銀靈通膠囊對(duì)實(shí)驗(yàn)性高脂大鼠血脂的影響5

銀靈通膠囊調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)性高脂飲食大鼠血脂的研究劉才冬，金鈴，蔣云，侯亞義*1摘要：目的探究銀靈通膠囊對(duì)脂質(zhì)代謝的影響及其機(jī)制。方法建立大鼠高脂模型，用藥后檢測(cè)其血脂、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）的活性，檢測(cè)肝臟組織的高密度脂蛋白受體SR-BI、低密度脂蛋白受體（LDLR）、氧化低密度脂蛋白(ox-LDH)受體CD36蛋白表達(dá)的mRNA表達(dá)水平,檢測(cè)血管組織學(xué)變化。結(jié)果高脂飲食明顯升高大鼠血清中總膽固醇（CH）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）和動(dòng)脈硬化指數(shù)（AI值），銀靈通膠囊組可降低上述指標(biāo)，且呈一定的濃度依賴；高脂飲食可增加肝臟中SR-BI及CD36表達(dá)，降低LDLR表達(dá)，銀靈通膠囊引起SR-BI的過(guò)度表達(dá)，使LDLR表達(dá)增加，CD36表達(dá)下降。高脂飲食使血清中MDA的含量增加，給予銀靈通膠囊后，明顯降低血清MDA的含量。結(jié)論銀靈通膠囊具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，抗動(dòng)脈粥樣硬化（AS）及抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用。其機(jī)制與銀靈通膠囊能引起肝臟中SR-BI的過(guò)度表達(dá)及LDLR表達(dá)增加，降低肝臟中CD36表達(dá)和血清MDA含量有關(guān)。關(guān)鍵詞銀靈通膠囊；脂質(zhì)代謝；動(dòng)脈粥樣硬化；作者單位：南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院*通訊作者：侯亞義，E-mail：yayihou@。ThestudyofregulatingserumlipidsbyYinlingtongcapsulesinexperimentalhigh-fatdietAbstractObjectiveToexplorethemechanismofYinlingtongcapsulestolipidmetabolism.MethodAfterrathyperlipidemiamodelwaspreparedbythehigh-fatdiet,thedifferentdosesYinlingtongcapsuleswereadministeredbyonetimeeverytwodays.Atferthreeconsecutivemonths,theserumlipid,malonicaldehyde(MDA),superoxidedismutase(SOD)andtheactivityofglutathioneperoxidase(GSH-Px),highdensitylipoproteinreceptorSR-BI,LDLreceptor(LDLR),oxidationoflow-densitylipoprotein(ox-LDHdetectionoflivertissue)receptorsCD36proteinexpressionofmRNAlevelsandthevascularhistologicalchangesweredetected.ResultsTheserumtotalcholesterol(CH),triglyceride(TG),low-densitylipoproteincholesterol(LDL-C)andatherogenicindex(AIvalues)ofthehigh-fatdietweresignificantlyincreasedinthehigh-fatrat,andYinlingtongcapsulescouldreducetheabove-mentionedindicatorsadosedependent.FatdietcanincreasetheliverinSR-BIandCD36expression,reduceLDLRexpression,andYinlingtongcapsulesleadedtotheoverexpressionofSR-BILDLRanddecreaseofCD36expression.High-fatdietincreasedserumMDAcontent,andYinlingtongcapsulescouldsignificantlylowerserumMDAcontent.ConclusionYinlingtongcapsulescouldregulatelipidmetabolism,anti-atherosclerosis(AS),andanti-lipidperoxidationinthehigh-fatrat.ThemechanismswererelatedwithoverexpressionofSR-BI,LDLRintheliverandreducingCD36expressionintheliverandserumMDA.