基因工程抗體gaobo課件

1基因工程抗體INSTITUTEFORIMMUNOBIOLOGYDEPARTMENTOFIMMUNOLOGYBoGao,Ph.D.Email:gaobo@Tel:542371542013-9-301基因工程抗體INSTITUTEFORIMMUNOBIO121888年 Roux/Yersin 白喉外毒素1890年 Behring/Kitasato 抗毒素；血清療法1939年 Tiselius/Kabat g-globulin1959年 Porter Fab、Fc1962年 Edelman H、L1962年 Porter Fab(H+L)、Fc(H)

1975年 Kohler/Milstein McAb1980年 Tonegawa Abdiversity1984年 Sharon Engineeringantibody1989年 Winter/Lerner AntibodyLibraries21888年 Roux/Yersin 白喉外毒素1923EmilvonBehring,

1901,antitoxinsGeoregesKohlerandCesarMilstein,

1984,monoclonalantibodySusumuTonegama,1987,structureofIggeneGeraldEdelmanandRodneyPorter,

1972,structureofantibodyPaulEhrlich,

1908,productionofantibodyNobelPrizewinners3EmilvonBehring,1901,antit34445556667抗體占所有生物技術(shù)藥品的25%2010年440億美元2015年將超過980億美元2011年TOP50的生物藥物14個是抗體藥物，前六位均是抗體藥物抗體相關(guān)信息7抗體占所有生物技術(shù)藥品的25%抗體相關(guān)信息788899910101011111112121213131314141415151516抗體的發(fā)展抗血清的制備：19世紀(jì)末，Behring單克隆抗體：1975，Koehler和MilsteinNature1975Aug7;256(5517):495-7Continuousculturesoffusedcellssecretingantibodyofpredefinedspecificity.

基因工程抗體：1984，Sharon

Nature1984May24-30;309(5966):364-7

ExpressionofaVHCkappachimaericproteininmousemyelomacells.16抗體的發(fā)展抗血清的制備：19世紀(jì)末，Behring1617抗血清（多克隆抗體）的制備ForeignproteinsVirusesBacteriaParasitesFungiAntigensBcellBcellactivatedHumoralresponsePlasmacellssecreteantibodies+THcellAntigen+Vertebratebody17抗血清（多克隆抗體）的制備Foreignprotein1718多克隆抗血清對健康人用疫苗進(jìn)行主動免疫，免疫前（a）和免疫后10天（b）分別采血并對血清蛋白進(jìn)行凝膠電泳分析。免疫前血清中的球蛋白條帶較寬，免疫之后則相對集中。Bruton氏病患者血清蛋白中的球蛋白條帶缺失（c）。a1a2bg白蛋白球蛋白（c）（a）（b）18多克隆抗血清對健康人用疫苗進(jìn)行主動免疫，免疫前（a）和免1819小鼠體系：半衰期短、HAMA大鼠體系：單抗腹水比小鼠高10倍，易親合層析人體系：人－鼠雜交瘤、人－人雜交瘤

單克隆抗體的制備19小鼠體系：半衰期短、HAMA單克隆抗體的制備1920202021

雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)DNA合成的途徑：氨基喋呤(Aminopterin,A)糖+氨基酸核苷酸胸腺嘧啶核苷(Thymidine,T)TKTMP次黃嘌呤IMPHGPRT核苷酸前體DNA(Hypoxanthine,H)21雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)DNA合成的途徑：氨基喋呤(Am2122融合后細(xì)胞在HAT培養(yǎng)基中存活情況脾細(xì)胞〔HGPRT+,TK+,不能長期生長〕骨髓瘤細(xì)胞〔HGPRT-,TK-，不能生長〕雜交瘤細(xì)胞〔HGPRT+,TK+，能夠生長〕22融合后細(xì)胞在HAT培養(yǎng)基中存活情況2223蛇毒單抗的制備23蛇毒單抗的制備2324242425鼠源單克隆抗體的應(yīng)用基礎(chǔ)研究細(xì)胞抗原研究及鑒定分類細(xì)胞受體研究分子克隆及功能研究醫(yī)學(xué)研究及診斷感染性疾病診斷腫瘤診斷及預(yù)后判斷其它診斷及研究不足：半衰期短、人抗鼠抗體反應(yīng)（HAMA）25鼠源單克隆抗體的應(yīng)用基礎(chǔ)研究細(xì)胞抗原研究及鑒定分類細(xì)胞受2526

將制備單抗的細(xì)胞工程技術(shù)與生產(chǎn)重組分子的基因工程技術(shù)和蛋白質(zhì)工程技術(shù)結(jié)合起來，對編碼抗體的基因按不同需要進(jìn)行加工改造和重新組裝，轉(zhuǎn)染適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞后表達(dá)出抗體分子，這種經(jīng)基因重組的抗體稱為基因工程抗體。基因工程抗體概念26將制備單抗的細(xì)胞工程技術(shù)與生產(chǎn)重組分子的基因工程26271.從雜交瘤或免疫脾細(xì)胞、外周血淋巴細(xì)胞等提取mRNA

逆轉(zhuǎn)錄成cDNA2.PCR分別擴(kuò)增出抗體的重鏈及輕鏈基因3.構(gòu)建表達(dá)載體4.在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中表達(dá)并折疊成有功能的抗體分子5.篩選出高表達(dá)細(xì)胞株6.親和層折等手段純化抗體片段基因工程抗體基本原理271.從雜交瘤或免疫脾細(xì)胞、外周血淋巴細(xì)胞等提取mRNA2728基因工程抗體人源化(Humanization)抗體28基因工程抗體人源化(Humanization)抗體2829Humanization

（Chimeric/ReshapedAntibody)Constantregion(Fc)MouseantibodyAntigen-bindingregion(Fab)Antigen-bindingregionsfrommouseSpecifivantigen-bindingsitesfrommouseChimericantibody(66%)Fullyhuamnantibody(100%)Humanizedantibody(90%)29Humanization（Chimeric/Resha2930FR：為CDR的構(gòu)象提供環(huán)境；參與抗體結(jié)合位點正確構(gòu)象的形成；簡單的CDR移植會喪失或降低原親本抗體的親和力方法：模板替換 較大同源性人FR替換鼠FR

