-CSF，SK，EPO，EGF，ECF衍生物，b-ECF，胰島素，GH，TPO，TNF衍生物，抗IL-8單抗乳膏劑，胸苷激酶基因工程細胞制劑，乙肝疫苗，痢疾疫苗等。8.基因藥物：我國已批準上市品：IFN-細胞:生物有機體形態(tài)結(jié)構(gòu)和生命活動的基本單位。第三章細胞工程技術(shù)概念細胞工程：以細胞作為研究對象，運用細胞生物學(xué)、分子生物學(xué)等學(xué)科的原理與方法，按照人們的意志設(shè)計改造細胞的某些遺傳性狀，培育出新的生物改良品種或通過細胞培養(yǎng)獲得自然界中難以獲得的珍貴產(chǎn)品的新興生物技術(shù)細胞培養(yǎng)、細胞融合、細胞重組和遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移等細胞:生物有機體形態(tài)結(jié)構(gòu)和生命活動的基本單位。第三章細胞第一節(jié)細胞培養(yǎng)技術(shù)細胞培養(yǎng)：生物體內(nèi)某一塊組織，用酶消化法分散成單個細胞，接種至特定的培養(yǎng)容器中并給予必要的生長條件，使其在體外生長繁殖的技術(shù)。細胞生長所需的培養(yǎng)條件：1.足夠的營養(yǎng)，糖、氨基酸、維生素、無機鹽等；2.生長環(huán)境，合適的溫度、pH值、無菌條件。第一節(jié)細胞培養(yǎng)技術(shù)細胞培養(yǎng)：生物體內(nèi)某一塊組織，用酶消化法動物細胞的培養(yǎng)：先在無菌條件下用消化酶將組織分散成單個細胞，用培養(yǎng)基制成細胞懸液，使其在體外合適的條件下生長繁殖的技術(shù)。一、動物細胞培養(yǎng)細胞培養(yǎng)的對象單個的細胞，組織培養(yǎng)的對象組織塊（0.5～1mm），器官培養(yǎng)的對象器官的一部分或整個器官。動物細胞的培養(yǎng)：先在無菌條件下用消化酶將組織分散成單個細胞，動物細胞分類：（－）動物細胞培養(yǎng)特征貼壁依賴性細胞貼壁大多數(shù)動物細胞非貼壁依賴性細胞懸浮血液淋巴細胞、腫瘤細胞、雜交瘤細胞、轉(zhuǎn)化細胞系兼性貼壁細胞附壁或懸浮動物細胞分類：（－）動物細胞培養(yǎng)特征貼壁依賴性細胞1.原代培養(yǎng)（or初次培養(yǎng)，primaryculture）胚胎或出生后幾天幼齡動物的臟器獲取組織，剪成小塊長寬1mm、厚約0.5mm，胰酶消化分散，稀釋成2×105～7×105／ml，分裝到培養(yǎng)瓶（板）于37℃CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。原代培養(yǎng)的細胞特點：離體時間短，一般具二倍體遺傳性狀，能較好地反映在體內(nèi)的生長狀況

適合用作藥物測試和細胞分化的研究工具。（二）動物細胞培養(yǎng)技術(shù)1.原代培養(yǎng)（or初次培養(yǎng)，primaryculture）2．傳代培養(yǎng)（或繼代培養(yǎng)，subculture）將細胞懸液轉(zhuǎn)接分裝到≥兩個瓶中培養(yǎng)傳代培養(yǎng)。

分裂次數(shù)：正常細胞有限一般人正常細胞可傳代50～60次有限細胞系（finitecellline），傳代過程中可無限制生長繁殖的細胞系連續(xù)細胞系（continuouscellline）或已確立的細胞系腫瘤細胞2．傳代培養(yǎng)（或繼代培養(yǎng)，subculture）分裂次數(shù)（三）動物細胞培養(yǎng)的營養(yǎng)條件1.培養(yǎng)基1）天然培養(yǎng)基成分復(fù)雜、來源有限血清、水解乳蛋白、膠原、胚胎浸液等。

主含蛋白質(zhì)、氨基酸、葡萄糖、激素、其他對維持細胞生長繁殖和保持細胞生物學(xué)活性不可缺少的未知因子，促進細胞貼壁、中和有毒物質(zhì)以保護細胞。動物血清：缺點：來源困難，成分不確定，使得細胞生長過程不易檢測控制。（三）動物細胞培養(yǎng)的營養(yǎng)條件1.培養(yǎng)基水解乳蛋白乳白蛋白的水解產(chǎn)物膠原動物真皮（豚鼠、牛）或大鼠尾腱來源的組織提取物

胚胎浸液雞胚和牛胚水解乳蛋白乳白蛋白的水解產(chǎn)物膠原特點：一定化學(xué)組成主要組分：氨基酸、維生素、糖、無機鹽、其他一些輔助因子。2.合成培養(yǎng)基根據(jù)天然培養(yǎng)基的成分，人工設(shè)計模擬合成RPMI-1640、DMEM、TC199、Eagle’sMEM等。只能維持細胞的生存(基礎(chǔ)培養(yǎng)基)

須補充部分天然培養(yǎng)基，血清一般為10％～20%。特點：一定化學(xué)組成2.合成培養(yǎng)基根據(jù)天然培養(yǎng)基的成分，人①維持細胞生長所需的激素和生長因子胰島素、生長激素、表皮生長因子、成纖維細胞生長因子②細胞貼壁或鋪展所需的細胞因子，纖維粘連素、鋪展因子、胎球蛋白等；血清在培養(yǎng)液中的主要作用：提供③識別維生素、脂類、激素和金屬的結(jié)合蛋白，調(diào)節(jié)被結(jié)合物的活力白蛋白與維生素、脂類、激素結(jié)合，將它們載入細胞轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合并傳遞鐵離子，結(jié)合蛋白與有毒金屬或熱原結(jié)合則可解除它們的毒性；④細胞生長所需的脂肪酸與微量元素磷脂質(zhì)、膽固醇、前列腺素等，銅、鋅等；①維持細胞生長所需的激素和生長因子血清在培養(yǎng)液中的主要作用：⑤蛋白酶抑制劑，使胰蛋白酶失活，保護細胞不受傷害；⑥起緩沖作用，保證培養(yǎng)液pH的穩(wěn)定。不足：成分復(fù)雜，含已知或未知成分，研究激素、細胞因子及藥物的作用時，干擾分析；產(chǎn)品生產(chǎn)增加細胞培養(yǎng)后產(chǎn)物提取的難度，或影響產(chǎn)品的質(zhì)量；大規(guī)模培養(yǎng)成本過高。⑤蛋白酶抑制劑，使胰蛋白酶失活，保護細胞不受傷害；不足：①消除因不同批次血清之間的差異而造成的實驗誤差，保證實驗結(jié)果的準確性與穩(wěn)定性；②減少血清中可能存在的支原體、病毒所造成的污染；3.無血清培養(yǎng)基優(yōu)點與含有血清的培養(yǎng)基相比③產(chǎn)品的分離純化更加容易，簡化鑒定細胞工程產(chǎn)品的程序；④來源穩(wěn)定，供應(yīng)充足。①消除因不同批次血清之間的差異而造成的實驗誤差，保證實驗結(jié)果無血清培養(yǎng)基組成：基礎(chǔ)培養(yǎng)基+替代血清作用的補充成分。1．激素和生長因子：激素胰島素、胰高血糖素、生長激素等多肽激素及孕酮、氫化可的松、雌二醇等甾體類激素。胰島素調(diào)節(jié)和控制細胞內(nèi)多種代謝途徑，加強糖原、蛋白質(zhì)、甘油三酯及DNA的合成。生長因子表皮生長因子、神經(jīng)生長因子、成纖維生長因子、血小板生長因子等。補充成分種類：無血清培養(yǎng)基組成：1．激素和生長因子：補充成分種類：2.結(jié)合蛋白：轉(zhuǎn)鐵蛋白增強細胞攝取和利用培養(yǎng)液中鐵的能力，可結(jié)合有毒金屬離子解除其毒性；白蛋白與脂類、金屬離子、激素等結(jié)合后可以增強其作用，刺激細胞增殖。3.貼壁和鋪展因子：常用的貼壁因子有纖維連結(jié)素、多聚賴氨酸、膠原，血清鋪展因子則是一種糖蛋白。 4.低分子量營養(yǎng)因子和元素：主要有維生素A、抗壞血酸、-生育酚、硒等2.結(jié)合蛋白：3.貼壁和鋪展因子：4.低分子量營養(yǎng)因子和元（四）動物細胞培養(yǎng)的環(huán)境條件培養(yǎng)基，培養(yǎng)環(huán)境無毒無菌；合適的溫度、濕度、氣體環(huán)境和pH值。1.培養(yǎng)環(huán)境無毒無菌：動物細胞體內(nèi)強大免疫系統(tǒng)，清除和抵抗病原體→免受侵害

