地貧小鼠模型課件

建立地中海貧血小鼠模型的實(shí)驗(yàn)方案血液內(nèi)科賴穎暉背景β－地中海貧血是一種廣西常見(jiàn)的遺傳性慢性貧血性疾病，目前尚難根治。對(duì)于β－地中海貧血治療的研究，需要合適的動(dòng)物模型用于臨床前研究。國(guó)際上有報(bào)道用轉(zhuǎn)基因、基因敲除的地貧小鼠模型，但價(jià)格昂貴且國(guó)內(nèi)難以獲得。實(shí)驗(yàn)方案設(shè)想將β－地中海貧血患者的骨髓，移植給經(jīng)致死劑量照射的NOD/SCID小鼠（非肥胖糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷小鼠），重建小鼠造血，從而建立人源化的β－地中海貧血小鼠模型。材料和方法（二）人-鼠異種骨髓移植：無(wú)菌抗凝的β－地中海貧血患者骨髓樣本5-10ml在采集后4小時(shí)內(nèi)處理。密度梯度離心法分離MNC。將分離好的骨髓MNC制備成合適體積，采樣行單個(gè)核細(xì)胞計(jì)數(shù)、臺(tái)盼藍(lán)拒染率及CD34+細(xì)胞百分率測(cè)定，小鼠TBI后4-6小時(shí)從尾靜脈輸入0.5ml/只，移植組小鼠輸注骨髓MNC（>8×106個(gè)），照射對(duì)照組輸注1640液，正常對(duì)照組不注射。材料和方法（三）觀察指標(biāo)：1、照射及移植后觀察其存活率及毛色、食欲、精神狀態(tài)等一般狀況。２、移植前及移植后檢測(cè)小鼠的血象（斷尾采血，每周１次）。３、移植５周后采血行血紅蛋白電泳（地貧檢測(cè)），與未照射移植小鼠比較。材料和方法（四）人源化（植入證據(jù)）的檢測(cè)：①人-CD45＋細(xì)胞檢測(cè)：活存小鼠在移植5周后處死，取其骨髓細(xì)胞，取樣進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。以Cy-ChromeTM–IgG1作為陰性對(duì)照，用PE-cy5標(biāo)記的抗人-CD45單抗檢測(cè)人白細(xì)胞含量。②人Cart-1基因的聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測(cè)：以酚/氯仿法從小鼠骨髓細(xì)胞提取DNA。PCR檢測(cè)時(shí)用人外周血白細(xì)胞基因組DNA作陽(yáng)性對(duì)照，正常NOD/SCID小鼠骨髓細(xì)胞基因組DNA作陰性對(duì)照。Cart-1基因僅位于人Cart-1基因3’-非翻譯區(qū)，與小鼠無(wú)同源性。該動(dòng)物模型的難點(diǎn)１、模型為人-鼠異種移植模型，是一嵌合體，人源化的比例可能不高。擬采取致死量照射、分次照射、降低照射劑量率、分次移植等措施以盡可能地提高人源化的比例。２、模型的穩(wěn)定性。除了盡可能地保證各種處理措施的穩(wěn)定，小鼠本身的個(gè)體差異難以控制。