表面重塑 對鼠CDR及FR表面殘基鑲飾或重飾－類似人補(bǔ)償變換 CDR移植后更換部分的人FR－鼠定位保留 以人FR保守序列為模板進(jìn)行人源化

人源化抗體的構(gòu)建策略30FR：為CDR的構(gòu)象提供環(huán)境；參與抗體結(jié)合位點正確構(gòu)象的3031從同源抗體或抗體的共同序列中選擇人源FR確定在FR中起關(guān)鍵作用的氨基酸以鼠單抗可變區(qū)的立體模型作指導(dǎo)人源化抗體的構(gòu)建策略關(guān)鍵目標(biāo)保持抗體的親和力降低免疫原性31從同源抗體或抗體的共同序列中選擇人源FR人源化抗體的構(gòu)建3132

從分泌某種鼠單抗的雜交瘤細(xì)胞基因組中分離并鑒定出重排的功能性V區(qū)基因，并與人抗體C區(qū)基因按一定的方式重組，克隆到表達(dá)載體中構(gòu)建鼠－人嵌合的輕重鏈基因表達(dá)載體，再轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞表達(dá)，經(jīng)篩選后制備成特異性的嵌合抗體。人－鼠嵌合抗體概念32從分泌某種鼠單抗的雜交瘤細(xì)胞基因組中分離3233PCR鼠抗體基因人抗體基因VLCLVHCH1CH2CH3VLCLVHCH1CH2CH3嵌合輕鏈嵌合重鏈IgG33PCR鼠抗體基因人抗體基因VLCLVH3334人－鼠嵌合抗體特點完全保留鼠單抗的特異性和親和力降低了HAMA不良反應(yīng)一定的免疫原性，V區(qū)完全鼠源性34人－鼠嵌合抗體特點完全保留鼠單抗的特異性和親和力降低3435改型抗體

抗體分子輕、重鏈可變區(qū)的6個CDR形成CDR平面直接接觸抗原，決定了抗體的特異性，骨架區(qū)只是作為支持CDR襻的支架，而且其立體構(gòu)象極為保守。因此，將鼠單抗的CDR移植到人單抗的骨架區(qū)上，有可能使人單抗獲得鼠單抗的特異性，并最大限度地減少鼠單抗的異源性，僅有9%的序列來源于親本鼠單抗，這種CDR移植的人單抗稱為改型抗體。35改型抗體抗體分子輕、重鏈可變區(qū)的6個CDR形成CDR3536CDR序列CDR序列鼠單克隆抗體人抗體人源化抗體（改型抗體）鼠單克隆V區(qū)人源化（CDR移植）36CDR序列CDR序列鼠單克隆抗體人抗體人源化抗體（3637治療性抗體的開發(fā)幾經(jīng)反復(fù)終于形成蓬勃發(fā)展-——鼠單抗人源化的技術(shù)功不可沒。

鼠單抗人源化時基本選擇IgG同種型，在體內(nèi)IgG與存在于內(nèi)皮細(xì)胞表面的受體FcRn相互作用，在細(xì)胞內(nèi)受到保護(hù)不被降解而具有較長的半衰期。同時鼠IgG通過激活補(bǔ)體和結(jié)合Fc受體激發(fā)一系列生物效應(yīng)功能的效率較低，無論是嵌合抗體還是改型抗體均通過使用人恒定區(qū)克服了這一缺陷。人源化抗體的評價37治療性抗體的開發(fā)幾經(jīng)反復(fù)終于形成蓬勃發(fā)展-——鼠單抗人源3738對于人源化的最主要的初衷，消除異源性的評價卻要復(fù)雜的多。除了降低抗體分子的鼠源序列外，其免疫原性還受到其它因素如給予抗體的途徑和劑量、病人的病情和免疫狀況、抗體所針對的抗原的特性和部位以及抗體本身激活生物學(xué)效應(yīng)的特性等均相關(guān)，因此應(yīng)該綜合考慮。人源化抗體的評價38對于人源化的最主要的初衷，消除異源性的評價卻要復(fù)雜的多。3839不同種屬之間抗體分子可變區(qū)的差別遠(yuǎn)低于恒定區(qū)的差別；構(gòu)建改型抗體要比構(gòu)建嵌合抗體的工作量大的多，還常常導(dǎo)致親和力不同程度的降低，付出親和力和增加研制成本的代價是否值得的問題。人源化抗體的評價改型抗體相對于嵌合抗體的優(yōu)越性存在質(zhì)疑：39不同種屬之間抗體分子可變區(qū)的差別遠(yuǎn)低于恒定區(qū)的差別；人源3940應(yīng)當(dāng)制備配對的改型和嵌合抗體，用于足夠量的可比較的人群，觀察其誘發(fā)抗抗體的生成情況，這是難以做到的。迄今大量臨床應(yīng)用的情況揭示其他影響免疫原性的因素值得重視，因此一味追求序列的同源性而摒棄嵌合抗體是值得商榷的。事實上即使完全人源化的抗體也可以誘發(fā)抗獨特型抗體，并不可能完全消除治療性抗體的免疫原性，而這種抗獨特型反應(yīng)的后果如何待進(jìn)一步觀察。人源化抗體的評價欲確切評判人源化對免疫原性的影響：40應(yīng)當(dāng)制備配對的改型和嵌合抗體，用于足夠量的可比較的人群，4041V區(qū)片斷，1/3～1/80，具有與抗原結(jié)合的功能種類：Fab抗體單鏈抗體（ScFv）

Fv片斷抗體單域抗體SDAb

最小識別單位MRU小分子抗體41V區(qū)片斷，1/3～1/80，具有與抗原結(jié)合的功能小分子抗4142(1)小分子抗體42(1)小分子抗體4243組成：由重鏈V區(qū)及CH1功能區(qū)與輕鏈二硫鍵連接，50KD，為完整IgG的1/3。應(yīng)用前景：較好的滲透性和藥代動力學(xué)特征

HAMA反應(yīng)存在親和力較低、穩(wěn)定性差Fab抗體43組成：由重鏈V區(qū)及CH1功能區(qū)與輕鏈二硫鍵連接，50KD4344將抗體分子的重鏈V區(qū)和CH1功能區(qū)的cDNA與輕鏈完整的cDNA序列重組并克隆到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中在大腸桿菌等宿主細(xì)胞中表達(dá)整個制備過程包括Fab抗體基因的擴(kuò)增，表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)及產(chǎn)物鑒定基因工程手段構(gòu)建Fab抗體的原理44將抗體分子的重鏈V區(qū)和CH1功能區(qū)的cDNA與輕鏈完整的4445Fab抗體基因的擴(kuò)增方法Fab基因擴(kuò)增的方法主要有二種：