體外培養(yǎng)失去抵御能力保證環(huán)境的無毒無菌(首要條件)

加雙抗液青霉素、鏈霉素以抑制可能存在的細菌和霉菌的生長（四）動物細胞培養(yǎng)的環(huán)境條件1.培養(yǎng)環(huán)境無毒無菌：2．溫度哺乳動物細胞35～37℃，動物細胞耐低溫能力強于耐高溫能力，

＞41℃

細胞嚴重受損，

＜4℃細胞也能存活數(shù)日。培養(yǎng)物+保護劑[二甲亞砜（DMSO）或甘油]-80℃或液氮罐（溫度可降至-196℃）可長期保存。3．滲透壓：哺乳動物細胞260～320mOsm／kg

滲透壓可略低培養(yǎng)過程中水分蒸發(fā)滲透壓↑2．溫度哺乳動物細胞35～37℃，3．滲透壓：4．氣體環(huán)境與pH：一般為95％的空氣+5%CO2，

O2

參與三羧酸循環(huán)，產(chǎn)生能量供給細胞生長，

CO2

細胞生長所必需的成分，細胞的代謝產(chǎn)物，維持培養(yǎng)液的pH。大多數(shù)細胞生長的適宜pH是7.2～7.4NaHCO3

細胞培養(yǎng)過程中不斷釋放出CO2，使培養(yǎng)液變酸，添加一定量的NaHCO3碳酸鹽緩沖系統(tǒng)維持培養(yǎng)液pH值相對穩(wěn)定4．氣體環(huán)境與pH：NaHCO3（五）動物細胞種質(zhì)保存與運輸超低溫冰凍方法長期保存細胞凍存液中加入保護劑DMSO或甘油，將細胞密封保存于-80℃或-196℃的液氮罐中。1.保護劑甘油或DMSO，速滲透入胞內(nèi)結(jié)合H2O，降低冰點，延緩凍結(jié)過程，同時增加胞膜對水的通透性，使H2O在凍結(jié)前緩慢透出胞外，減少胞內(nèi)冰晶，降低因冰晶形成而造成的胞損傷。使用濃度甘油5％～20％，DMSO5％～10％。影響細胞凍存質(zhì)量的因素：（五）動物細胞種質(zhì)保存與運輸1.保護劑甘油或DMSO，影響DMSO

與甘油相比，作用更快，膜通透性更強，抗凍傷能力也更強，細胞在DMSO中30秒即可達到細胞內(nèi)外平衡（甘油需2h）實驗室普遍采用。2.細胞懸液的凍存速度:降低凍存速度使冰晶盡量在胞外形成，減少胞內(nèi)冰晶的形成→降低對細胞的傷害。先緩降至一定溫度，如-30℃，使胞外凍結(jié)，胞內(nèi)脫水，再迅速降溫。3.凍存后用液氮超低溫保藏-150℃～-196℃，細胞所有理化活動均降至最低限度，或忽略不計長期儲存。DMSO與甘油相比，作用更快，膜通透性更強，抗凍傷能4.細胞復(fù)蘇時的融化速度。細胞凍存管,取出迅速升溫→胞外結(jié)晶在短時間內(nèi)融化避免因緩慢融化而使水分滲入胞內(nèi)再次形成冰晶對細胞造成的傷害。操作：取出后立即投入到37～38℃水浴。4.細胞復(fù)蘇時的融化速度。大規(guī)模培養(yǎng)：在人工條件下高密度大量培養(yǎng)特定的動物細胞從而生產(chǎn)珍貴醫(yī)藥產(chǎn)品的技術(shù)是實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)的關(guān)鍵技術(shù)。產(chǎn)品：疫苗、激素、細胞因子、單克隆抗體等。（六）動物細胞的大規(guī)模培養(yǎng)大規(guī)模培養(yǎng)：在人工條件下高密度大量培養(yǎng)特定的動物細胞從而生產(chǎn)1.培養(yǎng)基與實驗室培養(yǎng)基基本一致（除用無血清培養(yǎng)基外）。無血清培養(yǎng)基中難生長細胞→采用漸適法馴化細胞→使適應(yīng)于在無血清培養(yǎng)基中生長。*無血清培養(yǎng)液中易出現(xiàn)細胞毒（與水中的微量元素或有機物污染有關(guān)）→制備培養(yǎng)液須用高純水，經(jīng)0.22m的微孔濾膜過濾除菌。1.培養(yǎng)基培養(yǎng)方法：懸浮培養(yǎng)，貼壁培養(yǎng)，貼壁-懸浮培養(yǎng)。（1）懸浮培養(yǎng)非貼壁依賴性細胞和兼性貼壁細胞氣升式生物反應(yīng)器或通氣攪拌式反應(yīng)器動物細胞胞膜薄，嬌嫩易碎，抗剪切能力弱氣升式反應(yīng)器工作原理：通過氣體的上下循環(huán)起到供氧以及攪拌的效果。培養(yǎng)規(guī)模5L、30L、100L到1000L2．動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)系統(tǒng)而微生物可用攪拌式發(fā)酵罐培養(yǎng)方法：懸浮培養(yǎng)，貼壁培養(yǎng)，貼壁-懸浮培養(yǎng)。2．動物細胞大（2）貼壁培養(yǎng)（單層細胞培養(yǎng)）貼壁依賴性細胞和兼性貼壁細胞轉(zhuǎn)瓶（滾瓶）培養(yǎng)培養(yǎng)瓶旋轉(zhuǎn)使吸附在瓶壁上的細胞交替與培養(yǎng)液及空氣接觸而增加細胞吸附面積。優(yōu)點：普遍適用于大多數(shù)細胞的培養(yǎng)，規(guī)模較易放大，容易實現(xiàn)罐流培養(yǎng)(及時放出陳舊培養(yǎng)液，補加新鮮培養(yǎng)液)。缺點：操作較為繁瑣，傳代或放大時需要用蛋白酶將其從瓶壁上消化下來。（2）貼壁培養(yǎng)（單層細胞培養(yǎng)）（3）微載體培養(yǎng)