銀靈通膠囊是由銀杏葉提取物【1】和靈芝孢子提取物【2】配合而成的復(fù)方制劑，它富含銀杏黃銅、內(nèi)酯、靈芝多糖和三萜類化合物。在臨床研究中證實(shí)，銀靈通膠囊具有調(diào)節(jié)脂類代謝，對(duì)高血壓、高血脂和冠心病患者就有一定的緩解作用，但具體機(jī)理不明。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)高糖高脂飲食建立大鼠脂類代謝失衡模型，給予銀靈通膠囊后觀察其對(duì)血脂代謝紊亂的干預(yù)作用，探討其調(diào)節(jié)脂肪代謝的具體分子。1、材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)材料藥物：銀靈通膠囊，由南京中科藥業(yè)有限公司饋贈(zèng)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:SD大鼠,4－6周齡，雌性大鼠4O只，180－250g,購(gòu)于揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前,大鼠在動(dòng)物房飼養(yǎng)1周,在室溫條件下,自由攝食和飲水。1.2高脂模型建立：動(dòng)物檢疫期后進(jìn)行動(dòng)物分組：正常組（喂以正常飼料），高脂組（喂高脂飼料），低劑量組（喂高脂飼料同時(shí)喂以銀靈通膠囊50mg/kg），高劑量組（喂高脂飼料同時(shí)喂以銀靈通膠囊250mg/kg）。高脂飼料配方在正常飼料中添加配方如下：78.8％基礎(chǔ)飼料、1％膽固醇、10％蛋黃粉和10％豬油、0.2％膽酸鈉【3】。給藥采取灌胃方式，兩天一次，連續(xù)3個(gè)月后取各組織樣本用以下檢測(cè)。1.3血清學(xué)檢測(cè)指標(biāo)：（1）血脂指標(biāo)檢測(cè)：給藥結(jié)束后，眼眶取血后，取血清進(jìn)行血脂指標(biāo)檢測(cè)。血總清膽固醇（CH）、甘油三脂（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、極低密度脂蛋白膽固醇（VLDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C），用全自動(dòng)生化分析儀常規(guī)方法測(cè)定。并進(jìn)行動(dòng)脈硬化指數(shù)AI的評(píng)判，AI=[CH－HDL]÷HDL【4】。（2）抗氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)：檢測(cè)血清中過(guò)氧化脂質(zhì)指標(biāo)MDA、SOD和GSH-Px的活性。1.4肝臟組織中相關(guān)脂質(zhì)代謝受體的mRNA表達(dá)水平檢測(cè)：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用0.1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，在無(wú)菌條件下迅速取出部分肝左葉，置于DEPC處理的離心管中，-80℃冰箱凍存。取出組織塊，在液氮冷凍條件下將組織搗碎成粉末，按照凱基生物公司的RNA抽提試劑盒進(jìn)行RNA抽提，將提取出RNA產(chǎn)物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，操作按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩２捎靡驭?action為內(nèi)參基因，用Q-PCR方法計(jì)算目的基因LDLR、HDL-LR和CD36的mRNA表達(dá)量。