采用PCR技術(shù)直接從基因組中擴(kuò)增，但這種方法不確定的影響因素較多。通過RT-PCR技術(shù)從cDNA中擴(kuò)增

兩種方法成功的關(guān)鍵均取決于PCR引物的設(shè)計。不同F(xiàn)ab抗體引物的設(shè)計有所不同，但一般均使用同源性較高的序列，其中5’端的引物必須包含克隆位點，3’端的引物除克隆位點外還應(yīng)含有翻譯終止信號。45Fab抗體基因的擴(kuò)增方法Fab基因擴(kuò)增的方法主要有二種：4546免疫球蛋白基因載體的構(gòu)建H鏈表達(dá)載體L鏈表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞PrVHCH1PrVLCLFab抗體分子的制備Fab抗體46免疫球蛋白H鏈表達(dá)載體L鏈表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞Pr4647抗體分泌細(xì)胞VHVLCL-S-S-CH1Fab抗體分子的制備Fab抗體47抗體分泌細(xì)胞VHVLCL-S-S-CH1Fab抗體分子4748單鏈抗體（ScFv）組成特點VH和VL通過連接肽重組表達(dá)分子量小、穿透力強(qiáng)、體內(nèi)循環(huán)半衰期短、免疫原性低可作為其它抗體的基本元件48單鏈抗體（ScFv）組成特點VH和VL通過連接肽4849

單鏈抗體基因的構(gòu)建一般采用從雜交瘤細(xì)胞提取mRNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，通過PCR擴(kuò)增其VL及VH基因，再用人工合成的寡核苷酸序列即接頭把VL的C端與VH的N端或VH的C端與VL的N端連接，即成單鏈抗體基因。

單鏈抗體（ScFv）構(gòu)建方法49單鏈抗體基因的構(gòu)建一般采用從雜交瘤細(xì)胞提取mRN4950VHVL接頭DNA(Gly4Ser)3VH引物PCRVH接頭DNA酶切、克隆ScFv(singlechainFv,scFv)的構(gòu)建變性、復(fù)性VL引物VL單鏈抗體（ScFv）50VH5051單鏈ScFv：抗原含重復(fù)抗原決定簇時，親和力下降8倍以上雙價ScFv：改善ScFv的親和活性雙特異性ScFv：與細(xì)胞因子IL-2、TNF相連：特異性殺傷應(yīng)用前景51單鏈ScFv：抗原含重復(fù)抗原決定簇時，親和力下降8倍以上5152保持抗體的可溶性接頭：長度、V區(qū)空間結(jié)構(gòu)組成單域抗體一個VH或VL功能結(jié)構(gòu)域特點分子量小Ig分子的1/12、抗原性弱、穿透力強(qiáng)抗原性弱、相對較粘（疏水面的暴露有關(guān)。在全抗體分子中，疏水面被VL遮蓋）細(xì)菌LPS的單域抗體在雜交瘤細(xì)胞中的表達(dá)量比親本單克隆抗體高50倍以上設(shè)計原則52保持抗體的可溶性組成單域抗體一個VH或VL功能結(jié)構(gòu)域5253最小識別單位(minimalrecognitionunit,MRU)組成高多變區(qū)多肽（hypervariableregionpolypeptides,HRP）一個CDR多肽特點設(shè)計原理應(yīng)用16－30氨基酸、抗原性弱、穿透力強(qiáng)非特異性吸附每個CDR的作用不同尋找在抗原識別和親和力方面有重要意義的CDR抗血小板纖維蛋白原受體CDR3，抑制纖維蛋白原、PACI與血小板的結(jié)合 53最小識別單位(minimalrecognitionu5354傳統(tǒng)單抗分子量大，穿透力弱基因工程小分子抗體穿透力強(qiáng)，親和力低多價微型抗體 雙鏈抗體（diabody） 雙特異性抗體（bispecificantibody） 微型抗體（minibody） 三鏈抗體（triabody） 四鏈抗體（tetrabody）多價微型抗體54傳統(tǒng)單抗分子量大，穿透力弱多價微型抗體5455VL－VH－CH380kD易于構(gòu)建及生產(chǎn)血中停留時間長靶部位吸收好

CH3-dimerizedscFVCH3CH3微型抗體55VL－VH－CH3CH3-dimerizedscF5556LD型LDLEPKSCDKTHTCPPCGGGSSGGGSGFlex型連接肽序列VHVLVHVLCH356LD型LEPKSCDKTHTCPPCGGGSSGGGSG5657價肽取決于連接肽段所形成的聚合物特性多價ScFv與單價ScFv和Fab片斷相比，與靶抗原結(jié)合的功能親和力提高四鏈抗體4helix-stabilizedscFvtetramers57價肽取決于連接肽段所形成的聚合物特性多價ScFv與單價S5758Leucine-zipperstabilizedscFvdimersHelix-stabilizedscFvdimers4helix-stabilizedscFvtetramersStreptavidin-scFvscFvfusionswithdi-andmultimeriaztiondomains58Leucine-zipperstabilizedsc5859雙鏈抗體的分子量為60KD左右，三鏈抗體為90KD左右，二者均顯著大于ScFv單體的分子量(約30KD)。因而在體內(nèi)應(yīng)用多價微抗時，可以降低抗體在循環(huán)中的清除速度，但這種優(yōu)勢也可能因穿透能力的降低而抵消。雙鏈抗體和三鏈抗體的較短接頭不易被蛋白酶水解，而單價ScFv的較長接頭卻易被水解。多價ScFv與單價ScFv和Fab片段比較，最突出的特點是與靶抗原結(jié)合的功能親合力提高。ScFv多聚體能同時結(jié)合幾個靶抗原，也可多價結(jié)合于癌細(xì)胞的表面，因而具有較高的親和力。單鏈抗體、雙鏈抗體、三鏈抗體及多價抗體的比較59雙鏈抗體的分子量為60KD左右，三鏈抗體為90KD左右，5960

人-鼠嵌合抗體 鼠源V區(qū)或Fab 15025%~30%

人源C區(qū)或Fc改型抗體 以鼠源CDR 15015%

替換人源CDR雙特異性抗體 異源性H2/L2 150－小分子抗體Fab 完整L和部分H 50 15％Fv VH和VL 25 15％單鏈抗體 VH-連接肽-VL 26 15％單域抗體 VH 12.5 7.5％最小識別單位 單一CDR 2 1.5％基因工程抗體的種類及其特性種類基本結(jié)構(gòu)相對分子量（kD）鼠源性成分60