基本原理：將細胞附著在微載體的表面，后置于培養(yǎng)液中懸浮培養(yǎng)，使細胞在載體表面單層生長繁殖。商品微粒:DEAE-交聯(lián)葡聚糖、二甲氨丙基聚丙烯酰胺（Biocarrier）及聚苯乙烯（Biosilon）等市售。優(yōu)點：①細胞附著表面積增大；②細胞生長環(huán)境均一，條件易于控制；③取樣及細胞計數(shù)簡單；④細胞與培養(yǎng)液易于分離；⑤大規(guī)模培養(yǎng)只需對微生物發(fā)酵罐或氣升式深層培養(yǎng)系統(tǒng)稍加改進即可；⑥適合于培養(yǎng)原代細胞、二倍體細胞株以及基因重組細胞。（3）微載體培養(yǎng)（4）固定化包埋培養(yǎng)與微囊培養(yǎng)固定化包埋培養(yǎng)(大載體培養(yǎng))

用高分子材料將細胞包埋并制成固定化顆粒，在培養(yǎng)液中培養(yǎng)。海藻酸鈣包埋:

細胞溶液與海藻酸鈉溶液混合，通過噴珠裝置將其噴入氯化鈣溶液→直徑約2.6mm固定化顆粒，去除氯化鈣溶液，通入培養(yǎng)液培養(yǎng)。海藻酸鈉分子中含有重復(fù)排列的葡糖醛酸和甘露糖酸與鈣離子作用后形成網(wǎng)絡(luò)狀凝膠珠，而將細胞包埋于其中。（4）固定化包埋培養(yǎng)與微囊培養(yǎng)微囊培養(yǎng)：細胞包被在薄的半透性膜中

采用海藻酸鈉包埋細胞制成固定化凝膠顆粒，再用長鏈氨基酸聚合物、多聚賴氨酸包被形成堅韌、多孔可通透的外膜。液化膠化小珠，使其成膠的物質(zhì)從多孔膜流出，活細胞或生物活性物質(zhì)留在多孔外膜內(nèi)，置氣升式培養(yǎng)系統(tǒng)中進行增殖。微囊培養(yǎng)：（5）中空纖維培養(yǎng)數(shù)千根中空纖維封存于特制的圓筒里，組成一個中空纖維培養(yǎng)系統(tǒng)。

“內(nèi)室”

→灌流無血清培養(yǎng)液供細胞生長；

“外室”

→細胞貼附于管壁上，吸取從“內(nèi)室”滲透出來的養(yǎng)分，迅速生長繁殖。單抗等細胞分泌的大分子量物質(zhì)只能留在外室，且不斷被濃縮。收集產(chǎn)物打開“外室”總出口代謝廢物為小分子物質(zhì)，滲進內(nèi)室，從其出口流出，不對外室細胞產(chǎn)生毒害（5）中空纖維培養(yǎng)代謝廢物為小分子物質(zhì)，滲進內(nèi)室優(yōu)點：①培養(yǎng)器體積小，細胞密度高；②產(chǎn)物濃度高、純度高；③自動化程度高，細胞生長周期長。缺點：價格較貴。（5）中空纖維培養(yǎng)優(yōu)點：（5）中空纖維培養(yǎng)第二節(jié)細胞融合

離體條件下用人工將兩或多個不同種的細胞通過無性方式融合成一個雜合細胞的過程融合后的細胞含兩或多個不同的細胞核（異核體），隨后細胞的有絲分裂中，有些不同胞核的染色體合并到一個核中→單核雜種細胞，而不能形成單核的融合細胞在培養(yǎng)過程中逐步死亡。細胞融合(體細胞雜交):法國Barski1960年過程：細胞在促融因子的作用下發(fā)生凝集現(xiàn)象，胞間質(zhì)膜粘連，細胞融合，在培養(yǎng)過程中核融合雜種細胞。第二節(jié)細胞融合離體條件下用人工將兩或多1）細胞的準備貼壁培養(yǎng)的細胞，兩親本細胞混合培養(yǎng)懸浮細胞制成一定濃度的懸液；2）誘導(dǎo)融合需要添加促融劑誘導(dǎo)融合；一、動物細胞融合小鼠和田鼠，小鼠和小雞，小鼠和人遠緣和超遠緣的體細胞雜交。1、動物細胞融合的基本過程3）雜種細胞的選擇利用選擇性培養(yǎng)基，使親本細胞死亡而讓雜種細胞存活；4）雜種細胞克隆選擇與純化雜種細胞，再經(jīng)培養(yǎng)得所需要的無性繁殖系。1）細胞的準備貼壁培養(yǎng)的細胞，兩親本細胞混合培養(yǎng)一2.促融劑（1）病毒：仙臺病毒(滅活)

兩種不同動物細胞混合物中存在大劑量病毒,即細胞周圍布滿病毒，病毒或其組分在細胞間起粘連作用使細胞聚集成團→不同胞膜蛋白及膜脂質(zhì)分子重新排布而結(jié)合成一個整體。誘導(dǎo)細胞融合的關(guān)鍵使細胞膜蛋白重新分布膜中脂質(zhì)分子重排2.促融劑（1）病毒：仙臺病毒(滅活)誘導(dǎo)細胞融合的關(guān)鍵使（2）PEG誘導(dǎo)：當不同種屬動物細胞混合液中存在PEG時即產(chǎn)生細胞凝集作用，在稀釋和除去PEG的過程中即產(chǎn)生融合現(xiàn)象。原理：脫水作用→細胞凝集，使膜結(jié)構(gòu)變化，改變膜表面電荷或膜電位→膜蛋白顆粒聚集及脂層分子重排所致。特點：使用簡便、結(jié)果穩(wěn)定、誘導(dǎo)融合率較高等選用：分子量1000～4000，濃度30%～50％（2）PEG誘導(dǎo)：當不同種屬動物細胞混合液中存在PEG時即產(chǎn)（3）電場脈沖：將兩種細胞混合液經(jīng)10～100V／cm低強度非均勻交變電場作用，極化成偶極子而相互吸引緊密接觸排列成串，此時對該狀態(tài)的細胞施加瞬時高強度電脈沖，一般擊穿電壓為0.5～10kV／cm，作用時間為30～50s，細胞之間形成穩(wěn)定的膜連接（可逆性電擊穿），不同細胞間膜脂質(zhì)分子重排而合并成一個雙核或多核細胞。融合率高，可控性好。（3）電場脈沖：3.雜種細胞的篩選融合后細胞（五種）異型融合細胞（雙核和多核）、兩種同型融合細胞（雙核和多核）、未發(fā)生融合的兩種親本細胞。（1）篩選原理篩選目的：獲遺傳性狀比親本細胞更優(yōu)良的雜種細胞。篩選原理：在培養(yǎng)過程中利用選擇性培養(yǎng)基，殺死四種類型細胞。3.雜種細胞的篩選（1）篩選原理（2）選擇系統(tǒng)常用：HAT選擇系統(tǒng)、抗藥性選擇系統(tǒng)及營養(yǎng)缺陷型選擇系統(tǒng)。HAT選擇系統(tǒng)：含一定數(shù)量次黃嘌呤（H）、氨基蝶呤（A）、胸腺嘧啶核苷（T）的選擇性培養(yǎng)基。

