分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)DNA片段擴(kuò)增及DNA連接-實(shí)驗(yàn)操作

上次實(shí)驗(yàn)回顧實(shí)驗(yàn)一RNA的提取、變性電泳、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)1、提取真核細(xì)胞的總RNA（避免RNA酶污染）2、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（目的是得到cDNA模板）3、RNA的甲醛變性凝膠電泳（打開(kāi)RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)）RNA電泳結(jié)果rRNA可以作為內(nèi)部Marker分子，通過(guò)觀察rRNA的兩條帶（28S和18S）的比例，可以判斷所提取mRNA是否存在降解。RNA電泳并不能判斷mRNA是否提取成功，也不作為鑒定RNA提取質(zhì)量的常規(guī)方法，因?yàn)樵陔娪具^(guò)程中RNA可能發(fā)生降解。一、PCR實(shí)驗(yàn)背景二、PCR基本原理三、PCR引物設(shè)計(jì)原則四、PCR反應(yīng)注意事項(xiàng)五、常見(jiàn)問(wèn)題與對(duì)策六、PCR技術(shù)的應(yīng)用講解內(nèi)容

一、PCR反應(yīng)二、PCR產(chǎn)物電泳及回收三、DNA連接四、LB培養(yǎng)基瓊脂平板的制備實(shí)驗(yàn)內(nèi)容第二次實(shí)驗(yàn)課、DNA片段擴(kuò)增及DNA連接模板（DNA或cDNA）2

l10PCRbuffer（含MgCl2）

5ldNTPs(10mmol/L)1l5’引物

(10mol/L)1l3’引物

(10mol/L)1l去離子水（補(bǔ)足反應(yīng)體系）

39lTaqDNApol.(2U/l)1l

輕彈管底混合（用離心機(jī)甩一下）50l在一微量離心管中依次加入下列試劑：加各種成分最好在冰上進(jìn)行。加入順序不是隨機(jī)的：DNA聚合酶一定要最后加入。實(shí)驗(yàn)操作一、PCR注意：PCR產(chǎn)物一定要從膠上回收后再用。蛋白胨：10g酵母提取物：5gNaCl：10g瓊脂：15g蒸餾水：800ml終體積：1L高壓滅菌20分鐘，待冷卻至50oC時(shí)，加入抗生素，鋪瓊脂平板實(shí)驗(yàn)操作二、LB培養(yǎng)基瓊脂平板的制備無(wú)菌超凈工作臺(tái)的使用實(shí)驗(yàn)操作三、PCR產(chǎn)物的電泳及回收電泳：1.15μlPCR產(chǎn)物+3μl上樣液，混勻；2.上樣，1%瓊脂糖凝膠，100V，30min。擠膠法回收PCR產(chǎn)物：（1）在UV燈下，用手術(shù)刀片將含DNA片段的瓊脂糖凝膠切下，放入封口膜中；

（2）將切下來(lái)的膠塊，標(biāo)記好姓名，-20℃冰箱中。（3）放在封口膜內(nèi)直接擠壓，用加樣器吸取擠壓后得到的液體。PCR電泳結(jié)果本次實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增GAPDH基因(746bp)TA連接原理：1、TaqDNA聚合酶：PCR產(chǎn)物的3`端突出一個(gè)A3`

AA3`5`5`3`

TT3`5`5`2、商業(yè)設(shè)計(jì)的T載體：在3`端多出一個(gè)T3、兩者的互補(bǔ)堿基先退火結(jié)合(粘性末端連接)，然后連接酶在缺口形成磷酸二酯鍵。應(yīng)用時(shí)避免反復(fù)凍融，防止T的斷裂丟失。如果與T載體連接后主要以自身環(huán)化為主，要考慮‘T’可能已經(jīng)丟失。實(shí)驗(yàn)操作四、DNA連接（PCR產(chǎn)物與T載體的連接）連接反應(yīng)的關(guān)鍵是目的基因片段與載體的比例，一般片段與載體的比例為2:1或3:1（摩爾比）。平端連接通常需將載體的5端磷酸先去掉再進(jìn)行連接，這樣可防止載體的自身環(huán)化。載體的5端磷酸去掉后：片段與載體的連接就會(huì)留下一個(gè)缺口，連接酶由于載體5端缺乏磷酸而無(wú)法形成磷酸二酯鍵；轉(zhuǎn)化入細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)的酶會(huì)將缺乏的磷酸基團(tuán)加上，再形成磷酸二酯鍵。

其他說(shuō)明：可按下列配方進(jìn)行連接反應(yīng)：

回收的PCR產(chǎn)物（DNA片段）7lT載體

1lT4DNA連接酶buffer1lT4DNAligase1l

終體積10l實(shí)驗(yàn)操作：TA連接T載體一般從公司購(gòu)買(mǎi)，載體DNA的含量和濃度已知。因此，連接反應(yīng)成敗的關(guān)鍵是估計(jì)目的DNA的量。輕彈管底混合，離心機(jī)甩一下，置25oC水浴1h，-20oC保存?zhèn)溆眠B接產(chǎn)物可以直接用于轉(zhuǎn)