人-鼠嵌合抗體 鼠源V區(qū)或Fab 6061BsAb，兩個不同的VL和VH－兩個不同的抗原結(jié)合位點雙特異性抗體61BsAb，兩個不同的VL和VH－兩個不同的抗原結(jié)合位點雙6162CTLCD3TUMORCELL-S-S-VHCH1VL-S-S-CH1抗原A抗原B雙特異性抗體62CTLCD3TUMOR-S-S-VHCH1VL-S-S-6263雙特異性抗體63雙特異性抗體63641.高效的表達(dá)、篩選抗體的體系

將表型（與抗原特異結(jié)合）和基因型（含有片段抗體基因）聯(lián)系起來，使識別抗原的能力與進(jìn)行再擴(kuò)增的能力結(jié)合在一起，可以模擬生物體內(nèi)B細(xì)胞的有關(guān)特性—識別與擴(kuò)增的統(tǒng)一。2.繞過免疫制備全人源性抗體，避免了鼠源性抗體在人體應(yīng)用時誘發(fā)的HAMA等不良反應(yīng)。噬菌體抗體庫技術(shù)的出現(xiàn)及噬菌體抗體的研制成功已成為生命科學(xué)研究的突破性進(jìn)展之一。噬菌體抗體特色641.高效的表達(dá)、篩選抗體的體系噬菌體抗體特色6465

以噬菌體為載體，將抗體基因(Fab或ScFv基因等)與噬菌體編碼的外殼蛋白Ⅲ(cpⅢ)或Ⅷ(cpⅧ)相連，在噬菌體表面以抗體-外殼蛋白融合蛋白的形式表達(dá)；經(jīng)輔助病毒感染后，借助cpⅢ的信號肽穿膜作用，進(jìn)入宿主外周基質(zhì)，在正確折疊后被包裝于噬菌體尾部，隨后攜帶有表達(dá)載體的宿主菌就會釋放出帶有抗體片段的噬菌體顆粒；這種噬菌體抗體可以特異識別抗原，又能感染宿主菌進(jìn)行再擴(kuò)增；采用類似于親和層析原理從噬菌體抗體庫中篩選出特異性抗體。噬菌體抗體基本原理65以噬菌體為載體，將抗體基因(Fab或ScFv基因65661InsertFabgenesintophages2Infectedbacteriamakenewphages3Screenthephagesspecifictotheantigen4Addtheselectedphagesbacktobacteria5PuttheFabontoAbbackbonesPhage-displacecanbeusedinsteadofhybridomas噬菌體抗體661InsertFabgenesintopha6667噬菌體抗體的克隆和表達(dá)antigenantigenRepertoireofdiversesequencesdisplayedonphageIncubationofphage-displayedrepertoirewithantigenEliminationofunboundphageElutionofboundphageSelectionofligandsfromphage-displaylibraries67噬菌體抗體的克隆和表達(dá)antigenantigenRep6768

噬菌體抗體庫技術(shù)的產(chǎn)生主要依賴于三項實驗技術(shù)的發(fā)展：1.PCR技術(shù)的發(fā)展使人們可以用一組引物克隆出全套Ig

的可變區(qū)基因。目前已設(shè)計出了多套擴(kuò)增VH和VL基因的引物。2.從大腸桿菌內(nèi)分泌有結(jié)合功能的Ig分子片段獲得成功。這一成功說明了用抗體庫在原核細(xì)胞篩選特異性抗體的可行性。噬菌體抗體68噬菌體抗體庫技術(shù)的產(chǎn)生主要依賴于三項實驗技術(shù)的發(fā)68693.有效的篩選系統(tǒng)（噬菌體表面表達(dá)技術(shù)）的建立將肽鏈通過與單鏈?zhǔn)删w外殼蛋白（pⅢ或pⅧ）融合表達(dá)在絲狀噬菌體（fd、M13）的表面，利用其可以再擴(kuò)增的特性，將靶分子固定化，通過親和篩選-洗脫-擴(kuò)增，可篩選到靶分子的配體肽鏈或Fab段。

兩種絲狀噬菌體呈現(xiàn)系統(tǒng)，外殼蛋白cpIII系統(tǒng)及cpVII系統(tǒng)。其中cpVIII系統(tǒng)是一種多價選擇系統(tǒng),可同時呈現(xiàn)多達(dá)2O00拷貝/噬菌體的多拷貝結(jié)合蛋白，因而可以大大提高親和力較低的抗體片段的整體親和性，更有利于篩選得到陽性克隆cpIII產(chǎn)物僅約4拷貝／噬菌體，為單價選擇系統(tǒng)，因而篩選獲得的抗體親和力一般較高。噬菌體抗體693.有效的篩選系統(tǒng)（噬菌體表面表達(dá)技術(shù)）的建立噬菌體抗6970篩選技術(shù)的發(fā)展篩選抗細(xì)胞表面抗原抗體抗原陰性細(xì)胞（antigen-negativecell）作為非特異性噬菌體的吸附體

e.g.以人血細(xì)胞Rh(D)+為靶細(xì)胞，Rh(D)-為非特異性噬菌體吸附體，從而成功地從Fab噬菌體抗體庫中篩選出一系列的抗Rh(D)抗體。噬菌體抗體的克隆和表達(dá)70篩選技術(shù)的發(fā)展噬菌體抗體的克隆和表達(dá)7071高親和力抗體的獲得

1.模擬體內(nèi)親和力成熟的過程定點突變、模擬體內(nèi)過程，先造成大量的隨機(jī)突變，再經(jīng)抗原選擇、在致突變株體內(nèi)進(jìn)行突變、半隨機(jī)突變法2.鏈更替固定VH基因而置換選擇VL基因選出匹配最好的高親和力的VH—VL組合(親和力提高20倍)

固定H3—VL基因而置換選擇H1一H2基因(親和力提高15倍)

將H1一H2節(jié)段(庫)與單一H3-VL基因連接(不用接頭)噬菌體抗體的克隆和表達(dá)71高親和力抗體的獲得噬菌體抗體的克隆和表達(dá)7172高親和力抗體的獲得

3.增加抗體庫的多樣性聯(lián)合感染技術(shù)(combinatorialinfection)增加鏈組合105不同的輕鏈、107不同的重鏈，用聯(lián)合感染技術(shù)，經(jīng)CoxP位點使兩鏈在體外有效地組合在同一噬菌體中，這就可以直接分離獲得庫容量為1012的高親和力抗體；提高噬菌粒的包裝滴度和提高細(xì)菌的轉(zhuǎn)化效率、構(gòu)建載體時酶切位點的合理選擇，以及PCR引物的設(shè)計等進(jìn)行。4.分子伴侶輔助噬菌體抗體表達(dá)噬菌體抗體的克隆和表達(dá)72高親和力抗體的獲得噬菌體抗體的克隆和表達(dá)7273應(yīng)用之一：醫(yī)學(xué)微生物學(xué)研究