引物序列如下：LDLR：5-GTGGCAGTAGTGAGTGTATC-3和5-ATCCCAAAGACGAGAAGT-3；CD36:5-GTGGCAAAGAATAGCAGCAAGA-3和5-AAGATGGCTCCATTGGGTTGTA-3；SR-BI：5-GTTCCCTTCTACTTGTCCGT-3和5-CGTTCCACTTATCCACCAGAT-3；β-action：5'CACTGTGCCCATCTATGAGGGTTAC3'和5'AACCGCTCATTGCCG1.5組織學(xué)檢測(cè)：動(dòng)物解剖后：取冠狀動(dòng)脈血管長(zhǎng)約lcm，先用生理鹽水沖洗，后予10％中性甲醛溶液中固定24h，逐級(jí)酒精脫水，石蠟包埋，常規(guī)切片，HE染色，Weigert染色，乙醇分化，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固，顯微鏡下攝片。1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以X－±S表示采用t檢驗(yàn)，以P﹤0.05為差異有顯著性意義。所有流式標(biāo)本均用CellQuest軟件分析。2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.1銀靈通膠囊對(duì)血脂的影響：見(jiàn)表1。高脂飲食明顯升高大鼠血清中CH、TG和LDL-C，而對(duì)極低密度脂VLDL-C和HDL-C沒(méi)有影響。當(dāng)給予銀靈通膠囊后升高的這些指標(biāo)均有一定的下降，且呈一定的濃度依賴，而其它血脂指標(biāo)沒(méi)有明顯的下降趨勢(shì)。根據(jù)所得的數(shù)據(jù)，進(jìn)行各組動(dòng)物的動(dòng)脈硬化指數(shù)AI進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，AI值能反映動(dòng)脈粥樣硬化程度。數(shù)值越小動(dòng)脈硬化的程度就越輕，引發(fā)心腦血管病的危險(xiǎn)性就越低，數(shù)值越大動(dòng)脈硬化的程度就越重，發(fā)生心腦血管病的危險(xiǎn)性就越高。結(jié)果(圖1)顯示:高脂飲食組的AI值與正常對(duì)照組比較明顯升高，而進(jìn)行銀靈通膠囊后AI的值明顯下降，且呈一定的劑量依賴，但沒(méi)有降到正常對(duì)照組水平。表1銀靈通降低血清中血脂指標(biāo)水平組別CH(mmol/l)TG(mmol/l)LDL-C(mmol/l)VLDL-C(mmol/l)HDL-C(mmol/l)正常組3.05±0.631.02±0.273.34±0.690.68±0.171.34±0.23高脂組14.73±1.2*2.07±0.51*8.73±1.46*0.58±0.291.68±0.45低劑量組8.72±3.721.57±0.437.02±2.30.42±0.121.44±0.32高劑量組6.23±1.78＃1.13±0.32＃5.94±3.20.42±0.131.32±0.27*表示與對(duì)照組比較P<0.05，＃表示與高脂組比較P<0.05。圖圖1、各組動(dòng)脈粥樣硬化指標(biāo)AI的比較2.2銀靈通膠囊對(duì)肝臟組織中相關(guān)脂質(zhì)代謝受體的mRNA表達(dá)水平的影響如圖2所示，銀靈通膠囊引起肝臟中SR-BI受體的過(guò)度表達(dá)，從而增強(qiáng)HDL的膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)功能而防止動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。高脂飲食使肝臟中LDLR受體降低，從而使血清中LDL增加，銀靈通膠囊使用后使LDLR表達(dá)增加，從而降低了血清中LDL降低，減少了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。高脂飲食使肝臟中CD36表達(dá)升高，增加了動(dòng)脈粥樣硬化的風(fēng)險(xiǎn)，銀靈通膠囊可能通過(guò)降低CD36而起到調(diào)整血脂及抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。圖圖2、大鼠肝臟組織中相關(guān)脂質(zhì)代謝受體的mRNA表達(dá)水平2.3冠狀動(dòng)脈組織學(xué)檢查組織學(xué)結(jié)果表明高脂組血管內(nèi)膜脫落，內(nèi)皮細(xì)胞體積增大，細(xì)胞間連接間隙增寬，內(nèi)膜有大量單核細(xì)胞浸潤(rùn)，中膜見(jiàn)合成型平滑肌細(xì)胞；而給予銀靈通膠囊后病變程度比較輕，內(nèi)膜尚完整且較平坦，內(nèi)膜增厚的程度以及黏附于內(nèi)皮和浸潤(rùn)于內(nèi)膜下的單核細(xì)胞較B組明顯減少。結(jié)果表明，銀靈通膠囊抑制了動(dòng)脈硬化形成，且抑制了內(nèi)膜單核細(xì)胞的侵潤(rùn)。