DNA為絕大多數(shù)生物的遺傳物質(zhì)。嘌呤核苷及嘧啶核苷是DNA的重要組成部分，是細胞生長的必需成分。（2）選擇系統(tǒng)HAT選擇系統(tǒng)：補救合成途徑：細胞從培養(yǎng)液或自身的代謝產(chǎn)物中吸收游離的嘌呤或嘧啶合成DNA。正常細胞中DNA合成途徑全合成途徑：細胞利用簡單的外源性小分子物質(zhì)的從頭合成途徑；補救合成途徑：細胞從培養(yǎng)液或自身的代謝產(chǎn)物中吸收游離的嘌呤或圖細胞中DNA合成途徑圖細胞中DNA合成途徑次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶缺陷型（HPRT-）細胞嘧啶全合成+補救合成嘌呤全合成胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）細胞嘌呤全合成+補救合成嘧啶全合成常用的親本細胞：酶缺陷型細胞不能分裂的淋巴細胞。HPRT-及TK-細胞無嘌呤或嘧啶的補救合成途徑全合成需甲基（胞中由二氫葉酸還原酶作用而生）DNA合成的兩條途徑均受抑制，親本細胞（HPRT-及TK-）在培養(yǎng)過程中死亡。含氨基蝶呤的培養(yǎng)基次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶缺陷型（HPRT-）細胞常用的親細胞融合物在HAT培養(yǎng)基上的選擇結(jié)果圖細胞融合物在HAT培養(yǎng)基上的選擇結(jié)果圖同一藥物對不同種類細胞的作用差異。一種親本細胞對A藥物敏感，而對B藥物不敏感；另一種親本細胞對B藥物敏感，而對A藥物不敏感。一定量A、B于培養(yǎng)液中培養(yǎng)細胞兩種親本細胞被殺死，融合細胞存活，抗藥性選擇系統(tǒng)：同一藥物對不同種類細胞的作用差異。抗藥性選擇系統(tǒng)：營養(yǎng)缺陷型篩選：有些細胞在一些營養(yǎng)物（如氨基酸、糖、嘌嶺、嘧啶或維生素等）的合成能力上出現(xiàn)缺陷→難在缺少這種營養(yǎng)成分的培養(yǎng)基中存活（該營養(yǎng)的營養(yǎng)缺陷型細胞）。親本細胞色氨酸缺陷型，蘇氨酸缺陷型，選擇性培養(yǎng)基中不加入色氨酸和蘇氨酸只有融合所形成的雜種細胞才能生長。營養(yǎng)缺陷型篩選：有些細胞在一些營養(yǎng)物（如氨基酸、糖、嘌嶺、嘧4.雜種細胞的表型雜種細胞（與親本細胞相比）在遺傳表型上變化：１）互補作用：兩親本細胞的某些生物學(xué)特性在雜種細胞中共同表達的現(xiàn)象。免疫淋巴細胞分泌抗體，體外培養(yǎng)不能生長；小鼠骨髓瘤細胞體外生長。雜種細胞既體外生長又分泌特定的抗體。4.雜種細胞的表型１）互補作用：兩親本細胞的某些生物學(xué)特性２）激活作用：某一親本細胞的不活動基因在雜種細胞中被激活的現(xiàn)象。HPRT-及HPRT+人的細胞分別與HPRT-小鼠細胞雜交，兩種雜種細胞均顯示出正常小鼠的HPRT酶活性，人的細胞具有激活小鼠細胞HPRT基因的作用。２）激活作用：某一親本細胞的不活動基因在雜種細胞中被激活的現(xiàn)３）消失作用：親本的某一或某些性狀在雜種細胞中消失的現(xiàn)象。金黃色倉鼠黑色素瘤細胞很高的多巴氧化酶活性，可催化酪氨酸形成黑色素，但與不產(chǎn)生黑色素的小鼠成纖維細胞融合的雜種細胞不產(chǎn)生黑色素表明多巴氧化酶基因在雜種細胞中被抑制而呈隱性。３）消失作用：親本的某一或某些性狀在雜種細胞中消失的現(xiàn)象。金４）激活與消失作用：雜種細胞中出現(xiàn)的同一親本細胞的某一些非活動基因被激活，而另一些遺傳性狀同時消失的現(xiàn)象。小鼠胚胎發(fā)育早期的胸腺細胞能表達t12抗原，但成年后不表達t12抗原而表達H-2抗原，說明其帶有t12和H-2兩種抗原的基因，但在不同的發(fā)育階段不同的基因之間表達存在差異。當成年小鼠的胸腺細胞與小鼠胚胎性癌細胞融合所形成的雜種細胞中，H-2抗原基因呈隱性，而t12抗原基因呈顯性。４）激活與消失作用：雜種細胞中出現(xiàn)的同一親本細胞的某一些非活兩種親本細胞的遺傳物質(zhì)融合在一個細胞中后，某些遺傳物質(zhì)經(jīng)過一段時間后可能會逐漸消失，其結(jié)果是由該基因所控制的性狀也就隨之消失。遺傳物質(zhì)雖然存在，但在雜種細胞中可以表現(xiàn)出其基因性狀（顯性），也可能不表現(xiàn)出其基因性狀（隱性）。兩種親本細胞的遺傳物質(zhì)融合在一個細胞中后，某些遺傳物質(zhì)經(jīng)過一細胞重組：在體外條件下運用一定的實驗技術(shù)從活細胞中分離出各種細胞的結(jié)構(gòu)或組成“部件”，再把它們在不同的細胞之間重新進行裝配，而得到新的生物活性細胞。第三節(jié)細胞重組（celleconstruction）一、核移植技術(shù)（nucleartransplantation）借助顯微操作儀，利用微吸管將一個細胞的細胞核吸出并移植到另一個去核的細胞中。最初魚類和兩棲類動物后擴展到高等哺乳動物小鼠和家養(yǎng)動物等細胞重組：在體外條件下運用一定的實驗技術(shù)從活細胞中分離出各種二、細胞器移植細胞器種類很多，分離與純化也較容易，不過研究較多的是葉綠體和線粒體的移植。（一）葉綠體移植：葉綠體進行光合作用，把太陽能轉(zhuǎn)變?yōu)榛瘜W(xué)能。

高光合效率作物的葉綠體轉(zhuǎn)移到低光合效率作物中增產(chǎn)。葉綠體移植的方法：將分離純化的葉綠體與原生質(zhì)體一道培養(yǎng)，通過細胞的胞飲作用將葉綠體攝入原生質(zhì)體，經(jīng)過培養(yǎng)，原生質(zhì)體再發(fā)育成完整的植株二、細胞器移植（一）葉綠體移植：葉綠體移植的方法：（二）線粒體移植：線粒體有自己的遺傳基因，能夠合成一些蛋白質(zhì)。線粒體的移植，可傳遞遺傳信息，改變受體細胞的某些特征，如抗藥性和雄性不育性等。

移植方法：微注射、載體轉(zhuǎn)移、胞飲攝入等。（二）線粒體移植：移植方法：微注射、載體轉(zhuǎn)移、胞飲第四節(jié)單克隆抗體技術(shù)外源性物質(zhì)侵入人體或動物體時免疫反應(yīng)。即，B淋巴細胞激活、增殖、分化成漿細胞抗體（體液免疫）（血清、體液、外分泌液）。獲得一定特異性抗體的經(jīng)典方法：