針對病原微生物的抗體，如HAV、HBV、HCV、HIV、風(fēng)疹病毒、CMV、流感嗜血桿菌和破傷風(fēng)毒素

HIV感染者體內(nèi)抗體水平高而抗病毒反應(yīng)弱？Burton等噬菌體抗體庫（長期無癥狀HIV攜帶者骨髓）－篩選出一批抗HIV胞膜蛋白的特異性抗體中和性抗體識別的是天然構(gòu)象的抗原（病毒顆粒）,非中和性抗體識別的為變性的包膜蛋白(病毒碎片)。抗HIV-1抗體由病毒裂解物中未經(jīng)加工的gp160激發(fā)，與天然構(gòu)象的gp120發(fā)生交叉反應(yīng)，但親和力較低，而且對gp120本身所激發(fā)的抗體反應(yīng)有抑制作用。因此,感染者體內(nèi)抗體滴度雖高卻不能有效地清除病毒顆粒。噬菌體抗體的克隆和表達(dá)73應(yīng)用之一：醫(yī)學(xué)微生物學(xué)研究噬菌體抗體的克隆和表達(dá)7374應(yīng)用之二：自身免疫性疾病的研究

噬菌體抗體庫獲得大量自身抗體

1993～1995年間:IgG類自身抗體有64種（49種噬菌體抗體庫）1996年、Mclntosh等從抗體庫中一次性得到19種抗甲狀腺球蛋白的人單抗。以人自身抗體為探針分析自身免疫疾病患者血清中自身抗體的“表位指紋”(epitopicfingerprint)，有助于了解B細(xì)胞表位和疾病表現(xiàn)之間的關(guān)系。通過分析自身抗體可變區(qū)的編碼基因，能夠了解此類抗體的基因取用規(guī)律。E.g.從橋本氏甲狀腺炎病人頸淋巴結(jié)抗體庫中得到的抗甲狀腺球蛋白抗體基因明顯存在限制性取用，其親和力高低與體細(xì)胞突變水平直接相關(guān)。噬菌體抗體的克隆和表達(dá)74應(yīng)用之二：自身免疫性疾病的研究噬菌體抗體的克隆和表達(dá)7475應(yīng)用之三：腫瘤研究

利用腫瘤相關(guān)抗原或腫瘤特異性抗原篩選噬菌體抗體庫,能夠得到特異性人單抗，并有助于腫瘤的診斷和治療。癌胚抗原(CEA)的特異性ScFv，親和力提高了10倍。

c-erbB-2人單鏈抗體可用于腫瘤打靶。噬菌體抗體的克隆和表達(dá)75應(yīng)用之三：腫瘤研究噬菌體抗體的克隆和表達(dá)7576應(yīng)用之四：診斷和治療

噬菌體抗體庫技術(shù)與單抗技術(shù)相比，其優(yōu)勢在于能夠制備人單抗；抗體靶向治療是腫瘤治療的一種新而重要的手段；用噬菌體抗體制備的免疫毒素具有良好的穩(wěn)定性；用噬菌體抗體技術(shù)已研制出抗EGFRVⅢ的免疫毒素，其具有高度的特異性及良好的穩(wěn)定性噬菌體抗體的克隆和表達(dá)76應(yīng)用之四：診斷和治療噬菌體抗體的克隆和表達(dá)7677Thankyou!77Thankyou!7778基因工程抗體INSTITUTEFORIMMUNOBIOLOGYDEPARTMENTOFIMMUNOLOGYBoGao,Ph.D.Email:gaobo@Tel:542371542013-9-301基因工程抗體INSTITUTEFORIMMUNOBIO78791888年 Roux/Yersin 白喉外毒素1890年 Behring/Kitasato 抗毒素；血清療法1939年 Tiselius/Kabat g-globulin1959年 Porter Fab、Fc1962年 Edelman H、L1962年 Porter Fab(H+L)、Fc(H)

1975年 Kohler/Milstein McAb1980年 Tonegawa Abdiversity1984年 Sharon Engineeringantibody1989年 Winter/Lerner AntibodyLibraries21888年 Roux/Yersin 白喉外毒素197980EmilvonBehring,

1901,antitoxinsGeoregesKohlerandCesarMilstein,

1984,monoclonalantibodySusumuTonegama,1987,structureofIggeneGeraldEdelmanandRodneyPorter,

1972,structureofantibodyPaulEhrlich,

1908,productionofantibodyNobelPrizewinners3EmilvonBehring,1901,antit8081481825828368384抗體占所有生物技術(shù)藥品的25%2010年440億美元2015年將超過980億美元2011年TOP50的生物藥物14個是抗體藥物，前六位均是抗體藥物抗體相關(guān)信息7抗體占所有生物技術(shù)藥品的25%抗體相關(guān)信息84858858698687108788118889128990139091149192159293抗體的發(fā)展抗血清的制備：19世紀(jì)末，Behring單克隆抗體：1975，Koehler和MilsteinNature1975Aug7;256(5517):495-7Continuousculturesoffusedcellssecretingantibodyofpredefinedspecificity.

基因工程抗體：1984，Sharon

Nature1984May24-30;309(5966):364-7

ExpressionofaVHCkappachimaericproteininmousemyelomacells.16抗體的發(fā)展抗血清的制備：19世紀(jì)末，Behring9394抗血清（多克隆抗體）的制備ForeignproteinsVirusesBacteriaParasitesFungiAntigensBcellBcellactivatedHumoralresponsePlasmacellssecreteantibodies+THcellAntigen+Vertebratebody17抗血清（多克隆抗體）的制備Foreignprotein9495多克隆抗血清對健康人用疫苗進(jìn)行主動免疫，免疫前（a）和免疫后10天（b）分別采血并對血清蛋白進(jìn)行凝膠電泳分析。免疫前血清中的球蛋白條帶較寬，免疫之后則相對集中。Bruton氏病患者血清蛋白中的球蛋白條帶缺失（c）。a1a2bg白蛋白球蛋白（c）（a）（b）18多克隆抗血清對健康人用疫苗進(jìn)行主動免疫，免疫前（a）和免9596小鼠體系：半衰期短、HAMA大鼠體系：單抗腹水比小鼠高10倍，易親合層析人體系：人－鼠雜交瘤、人－人雜交瘤

