分子生物學實驗答案

（S目的基因能夠表達的載體。粒有復雜的構成，為的是控制目標蛋白的表達，如各種啟動子（7，調(diào)節(jié)子（）等，pET為代表的表達載體在菌體內(nèi)都是低拷貝的，防止?jié)B漏表達。----克隆載體一般是原核細菌將需要克隆的基因與克隆載體的質(zhì)粒相連接在導入原核細菌內(nèi)質(zhì)粒會在原核細菌內(nèi)大量復制形成大量的基因克隆被克隆的基因不一定會表達但一定被大量復制而表達載體是一些用于工程生產(chǎn)的細菌他們被導入目標基因這些目標基因會在此類細菌中得到表達生產(chǎn)出我們需要的產(chǎn)物導入的基因是有克隆載體產(chǎn)出的.酶切片斷的回收與連接時有哪些注意事項DNADNA片段是要把整個目的片斷所在位置的膠全部回收。所以為了減少膠的體積，我們就可以用相對比較薄的膠來跑電泳，通常只要夠點樣即可，或是采用薄而寬的梳子來跑膠。這樣可減DNA的濃度,DNA濃度不夠,想膠小點DNADNADNADNA回收效率pHpH結合DNApH太高，應作適當調(diào)整；漂洗液中未pHNaOHpH值，以增加洗脫得率。⑥洗脫產(chǎn)物含有殘留的乙醇會影響后續(xù)酶切實驗，請確保徹底去除漂洗緩沖液，具體方法參見回收效率低的解決方案。⑦不可以使用更小洗脫體積（小于說明書提供的最小洗脫體積）進行洗脫以提高濃度，因為說明書提供的最少洗DNA⑨瓊脂糖凝膠膠塊不溶可能是下述原因：瓊脂糖質(zhì)量不好；含目的片段的凝膠再空氣中放置過久，使膠塊失水、干燥，建議切膠后立即進行回收或將膠塊保存在4℃或-20的電泳緩沖液濃度過高或陳舊。雙酶切連接反應的注意要點雙酶切12必否則就可能造成酶切失敗。PCRPCR=1100.03pmol0.3pmolpmolDNA?gDNAXbp×650/1,000,000bp×650DNA?g,也可以直接用.1pmol1000bpDNA=0.66μg,如載體是5380bp則0.03pmol為0.03×5.38×0.66=0.106524?g。3、雙酶切時間及其體系其實完一般酶切3對于PCR產(chǎn)物不宜過大會影響質(zhì)粒和酶的碰撞機會效果降低質(zhì)粒量不應該超過酶切要求的最大量1U15-20ul1ugDNA。、兩種酶切的條件不同時分別進行兩次酶切切完一個純化后再切溫度要求不同先酶切低溫要求的再酶切高溫要求的若鹽濃度要求不同先酶切低鹽濃度要求的再酶切高鹽濃度要求的。5TETEEDTA影響酶可放大酶切體積或重新濃縮質(zhì)粒。6、限制酶的選擇非常重要提前看好各公司的雙切酶所用公用的BUFFER公用BUFFER在各個酶的兩邊加上保護堿基。7、純化問題純化PCR影PCR產(chǎn)物和雙酶切產(chǎn)物的純化均可應用柱式純化。、酶量的問題以TAKARA150μl301小時1μg的λDNA1(U)15/微升15μg的DNA1-4ml菌液提出的DNA3μgPCR503μg只要純化的質(zhì)量好酶切完全切得動。9、酶切、回收后的PCR摩爾比PCR=1100.03pmol0.3pmol。pmol為單位的DNA?gDNAXbp×650/1,000,000bp×650是該雙鏈DNA的分子量所得數(shù)值即為?g,.1pmol1000bpDNA=0.66μg,5380bp0.03pmol0.03×5.38×0.66=0.106524?gDNA濃度OD1.8-2.0.另外MARKER進MARKER20005微升的MARKER10TAKARA的連接酶上的說明寫的過夜在20μl的連接反應體系中6μgλDNA-HindIII1630DNA片段被連1U350U/μl3個小時足已。11、雙酶切時如果兩種酶反應溫度一致而buffer可查閱內(nèi)切酶供應商在目錄后的附錄中提供的各種酶在不同buffer如果有一種buffer能同時使2種酶的活力都超過就可以用這種buffer作為反應buffer如果兩種酶廠家不同無法查時可比較其buffer任何時候2種酶的總量不能超過反應體系而且最大反應體系最好不要小于20ul。如果2buffer成份相差較大或2種酶的反應溫度不同則必須分別做酶切。第1熱等方法使酶失活后再進行下一次酶切反應CIAP有的則不行。12、第一次酶切后通過電泳確證酶切完全后可以從膠中回收DNA后直接用PCR加入適量再加幾ddH2OeppendorfDNA片段離下來做下一次酶切。注意事項1、做轉化的時候,進行酶連接反應時,注意保持低溫狀態(tài),LIGASE,3,16AMP-RESISTENCE注意加AMP,,我的方法是培基高烤箱一般溫度為55-60度鋪板前后注意用吹風機吹干。3、對照的設立,:酶兩管用同一種BUFFER,,.如兩管均成線性可初步判斷雙酶切成功.做轉化時,也要進行對照。1)即拿雙酶切的質(zhì)粒產(chǎn)物也進行連接反應,這個對照可進一步看雙酶切是否成功,如果長出克隆,說明很有可能只進行了單酶切,如沒長出克隆,則證明雙酶切成功,當然要保證感受態(tài),培基,連接酶都'正常'的情況下。2)酶,的原始質(zhì)粒。3)4)AMP陰性板上20.一步一個腳印.不要偷懶,圖省事最后卻更費事.注意設立對照。4、同步雙酶切是一種省時省力的NEB每一種酶都隨酶NEBuffer100%NEBuffer的組成及內(nèi)切酶在不同緩沖液因此使用時可根據(jù)每種酶在非最優(yōu)緩沖液中的具體活性相應調(diào)整酶量和反應時間。5、如果找不到一種可以同時適合兩種酶的緩沖液鹽濃度低的酶開始酶切完畢后再調(diào)整鹽濃度直至滿足第二種酶的要求然后加入第二種酶完成雙酶切反應。采用標準緩沖