用抗原免疫動物（如兔、馬、羊、鼠等），從其血清中進行分離。

多個抗原表位（決定簇）針對多種抗原表位的混合抗體（多克隆抗體）。第四節(jié)單克隆抗體技術(shù)外源性物質(zhì)侵入人體或動物體時缺陷：

1、抗體不均一，特異性差，效價低，用于檢測會影響檢測的精確性和靈敏度；

2、成熟的能分泌抗體的淋巴細胞壽命很短，一般只有幾天，抗體的產(chǎn)量有限，無法實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。缺陷：骨髓瘤（惡性腫瘤）細胞體外培養(yǎng)、無限制繁殖，但不能產(chǎn)生抗體，遺傳表現(xiàn)型HPRT+-TK+、HPRT+-TK-

及HPRT--TK+免疫淋巴細胞產(chǎn)生抗體，但不能在體外長期培養(yǎng)和無限期繁殖，遺傳表現(xiàn)型HPRT+-TK+。雜種細胞產(chǎn)生抗體、體外長期培養(yǎng)、無限期繁殖（雜交瘤技術(shù)，雜交瘤細胞）雜交瘤細胞株經(jīng)體外培養(yǎng)分泌成分單克隆抗體（McAb）一、單克隆抗體及其特性骨髓瘤（惡性腫瘤）細胞一、單克隆抗體及其特性二、單克隆抗體的制備過程第一步用抗原免疫動物（如鼠）。第二步脾細胞與骨髓瘤細胞融合。第三步雜交瘤細胞的篩選與克隆化。第四步單克隆抗體的大規(guī)模生產(chǎn)。體外法轉(zhuǎn)瓶或生物反應(yīng)器對雜交瘤細胞大規(guī)模培養(yǎng)并表達相應(yīng)的單抗體內(nèi)法動物體內(nèi)培養(yǎng)雜交瘤細胞生產(chǎn)單抗二、單克隆抗體的制備過程第一步用McAb制備圖McAb制備圖①高純度單一抗體，在氨基酸序列及特異性方面均為一致，檢測靈敏度極高；②可通過對雜交瘤細胞的大規(guī)模培養(yǎng)進行生產(chǎn)；McAb優(yōu)點：（與常規(guī)抗體相比）③雜交瘤細胞可用液氮深凍法進行長期保存；④可在分子水平上解析存在于病毒表面的抗原或受體；⑤可用不純的抗原制備純的McAb。①高純度單一抗體，在氨基酸序列及特異性方面均為一致，檢測靈敏缺點：①McAb特異性太強，有時不能檢出微生物突變株；②有時不能產(chǎn)生與抗原交聯(lián)的功能；③易受pH、溫度、鹽濃度影響，或親和力較低、半衰期短；⑤制備程序復(fù)雜、工作量大。缺點：③易受pH、溫度、鹽濃度影響，或親和力較低、半衰期短；１．疾病的診斷與治療。純度高、特異性強、易于大規(guī)模生產(chǎn)的特點，用于臨床疾病診斷敏感性高、特異性強、檢測結(jié)果重復(fù)性好，血清學(xué)檢測取代常規(guī)的多克隆抗體免疫學(xué)診斷。已生產(chǎn)抗激素、抗病毒、抗細菌、抗寄生蟲、抗腫瘤相關(guān)抗原等單克隆抗體，體內(nèi)激素或藥物等微量物質(zhì)的測定、傳染病與腫瘤的診斷等三、單克隆抗體的應(yīng)用１．疾病的診斷與治療。純度高、特異性強、易于大規(guī)模生產(chǎn)的特點疾病的治療癌癥的治療結(jié)直腸癌、淋巴癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、黑色素瘤、白血病、前列腺癌、胰腺癌等，治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、A型糖尿病的單抗。與各種毒素（如白喉外毒素、篦麻毒素）、放射性元素或藥物（如氨基蝶呤、阿霉素等）化學(xué)偶聯(lián)制備成靶向性藥物（targettingdrug）腫瘤的治療２、用于生物活性蛋白的分離與純化。目的蛋白的單抗交聯(lián)到溴化氰活化的層析介質(zhì)（如Sepharose）上，制成親和層析吸附劑疾病的治療癌癥的治療２、用于生物活性蛋白的分離與純1．什么叫動物細胞工程？包括哪些內(nèi)容？2．動物細胞培養(yǎng)基分為哪幾種類型？各有何特點？3．何謂動物細胞的原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng)？各有何特點？4．如何控制動物細胞懸液的凍存速度？5．如何控制動物細胞培養(yǎng)時的氣體環(huán)境與pH的穩(wěn)定?6．動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)有哪些方法？各有何特點？7．氣升式生物反應(yīng)器的工作原理是什么？8．敘述血清在細胞培養(yǎng)中的作用及其不足。9.與含有血清的培養(yǎng)基相比，無血清培養(yǎng)基有哪些優(yōu)點？10.簡述無血清培養(yǎng)基的組成。1．什么叫動物細胞工程？包括哪些內(nèi)容？11.微載體培養(yǎng)細胞法有哪些優(yōu)點？12.中空纖維培養(yǎng)細胞有哪些優(yōu)點？

13.淋巴細胞雜交瘤的形成原理是什么？簡述其制備路線。14.什么叫單克隆抗體（McAb）？有哪些基本特征？15.什么叫細胞融合？其促融劑主要有哪些？16.敘述無血清培養(yǎng)基需補充的成分及其作用。17.轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)細胞法有哪些優(yōu)點？11.微載體培養(yǎng)細胞法有哪些優(yōu)點？單克隆抗體制備流程圖單克隆抗體制備流程圖生物技術(shù)制藥生物技術(shù)制藥第一章現(xiàn)代生物技術(shù)一、現(xiàn)代生物技術(shù)的定義與主要內(nèi)容生物技術(shù)(BiotechnologyorBioengineering）:

對生物有機體（微生物至高等動、植物）或其組成部分（器官、組織、細胞或細胞器等），運用分子生物學(xué)、細胞生物學(xué)、生物化學(xué)、生物物理學(xué)、生物信息學(xué)等手段，研究、設(shè)計、改造，以改良生物乃至創(chuàng)造新的生物品種的一種技術(shù)體系。第一章現(xiàn)代生物技術(shù)一、現(xiàn)代生物技術(shù)的定義與主要內(nèi)容生物技術(shù)現(xiàn)代生物技術(shù)包括四個方面：（1）基因工程：生物遺傳物質(zhì)——核酸的分離、提取、體外剪切、拼接重組以及擴增與表達等技術(shù)。（2）細胞工程：細胞（也包括器官或組織）的離體培養(yǎng)、繁殖、再生、融合及細胞核、細胞質(zhì)及染色體與細胞器（如線粒體、葉綠體等）的移植與改建等操作技術(shù)?，F(xiàn)代生物技術(shù)包括四個方面：（1）基因工程：生物遺傳物質(zhì)——核（3）酶工程：利用酶，借助固定化、生物反應(yīng)器和生物傳感器等新技術(shù)、新裝置，高效優(yōu)質(zhì)地生產(chǎn)特定產(chǎn)品的技術(shù)。（4）發(fā)酵工程（微生物工程）：給微生物提供最適宜的發(fā)酵條件以生產(chǎn)特定產(chǎn)品的技術(shù)。（3）酶工程：利用酶，借助固定化、生物反應(yīng)器和生物傳感器等新