單克隆抗體的制備19小鼠體系：半衰期短、HAMA單克隆抗體的制備9697209798

雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)DNA合成的途徑：氨基喋呤(Aminopterin,A)糖+氨基酸核苷酸胸腺嘧啶核苷(Thymidine,T)TKTMP次黃嘌呤IMPHGPRT核苷酸前體DNA(Hypoxanthine,H)21雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)DNA合成的途徑：氨基喋呤(Am9899融合后細(xì)胞在HAT培養(yǎng)基中存活情況脾細(xì)胞〔HGPRT+,TK+,不能長期生長〕骨髓瘤細(xì)胞〔HGPRT-,TK-，不能生長〕雜交瘤細(xì)胞〔HGPRT+,TK+，能夠生長〕22融合后細(xì)胞在HAT培養(yǎng)基中存活情況99100蛇毒單抗的制備23蛇毒單抗的制備10010124101102鼠源單克隆抗體的應(yīng)用基礎(chǔ)研究細(xì)胞抗原研究及鑒定分類細(xì)胞受體研究分子克隆及功能研究醫(yī)學(xué)研究及診斷感染性疾病診斷腫瘤診斷及預(yù)后判斷其它診斷及研究不足：半衰期短、人抗鼠抗體反應(yīng)（HAMA）25鼠源單克隆抗體的應(yīng)用基礎(chǔ)研究細(xì)胞抗原研究及鑒定分類細(xì)胞受102103

將制備單抗的細(xì)胞工程技術(shù)與生產(chǎn)重組分子的基因工程技術(shù)和蛋白質(zhì)工程技術(shù)結(jié)合起來，對編碼抗體的基因按不同需要進(jìn)行加工改造和重新組裝，轉(zhuǎn)染適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞后表達(dá)出抗體分子，這種經(jīng)基因重組的抗體稱為基因工程抗體?；蚬こ炭贵w概念26將制備單抗的細(xì)胞工程技術(shù)與生產(chǎn)重組分子的基因工程1031041.從雜交瘤或免疫脾細(xì)胞、外周血淋巴細(xì)胞等提取mRNA

逆轉(zhuǎn)錄成cDNA2.PCR分別擴(kuò)增出抗體的重鏈及輕鏈基因3.構(gòu)建表達(dá)載體4.在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中表達(dá)并折疊成有功能的抗體分子5.篩選出高表達(dá)細(xì)胞株6.親和層折等手段純化抗體片段基因工程抗體基本原理271.從雜交瘤或免疫脾細(xì)胞、外周血淋巴細(xì)胞等提取mRNA104105基因工程抗體人源化(Humanization)抗體28基因工程抗體人源化(Humanization)抗體105106Humanization

（Chimeric/ReshapedAntibody)Constantregion(Fc)MouseantibodyAntigen-bindingregion(Fab)Antigen-bindingregionsfrommouseSpecifivantigen-bindingsitesfrommouseChimericantibody(66%)Fullyhuamnantibody(100%)Humanizedantibody(90%)29Humanization（Chimeric/Resha106107FR：為CDR的構(gòu)象提供環(huán)境；參與抗體結(jié)合位點正確構(gòu)象的形成；簡單的CDR移植會喪失或降低原親本抗體的親和力方法：模板替換 較大同源性人FR替換鼠FR

表面重塑 對鼠CDR及FR表面殘基鑲飾或重飾－類似人補(bǔ)償變換 CDR移植后更換部分的人FR－鼠定位保留 以人FR保守序列為模板進(jìn)行人源化

人源化抗體的構(gòu)建策略30FR：為CDR的構(gòu)象提供環(huán)境；參與抗體結(jié)合位點正確構(gòu)象的107108從同源抗體或抗體的共同序列中選擇人源FR確定在FR中起關(guān)鍵作用的氨基酸以鼠單抗可變區(qū)的立體模型作指導(dǎo)人源化抗體的構(gòu)建策略關(guān)鍵目標(biāo)保持抗體的親和力降低免疫原性31從同源抗體或抗體的共同序列中選擇人源FR人源化抗體的構(gòu)建108109

從分泌某種鼠單抗的雜交瘤細(xì)胞基因組中分離并鑒定出重排的功能性V區(qū)基因，并與人抗體C區(qū)基因按一定的方式重組，克隆到表達(dá)載體中構(gòu)建鼠－人嵌合的輕重鏈基因表達(dá)載體，再轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞表達(dá)，經(jīng)篩選后制備成特異性的嵌合抗體。人－鼠嵌合抗體概念32從分泌某種鼠單抗的雜交瘤細(xì)胞基因組中分離109110PCR鼠抗體基因人抗體基因VLCLVHCH1CH2CH3VLCLVHCH1CH2CH3嵌合輕鏈嵌合重鏈IgG33PCR鼠抗體基因人抗體基因VLCLVH110111人－鼠嵌合抗體特點完全保留鼠單抗的特異性和親和力降低了HAMA不良反應(yīng)一定的免疫原性，V區(qū)完全鼠源性34人－鼠嵌合抗體特點完全保留鼠單抗的特異性和親和力降低111112改型抗體

抗體分子輕、重鏈可變區(qū)的6個CDR形成CDR平面直接接觸抗原，決定了抗體的特異性，骨架區(qū)只是作為支持CDR襻的支架，而且其立體構(gòu)象極為保守。因此，將鼠單抗的CDR移植到人單抗的骨架區(qū)上，有可能使人單抗獲得鼠單抗的特異性，并最大限度地減少鼠單抗的異源性，僅有9%的序列來源于親本鼠單抗，這種CDR移植的人單抗稱為改型抗體。35改型抗體抗體分子輕、重鏈可變區(qū)的6個CDR形成CDR112113CDR序列CDR序列鼠單克隆抗體人抗體人源化抗體（改型抗體）鼠單克隆V區(qū)人源化（CDR移植）36CDR序列CDR序列鼠單克隆抗體人抗體人源化抗體（113114治療性抗體的開發(fā)幾經(jīng)反復(fù)終于形成蓬勃發(fā)展-——鼠單抗人源化的技術(shù)功不可沒。