圖圖3冠狀動(dòng)脈組織學(xué)檢查2.5抗氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響：表4顯示，高脂組血中MDA水平顯著高于正常組（P<0.05），銀靈通膠囊對(duì)高脂大鼠血液中MDA升高有一定的抵抗作用，且有一定的劑量依賴性，而對(duì)SOD和GSH-Px沒(méi)有影響。圖圖4、各組氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)討論隨著我國(guó)人民生活水平提高和飲食習(xí)慣改變，高脂血癥引發(fā)的各種疾病越來(lái)越為人們所重視。高脂飲食使血清中的總膽固醇、低密度或極低密度脂蛋白、甘油三酯的濃度長(zhǎng)期維持一個(gè)較高水平，銀靈通膠囊作為保健品，其在調(diào)節(jié)血脂方面的功能越來(lái)越受到人們的重視。在肝臟中，高密度脂蛋白通過(guò)與肝細(xì)胞膜上的SR-BI【5】受體結(jié)合后，肝細(xì)胞能將其中的膽固醇攝取并轉(zhuǎn)化成膽汁酸排出體外，從而起清除血漿膽固醇的作用，以防動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。此外，肝臟表面的LDLR可介導(dǎo)血漿中LDL-C和VLDL-C的清除【6】，肝臟可以通過(guò)此種方式來(lái)調(diào)節(jié)血漿LDL-C含量和體內(nèi)膽固醇的水平。CD36是oxLDL的高親和力受體,其作用是識(shí)別和內(nèi)吞oxLDL,而oxLDL可通過(guò)誘導(dǎo)CD36表達(dá)來(lái)刺激其對(duì)本身的攝取,使此循環(huán)繼續(xù)進(jìn)行下去,造成膽固醇在細(xì)胞內(nèi)積累,最終導(dǎo)致泡沫細(xì)胞的形成，構(gòu)成動(dòng)脈粥樣硬化損害的核心基礎(chǔ)【7,8】。本實(shí)驗(yàn)觀察到，銀靈通膠囊可以通過(guò)增加肝臟組織中SR-BI和HDLR受體的表達(dá)，并降低CD36的表達(dá)，從調(diào)節(jié)高脂飲食大鼠血脂水平，緩解高脂飲食所造成的冠狀動(dòng)脈的病變程度。但銀靈通膠囊作為一個(gè)中藥復(fù)方制劑成分復(fù)雜，具體調(diào)控的有效成分及其作用機(jī)理還需進(jìn)一步研究。參考文獻(xiàn)李娟莉，張志雄.銀杏葉提取物對(duì)慢性間歇性缺氧大鼠肺動(dòng)脈高壓血管內(nèi)皮損傷的保護(hù)作用(J）.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志,２０１１(９)１１,1352-1354.王亞?wèn)|;王海玉;張桂霞;張聰恪;劉翠娥。三七和靈芝孢子粉提取物對(duì)高血脂模型大鼠降血脂作用的實(shí)驗(yàn)研究（J）。實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2006（13）6，1452-1453徐淑云，卞如濂，陳修.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2005：227-1203.KangNH,LeeWK,YiBR,LeeHR,ParkMA,ParkSK,ParkHK,ChoiKC.RiskofcardiovasculardiseaseissuppressedbydietarysupplementationwithprotamineandchitooligosaccharideinSprague-Dawleyrats（J）.\o"Molecularmedicinereports."MolMedReport.2012Oct12.LiuX,XiongSL,YiGH.ABCA1,ABCG1,andSR-BI:TransitofHDL-associatedsphingosine-1-phosphate（J）.\o"Clinicachimicaacta;internationaljournalofclinicalchemistry."ClinChimActa.2012Feb18;413(3-4):384-390.GoGW,ManiA.Low-densitylipoproteinreceptor(LDLR)familyorchestratescholesterolhomeostasis（J）.\o"TheYalejournalofbiologyandmedicine."YaleJBiolMed.2012Mar;85(1):19-28.Love-GregoryL,AbumradNA.CD36geneticsandthemetaboliccomplicationsofobesity（J）.\l"#