生物技術(shù)的依據(jù)和出發(fā)點：生物有機體的種種機能，是生物在生長、發(fā)育與繁殖過程中進行物質(zhì)合成、降解和轉(zhuǎn)化的能力（即利用其新陳代謝的能力），反應(yīng)器、代謝反應(yīng)、酶、特定的遺傳基因核心基礎(chǔ)：基因工程和細胞工程“工程菌株”或“工程細胞株”

使酶工程或發(fā)酵工程生產(chǎn)出更多、更好的產(chǎn)品，發(fā)揮出更大的經(jīng)濟效益。酶工程和發(fā)酵工程

現(xiàn)代生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化，特別是發(fā)展大規(guī)模生產(chǎn)的最關(guān)鍵環(huán)節(jié)。生物技術(shù)的依據(jù)和出發(fā)點：生物有機體的種種機能，是生物二、現(xiàn)代生物技術(shù)的優(yōu)越性（一）不可取代性植物品種改良雜交育種基因工程改良品種基因資源的來源可不受限制牛(豬)

生長激素基因魚

生長、發(fā)育快，體重速增

人血紅蛋白基因豬體內(nèi)

生產(chǎn)人的血紅蛋白，分離，可作為人血液的替代物。

生長激素釋放抑制因子（抑制生長激素不合時宜的分泌，“肢端肥大癥”的特效藥）

50萬個羊腦

5mg樣品，化學(xué)法300多美元/5mg

基因工程7.5升大腸桿菌發(fā)酵5mg,成本幾十美分。二、現(xiàn)代生物技術(shù)的優(yōu)越性（一）不可取代性生長激素（二）快速、精確試劑盒有效的早期診斷（遺傳病、病毒引起的疾病和癌癥等）。McAb檢查婦女妊娠比用抗血清法檢查提高了靈敏度，懷孕后8天得知，準確率100％（二）快速、精確McAb檢查婦女妊娠（三）低耗、高效“酶”催化化學(xué)效應(yīng)，無需高溫、高壓和強酸堿等→大大降低能耗的成本、能耗。例：L-蘋果酸生產(chǎn)（生物技術(shù)）產(chǎn)氨短桿菌→收集菌體→固定化細胞→→L-蘋果酸原理：延胡索酸→

L-蘋果酸成本比化學(xué)合成降低幾十倍。人生長激素（治療侏儒?。┮粋€患者每年需用量

50個死人的垂體中提取基因工程生產(chǎn)價格為1／4提取，不需依賴死人腦。

（三）低耗、高效人生長激素（治療侏儒病）（四）副產(chǎn)物少、不良反應(yīng)小、安全性好疫苗的生產(chǎn)常規(guī)方法用血液，成本高，可帶來病毒感染的危險性?，F(xiàn)代生物技術(shù)用大腸桿菌如乙肝疫苗，凝血因子等→大大改進使用的安全性。（四）副產(chǎn)物少、不良反應(yīng)小、安全性好2.“生物導(dǎo)彈”

McAb接抗癌藥物→體內(nèi)McAb只與該腫瘤細胞特異性結(jié)合→抗癌藥物專一、靶向到腫瘤細胞小鼠的免疫球蛋白

McAb免疫球蛋白分子中含有人免疫球蛋白分子片段三、現(xiàn)代生物技術(shù)在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用（—）在疾病診斷與治療中的應(yīng)用1.單克隆抗體與疾病診斷妊娠試驗

FDA批準上市的McAb產(chǎn)品

已有幾十種。2.“生物導(dǎo)彈”三、現(xiàn)代生物技術(shù)在醫(yī)3.基因診斷

核酸分子雜交技術(shù)

80年代中期聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction,PCR）體外擴增基因的方法產(chǎn)前和癥狀前基因診斷:苯丙酮尿癥、珠蛋白合成障礙性貧血、假肥大型肌營養(yǎng)不良、甲型血友病、乙型血友病、成年型多囊腎、慢性進行性舞蹈病等遺傳病4.基因治療因單一結(jié)構(gòu)基因即編碼蛋白質(zhì)的基因缺陷所引起的遺傳病。治療:導(dǎo)入正?；颉Ｕ毕莼蛞鸬腄NA代謝異常及細胞突變→使之恢復(fù)正常功能。3.基因診斷4.基因治療因單一結(jié)構(gòu)基因即編碼蛋白質(zhì)（二）未來醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域中的生物技術(shù)展望轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)的“轉(zhuǎn)基因藥物”

1978年把人tPA基因轉(zhuǎn)入小鼠受精卵發(fā)育成轉(zhuǎn)基因小鼠并證明在其乳汁中能得到tPA

美國DNx公司的“制藥工廠”轉(zhuǎn)基因豬環(huán)球基因藥物公司轉(zhuǎn)基因奶?；蛎腹?/p>

轉(zhuǎn)基因山羊英國藥物蛋白公司

轉(zhuǎn)基因綿羊“轉(zhuǎn)基因藥物”與基因工程藥物相比,

產(chǎn)量高，成本低,具有與人體自身產(chǎn)生的蛋白相同的生物學(xué)活性。乳腺細胞能進行一系列的翻譯后修飾作用，包括糖基化作用等，正確地產(chǎn)生人體蛋白。（二）未來醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域中的生物技術(shù)展望2.人型McAb(monoclonalantibody)的制備技術(shù)路線：

鼠型McAb分子中更換一段人抗體分子中與抗原結(jié)合的鏈段（用蛋白質(zhì)工程的方法）；

從人鼠雜交瘤細胞中直接克隆人抗體基因，并使之在細菌中得到表達；

將人免疫球蛋白重鏈C區(qū)基因轉(zhuǎn)入小鼠受精卵，發(fā)育成轉(zhuǎn)基因小鼠，用特定抗原免疫→得人型化McAb。3.基因治療“基因打靶”技術(shù)將外源基因定點整合到細胞基因組的某一確定位點上，因而能對缺陷基因進行原位修復(fù)。2.人型McAb(monoclonalantibody)聚合酶鏈反應(yīng)及其他不斷涌現(xiàn)的分子生物學(xué)新技術(shù)將得到廣泛應(yīng)用。在細菌、酵母菌、昆蟲細胞、哺乳動物細胞等不同的細胞內(nèi)能得到高效表達的載體將不斷地構(gòu)建成功，大幅提高基因工程的生產(chǎn)效率。生物技術(shù)后處理工程和蛋白質(zhì)工程將迅速發(fā)展有目的地修飾、改造乃至重新組建4.生物技術(shù)的各個環(huán)節(jié)聚合酶鏈反應(yīng)及其他不斷涌現(xiàn)的分子生物學(xué)新技術(shù)在細菌、酵母菌、第一節(jié)生物藥物(biopharmaceutics)一、概念利用生物體及其成分綜合利用生物學(xué)、生物化學(xué)、微生物學(xué)、生物組織免疫學(xué)、物理化學(xué)、藥學(xué)原理、方法加工制造的預(yù)防診斷疾病的制品治療第二章生物藥物與生物技術(shù)藥物概述第一節(jié)生物藥物(biopharmaceutics)第二（一）按來源和制造方法1.動物來源動物臟器資源豐富家畜：豬、馬、牛、羊家禽：雞、鴨海洋生物：海帶、鯊魚、海蛇二、分類（一）按來源和制造方法二、分類2.微生物來源發(fā)酵法優(yōu)點：1）微生物及其代謝物資源豐富、開發(fā)潛力大2）培養(yǎng)、繁殖快、產(chǎn)量高、成本低，便于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)，不受原料、運輸、保存、季節(jié)和資源供應(yīng)影響3）生產(chǎn)的生物藥物可綜合利用代謝物和菌絲體;誘變選育良種;加入前體培養(yǎng)法4）體內(nèi)酶的轉(zhuǎn)化作用，使復(fù)雜、難反應(yīng)能專一、迅速