鼠單抗人源化時基本選擇IgG同種型，在體內(nèi)IgG與存在于內(nèi)皮細(xì)胞表面的受體FcRn相互作用，在細(xì)胞內(nèi)受到保護(hù)不被降解而具有較長的半衰期。同時鼠IgG通過激活補(bǔ)體和結(jié)合Fc受體激發(fā)一系列生物效應(yīng)功能的效率較低，無論是嵌合抗體還是改型抗體均通過使用人恒定區(qū)克服了這一缺陷。人源化抗體的評價37治療性抗體的開發(fā)幾經(jīng)反復(fù)終于形成蓬勃發(fā)展-——鼠單抗人源114115對于人源化的最主要的初衷，消除異源性的評價卻要復(fù)雜的多。除了降低抗體分子的鼠源序列外，其免疫原性還受到其它因素如給予抗體的途徑和劑量、病人的病情和免疫狀況、抗體所針對的抗原的特性和部位以及抗體本身激活生物學(xué)效應(yīng)的特性等均相關(guān)，因此應(yīng)該綜合考慮。人源化抗體的評價38對于人源化的最主要的初衷，消除異源性的評價卻要復(fù)雜的多。115116不同種屬之間抗體分子可變區(qū)的差別遠(yuǎn)低于恒定區(qū)的差別；構(gòu)建改型抗體要比構(gòu)建嵌合抗體的工作量大的多，還常常導(dǎo)致親和力不同程度的降低，付出親和力和增加研制成本的代價是否值得的問題。人源化抗體的評價改型抗體相對于嵌合抗體的優(yōu)越性存在質(zhì)疑：39不同種屬之間抗體分子可變區(qū)的差別遠(yuǎn)低于恒定區(qū)的差別；人源116117應(yīng)當(dāng)制備配對的改型和嵌合抗體，用于足夠量的可比較的人群，觀察其誘發(fā)抗抗體的生成情況，這是難以做到的。迄今大量臨床應(yīng)用的情況揭示其他影響免疫原性的因素值得重視，因此一味追求序列的同源性而摒棄嵌合抗體是值得商榷的。事實上即使完全人源化的抗體也可以誘發(fā)抗獨特型抗體，并不可能完全消除治療性抗體的免疫原性，而這種抗獨特型反應(yīng)的后果如何待進(jìn)一步觀察。人源化抗體的評價欲確切評判人源化對免疫原性的影響：40應(yīng)當(dāng)制備配對的改型和嵌合抗體，用于足夠量的可比較的人群，117118V區(qū)片斷，1/3～1/80，具有與抗原結(jié)合的功能種類：Fab抗體單鏈抗體（ScFv）

Fv片斷抗體單域抗體SDAb

最小識別單位MRU小分子抗體41V區(qū)片斷，1/3～1/80，具有與抗原結(jié)合的功能小分子抗118119(1)小分子抗體42(1)小分子抗體119120組成：由重鏈V區(qū)及CH1功能區(qū)與輕鏈二硫鍵連接，50KD，為完整IgG的1/3。應(yīng)用前景：較好的滲透性和藥代動力學(xué)特征

HAMA反應(yīng)存在親和力較低、穩(wěn)定性差Fab抗體43組成：由重鏈V區(qū)及CH1功能區(qū)與輕鏈二硫鍵連接，50KD120121將抗體分子的重鏈V區(qū)和CH1功能區(qū)的cDNA與輕鏈完整的cDNA序列重組并克隆到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中在大腸桿菌等宿主細(xì)胞中表達(dá)整個制備過程包括Fab抗體基因的擴(kuò)增，表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)及產(chǎn)物鑒定基因工程手段構(gòu)建Fab抗體的原理44將抗體分子的重鏈V區(qū)和CH1功能區(qū)的cDNA與輕鏈完整的121122Fab抗體基因的擴(kuò)增方法Fab基因擴(kuò)增的方法主要有二種：

采用PCR技術(shù)直接從基因組中擴(kuò)增，但這種方法不確定的影響因素較多。通過RT-PCR技術(shù)從cDNA中擴(kuò)增

兩種方法成功的關(guān)鍵均取決于PCR引物的設(shè)計。不同F(xiàn)ab抗體引物的設(shè)計有所不同，但一般均使用同源性較高的序列，其中5’端的引物必須包含克隆位點，3’端的引物除克隆位點外還應(yīng)含有翻譯終止信號。45Fab抗體基因的擴(kuò)增方法Fab基因擴(kuò)增的方法主要有二種：122123免疫球蛋白基因載體的構(gòu)建H鏈表達(dá)載體L鏈表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞PrVHCH1PrVLCLFab抗體分子的制備Fab抗體46免疫球蛋白H鏈表達(dá)載體L鏈表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞Pr123124抗體分泌細(xì)胞VHVLCL-S-S-CH1Fab抗體分子的制備Fab抗體47抗體分泌細(xì)胞VHVLCL-S-S-CH1Fab抗體分子124125單鏈抗體（ScFv）組成特點VH和VL通過連接肽重組表達(dá)分子量小、穿透力強(qiáng)、體內(nèi)循環(huán)半衰期短、免疫原性低可作為其它抗體的基本元件48單鏈抗體（ScFv）組成特點VH和VL通過連接肽125126

單鏈抗體基因的構(gòu)建一般采用從雜交瘤細(xì)胞提取mRNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，通過PCR擴(kuò)增其VL及VH基因，再用人工合成的寡核苷酸序列即接頭把VL的C端與VH的N端或VH的C端與VL的N端連接，即成單鏈抗體基因。