2.微生物來源發(fā)酵法4.化學(xué)合成氨基酸、多肽、核酸降解物及其衍生物、維生素、激素結(jié)構(gòu)改造以高效，長效和高專一性3.植物來源植物中的蛋白質(zhì)、多糖、脂類、核酸等生物大分子的研究和利用4.化學(xué)合成3.植物來源5.現(xiàn)代生物技術(shù)產(chǎn)品基因工程技術(shù)生產(chǎn)的重組活性多肽活性蛋白質(zhì)類基因工程疫苗

McAb

多種細胞生長因子利用轉(zhuǎn)基因動、植物生產(chǎn)的生物藥物利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)改造天然蛋白質(zhì)創(chuàng)造自然界沒有的而功能上更優(yōu)良的蛋白質(zhì)類生物藥物5.現(xiàn)代生物技術(shù)產(chǎn)品生物技術(shù)藥物（基因工程藥物，BiotechDrugs）:以DNA重組技術(shù)（包括基因工程技術(shù)、蛋白質(zhì)工程技術(shù)）生產(chǎn)的蛋白質(zhì)、多肽、酶、激素、疫苗、單克隆抗體和細胞生長因子類藥物。細胞因子干擾素類：IFN-、IFN-β和IFN-。

IFN-有

lb，

2a，

2b等2.細胞因子白介素類和腫瘤壞死因子類：IL-2和突變型白介素-2；TNF-和TNF受體。二、生物技術(shù)藥物的主要類型第二節(jié)生物技術(shù)藥物一、概念生物技術(shù)藥物（基因工程藥物，BiotechDrugs）:以3.造血系統(tǒng)生長因子類：粒細胞集落刺激因子（G-CSF）、巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）、巨噬細胞粒細胞集落刺激因子（GM-CSF）、紅細胞生成素（EPO）、促血小板生成素（TPO)、干細胞生長因子（SCF）等。4.生長因子類：促進細胞生長、組織再生和創(chuàng)傷治療。胰島素樣生長因子（ICF）、表皮生長因子（ECF）、血小板衍生生長因子（PDGF）、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-與TGF-β）、神經(jīng)生長因子（NGF）及各種神經(jīng)營養(yǎng)因子。5.重組蛋白質(zhì)與多肽類激素：人重組胰島素（Humulin）、人生長激素（rhGH）、促卵泡激素（FSH）、促黃體生成素（LH）、絨毛膜促性腺激素（HCG）等。3.造血系統(tǒng)生長因子類：4.生長因子類：促進細胞生長、組6.心血管病治療劑與酶制劑：心血管疾病和抗腫瘤治療Ⅶ因子、水蛭素、組織纖溶酶原激活劑（tPA）、尿激酶、鏈激酶、葡激酶、門冬酰胺酶、超氧化物歧化酶（SOD）、葡萄糖腦苷酶及DNase等。7.重組疫苗與單抗制品：重組乙肝表面抗原疫苗（酵母）、乙肝基因疫苗（重組乙肝表面抗原疫苗、CHO細胞）、艾滋病疫苗和腫瘤疫苗等。己開發(fā)的McAb有72種，多用于治療難治性疾病如預(yù)防移植物急性排斥、免疫性疾病和腫瘤等。6.心血管病治療劑與酶制劑：7.重組疫苗與單抗制品：8.基因藥物：應(yīng)用于基因治療目的的DNA片段重組藥物?；蛑委?將外源基因?qū)霗C體以達到治療疾病目的。遺傳性疾病、腫瘤、艾滋病、囊性纖維變性、糖尿病和心血管病等。

我國已批準上市品：IFN-1b（自研），IFN-2a，IFN-2b，IFN-，IL-2，IL-2－125Ser，G-CSF，GM-CSF，SK，EPO，EGF，ECF衍生物，b-ECF，胰島素，GH，TPO，TNF衍生物，抗IL-8單抗乳膏劑，胸苷激酶基因工程細胞制劑，乙肝疫苗，痢疾疫苗等。8.基因藥物：我國已批準上市品：IFN-細胞:生物有機體形態(tài)結(jié)構(gòu)和生命活動的基本單位。第三章細胞工程技術(shù)概念細胞工程：以細胞作為研究對象，運用細胞生物學(xué)、分子生物學(xué)等學(xué)科的原理與方法，按照人們的意志設(shè)計改造細胞的某些遺傳性狀，培育出新的生物改良品種或通過細胞培養(yǎng)獲得自然界中難以獲得的珍貴產(chǎn)品的新興生物技術(shù)細胞培養(yǎng)、細胞融合、細胞重組和遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移等細胞:生物有機體形態(tài)結(jié)構(gòu)和生命活動的基本單位。第三章細胞第一節(jié)細胞培養(yǎng)技術(shù)細胞培養(yǎng)：生物體內(nèi)某一塊組織，用酶消化法分散成單個細胞，接種至特定的培養(yǎng)容器中并給予必要的生長條件，使其在體外生長繁殖的技術(shù)。細胞生長所需的培養(yǎng)條件：1.足夠的營養(yǎng)，糖、氨基酸、維生素、無機鹽等；2.生長環(huán)境，合適的溫度、pH值、無菌條件。第一節(jié)細胞培養(yǎng)技術(shù)細胞培養(yǎng)：生物體內(nèi)某一塊組織，用酶消化法動物細胞的培養(yǎng)：先在無菌條件下用消化酶將組織分散成單個細胞，用培養(yǎng)基制成細胞懸液，使其在體外合適的條件下生長繁殖的技術(shù)。一、動物細胞培養(yǎng)細胞培養(yǎng)的對象單個的細胞，組織培養(yǎng)的對象組織塊（0.5～1mm），器官培養(yǎng)的對象器官的一部分或整個器官。動物細胞的培養(yǎng)：先在無菌條件下用消化酶將組織分散成單個細胞，動物細胞分類：（－）動物細胞培養(yǎng)特征貼壁依賴性細胞貼壁大多數(shù)動物細胞非貼壁依賴性細胞懸浮血液淋巴細胞、腫瘤細胞、雜交瘤細胞、轉(zhuǎn)化細胞系兼性貼壁細胞附壁或懸浮動物細胞分類：（－）動物細胞培養(yǎng)特征貼壁依賴性細胞1.原代培養(yǎng)（or初次培養(yǎng)，primaryculture）胚胎或出生后幾天幼齡動物的臟器獲取組織，剪成小塊長寬1mm、厚約0.5mm，胰酶消化分散，稀釋成2×105～7×105／ml，分裝到培養(yǎng)瓶（板）于37℃CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。原代培養(yǎng)的細胞特點：離體時間短，一般具二倍體遺傳性狀，能較好地反映在體內(nèi)的生長狀況

適合用作藥物測試和細胞分化的研究工具。（二）動物細胞培養(yǎng)技術(shù)1.原代培養(yǎng)（or初次培養(yǎng)，primaryculture）2．傳代培養(yǎng)（或繼代培養(yǎng)，subculture）將細胞懸液轉(zhuǎn)接分裝到≥兩個瓶中培養(yǎng)傳代培養(yǎng)。

分裂次數(shù)：正常細胞有限一般人正常細胞可傳代50～60次有限細胞系（finitecellline），傳代過程中可無限制生長繁殖的細胞系連續(xù)細胞系（continuouscellline）或已確立的細胞系腫瘤細胞2．傳代培養(yǎng)（或繼代培養(yǎng)，subculture）分裂次數(shù)（三）動物細胞培養(yǎng)的營養(yǎng)條件1.培養(yǎng)基1）天然培養(yǎng)基成分復(fù)雜、來源有限血清、水解乳蛋白、膠原、胚胎浸液等。

主含蛋白質(zhì)、氨基酸、葡萄糖、激素、其他對維持細胞生長繁殖和保持細胞生物學(xué)活性不可缺少的未知因子，促進細胞貼壁、中和有毒物質(zhì)以保護細胞。動物血清：缺點：來源困難，成分不確定，使得細胞生長過程不易檢測控制。（三）動物細胞培養(yǎng)的營養(yǎng)條件1.培養(yǎng)基水解乳蛋白乳白蛋白的水解產(chǎn)物膠原動物真皮（豚鼠、牛）或大鼠尾腱來源的組織提取物

胚胎浸液雞胚和牛胚水解乳蛋白乳白蛋白的水解產(chǎn)物膠原特點：一定化學(xué)組成主要組分：氨基酸、維生素、糖、無機鹽、其他一些輔助因子。2.合成培養(yǎng)基根據(jù)天然培養(yǎng)基的成分，人工設(shè)計模擬合成RPMI-1640、DMEM、TC199、Eagle’sMEM等。只能維持細胞的生存(基礎(chǔ)培養(yǎng)基)

須補充部分天然培養(yǎng)基，血清一般為10％～20%。特點：一定化學(xué)組成2.合成培養(yǎng)基根據(jù)天然培養(yǎng)基的成分，人①維持細胞生長所需的激素和生長因子胰島素、生長激素、表皮生長因子、成纖維細胞生長因子②細胞貼壁或鋪展所需的細胞因子，纖維粘連素、鋪展因子、胎球蛋白等；血清在培養(yǎng)液中的主要作用：提供③識別維生素、脂類、激素和金屬的結(jié)合蛋白，調(diào)節(jié)被結(jié)合物的活力白蛋白與維生素、脂類、激素結(jié)合，將它們載入細胞轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合并傳遞鐵離子，結(jié)合蛋白與有毒金屬或熱原結(jié)合則可解除它們的毒性；④細胞生長所需的脂肪酸與微量元素磷脂質(zhì)、膽固醇、前列腺素等，銅、鋅等；①維持細胞生長所需的激素和生長因子血清在培養(yǎng)液中的主要作用：⑤蛋白酶抑制劑，使胰蛋白酶失活，保護細胞不受傷害；⑥起緩沖作用，保證培養(yǎng)液pH的穩(wěn)定。不足：成分復(fù)雜，含已知或未知成分，研究激素、細胞因子及藥物的作用時，干擾分析；產(chǎn)品生產(chǎn)增加細胞培養(yǎng)后產(chǎn)物提取的難度，或影響產(chǎn)品的質(zhì)量；大規(guī)模培養(yǎng)成本過高。⑤蛋白酶抑制劑，使胰蛋白酶失活，保護細胞不受傷害；不足：①消除因不同批次血清之間的差異而造成的實驗誤差，保證實驗結(jié)果的準確性與穩(wěn)定性；②減少血清中可能存在的支原體、病毒所造成的污染；3.無血清培養(yǎng)基優(yōu)點與含有血清的培養(yǎng)基相比③產(chǎn)品的分離純化更加容易，簡化鑒定細胞工程產(chǎn)品的程序；④來源穩(wěn)定，供應(yīng)充足。①消除因不同批次血清之間的差異而造成的實驗誤差，保證實驗結(jié)果無血清培養(yǎng)基組成：基礎(chǔ)培養(yǎng)基+替代血清作用的補充成分。1．激素和生長因子：激素胰島素、胰高血糖素、生長激素等多肽激素及孕酮、氫化可的松、雌二醇等甾體類激素。胰島素調(diào)節(jié)和控制細胞內(nèi)多種代謝途徑，加強糖原、蛋白質(zhì)、甘油三酯及DNA的合成。生長因子表皮生長因子、神經(jīng)生長因子、成纖維生長因子、血小板生長因子等。補充成分種類：無血清培養(yǎng)基組成：1．激素和生長因子：補充成分種類：2.結(jié)合蛋白：轉(zhuǎn)鐵蛋白增強細胞攝取和利用培養(yǎng)液中鐵的能力，可結(jié)合有毒金屬離子解除其毒性；白蛋白與脂類、金屬離子、激素等結(jié)合后可以增強其作用，刺激細胞增殖。3.貼壁和鋪展因子：常用的貼壁因子有纖維連結(jié)素、多聚賴氨酸、膠原，血清鋪展因子則是一種糖蛋白。 4.低分子量營養(yǎng)因子和元素：主要有維生素A、抗壞血酸、-生育酚、硒等2.結(jié)合蛋白：3.貼壁和鋪展因子：4.低分子量營養(yǎng)因子和元（四）動物細胞培養(yǎng)的環(huán)境條件培養(yǎng)基，培養(yǎng)環(huán)境無毒無菌；合適的溫度、濕度、氣體環(huán)境和pH值。1.培養(yǎng)環(huán)境無毒無菌：動物細胞體內(nèi)強大免疫系統(tǒng)，清除和抵抗病原體→免受侵害

體外培養(yǎng)失去抵御能力保證環(huán)境的無毒無菌(首要條件)

加雙抗液青霉素、鏈霉素以抑制可能存在的細菌和霉菌的生長（四）動物細胞培養(yǎng)的環(huán)境條件1.培養(yǎng)環(huán)境無毒無菌：2．溫度哺乳動物細胞35～37℃，動物細胞耐低溫能力強于耐高溫能力，

＞41℃

細胞嚴重受損，

＜4℃細胞也能存活數(shù)日。培養(yǎng)物+保護劑[二甲亞砜（DMSO）或甘油]-80℃或液氮罐（溫度可降至-196℃）可長期保存。3．滲透壓：哺乳動物細胞260～320mOsm／kg

滲透壓可略低培養(yǎng)過程中水分蒸發(fā)滲透壓↑2．溫度哺乳動物細胞35～37℃，3．滲透壓：4．氣體環(huán)境與pH：一般為95％的空氣+5%CO2，

O2

參與三羧酸循環(huán)，產(chǎn)生能量供給細胞生長，

CO2

細胞生長所必需的成分，細胞的代謝產(chǎn)物，維持培養(yǎng)液的pH。大多數(shù)細胞生長的適宜pH是7.2～7.4