單鏈抗體（ScFv）構(gòu)建方法49單鏈抗體基因的構(gòu)建一般采用從雜交瘤細(xì)胞提取mRN126127VHVL接頭DNA(Gly4Ser)3VH引物PCRVH接頭DNA酶切、克隆ScFv(singlechainFv,scFv)的構(gòu)建變性、復(fù)性VL引物VL單鏈抗體（ScFv）50VH127128單鏈ScFv：抗原含重復(fù)抗原決定簇時，親和力下降8倍以上雙價ScFv：改善ScFv的親和活性雙特異性ScFv：與細(xì)胞因子IL-2、TNF相連：特異性殺傷應(yīng)用前景51單鏈ScFv：抗原含重復(fù)抗原決定簇時，親和力下降8倍以上128129保持抗體的可溶性接頭：長度、V區(qū)空間結(jié)構(gòu)組成單域抗體一個VH或VL功能結(jié)構(gòu)域特點分子量小Ig分子的1/12、抗原性弱、穿透力強(qiáng)抗原性弱、相對較粘（疏水面的暴露有關(guān)。在全抗體分子中，疏水面被VL遮蓋）細(xì)菌LPS的單域抗體在雜交瘤細(xì)胞中的表達(dá)量比親本單克隆抗體高50倍以上設(shè)計原則52保持抗體的可溶性組成單域抗體一個VH或VL功能結(jié)構(gòu)域129130最小識別單位(minimalrecognitionunit,MRU)組成高多變區(qū)多肽（hypervariableregionpolypeptides,HRP）一個CDR多肽特點設(shè)計原理應(yīng)用16－30氨基酸、抗原性弱、穿透力強(qiáng)非特異性吸附每個CDR的作用不同尋找在抗原識別和親和力方面有重要意義的CDR抗血小板纖維蛋白原受體CDR3，抑制纖維蛋白原、PACI與血小板的結(jié)合 53最小識別單位(minimalrecognitionu130131傳統(tǒng)單抗分子量大，穿透力弱基因工程小分子抗體穿透力強(qiáng)，親和力低多價微型抗體 雙鏈抗體（diabody） 雙特異性抗體（bispecificantibody） 微型抗體（minibody） 三鏈抗體（triabody） 四鏈抗體（tetrabody）多價微型抗體54傳統(tǒng)單抗分子量大，穿透力弱多價微型抗體131132VL－VH－CH380kD易于構(gòu)建及生產(chǎn)血中停留時間長靶部位吸收好

CH3-dimerizedscFVCH3CH3微型抗體55VL－VH－CH3CH3-dimerizedscF132133LD型LDLEPKSCDKTHTCPPCGGGSSGGGSGFlex型連接肽序列VHVLVHVLCH356LD型LEPKSCDKTHTCPPCGGGSSGGGSG133134價肽取決于連接肽段所形成的聚合物特性多價ScFv與單價ScFv和Fab片斷相比，與靶抗原結(jié)合的功能親和力提高四鏈抗體4helix-stabilizedscFvtetramers57價肽取決于連接肽段所形成的聚合物特性多價ScFv與單價S134135Leucine-zipperstabilizedscFvdimersHelix-stabilizedscFvdimers4helix-stabilizedscFvtetramersStreptavidin-scFvscFvfusionswithdi-andmultimeriaztiondomains58Leucine-zipperstabilizedsc135136雙鏈抗體的分子量為60KD左右，三鏈抗體為90KD左右，二者均顯著大于ScFv單體的分子量(約30KD)。因而在體內(nèi)應(yīng)用多價微抗時，可以降低抗體在循環(huán)中的清除速度，但這種優(yōu)勢也可能因穿透能力的降低而抵消。雙鏈抗體和三鏈抗體的較短接頭不易被蛋白酶水解，而單價ScFv的較長接頭卻易被水解。多價ScFv與單價ScFv和Fab片段比較，最突出的特點是與靶抗原結(jié)合的功能親合力提高。ScFv多聚體能同時結(jié)合幾個靶抗原，也可多價結(jié)合于癌細(xì)胞的表面，因而具有較高的親和力。單鏈抗體、雙鏈抗體、三鏈抗體及多價抗體的比較59雙鏈抗體的分子量為60KD左右，三鏈抗體為90KD左右，136137

人-鼠嵌合抗體 鼠源V區(qū)或Fab 15025%~30%

人源C區(qū)或Fc改型抗體 以鼠源CDR 15015%

替換人源CDR雙特異性抗體 異源性H2/L2 150－小分子抗體Fab 完整L和部分H 50 15％Fv VH和VL 25 15％單鏈抗體 VH-連接肽-VL 26 15％單域抗體 VH 12.5 7.5％最小識別單位 單一CDR 2 1.5％基因工程抗體的種類及其特性種類基本結(jié)構(gòu)相對分子量（kD）鼠源性成分60

人-鼠嵌合抗體 鼠源V區(qū)或Fab 137138BsAb，兩個不同的VL和VH－兩個不同的抗原結(jié)合位點雙特異性抗體61BsAb，兩個不同的VL和VH－兩個不同的抗原結(jié)合位點雙138139CTLCD3TUMORCELL-S-S-VHCH1VL-S-S-CH1抗原A抗原B雙特異性抗體62CTLCD3TUMOR-S-S-VHCH1VL-S-S-139140雙特異性抗體63雙特異性抗體1401411.高效的表達(dá)、篩選抗體的體系

將表型（與抗原特異結(jié)合）和基因型（含有片段抗體基因）聯(lián)系起來，使識別抗原的能力與進(jìn)行再擴(kuò)增的能力結(jié)合在一起，可以模擬生物體內(nèi)B細(xì)胞的有關(guān)特性—識別與擴(kuò)增的統(tǒng)一。2.繞過免疫制備全人源性抗體，避免了鼠源性抗體在人體應(yīng)用時誘發(fā)的HAMA等不良反應(yīng)。噬菌體抗體庫技術(shù)的出現(xiàn)及噬菌體抗體的研制成功已成為生命科學(xué)研究的突破性進(jìn)展之一。噬菌體抗體特色641.高效的表達(dá)、篩選抗體的體系噬菌體抗體特色141142

以噬菌體為載體，將抗體基因(Fab或ScFv基因等)與噬菌體編碼的外殼蛋白Ⅲ(cpⅢ)或Ⅷ(cpⅧ)相連，在噬菌體表面以抗體-外殼蛋白融合蛋白的形式表達(dá)；經(jīng)輔助病毒感染后，借助cpⅢ的信號肽穿膜作用，進(jìn)入宿主外周基質(zhì)，在正確折疊后被包裝于噬菌體尾部，隨后攜帶有表達(dá)載體的宿主菌就會釋放出帶有抗體片段的噬菌體顆粒；這種噬菌體抗體可以特異識別抗原，又能感染宿主菌進(jìn)行再擴(kuò)增；采用類似于親和層析原理從噬菌體抗體庫中篩選出特異性抗體。噬菌體抗體基本原理65以噬菌體為載體，將抗體基因(Fab或ScFv基因1421431InsertFabgenesintophages2Infectedbacteriamakenewphages3Screenthephagesspecifictotheantigen4Addtheselectedphagesbacktobacteria5PuttheFabontoAbbackbonesPhage-displacecanbeusedinsteadofhybridomas噬菌體抗體661InsertFabgenesintopha143144噬菌體抗體的克隆和表達(dá)antigenantigenRepertoireofdiversesequencesdisplayedonphageIncubationofphage-displayedrepertoirewithantigenEliminationofunboundphageElutionofboundphageSelectionofligandsfromphage-displaylibraries67噬菌體抗體的克隆和表