間接免疫熒光法測ANA-課件

間接免疫熒光法

檢測抗核抗體（ANA）制作人：XXX20XX-XX-XX間接免疫熒光法

檢測抗核抗體（ANA）制作人：XXX1抗核抗體【自身抗體】：指抗自身組織、器官、細胞及其成分的抗體【ANA】：指抗細胞核成分（DNA，RNA，蛋白質(zhì)和酶）的抗體。ANA存在一個譜ANA新概念：抗核酸（Nucleicacid）和核蛋白（Nucleoprotein）抗體的總稱某些核抗原成分在核仁和胞漿內(nèi)比核質(zhì)內(nèi)更豐富抗核抗體【自身抗體】：指抗自身組織、器官、細胞及其成分的抗體2ANA檢測的意義有助于疾病的診斷如抗Sm是SLE標記抗體；抗ScL-70是SD的標記抗體；抗Jo-1是PM/DM的標記抗體；觀察疾病活動度和治療反應研究發(fā)病機理ANA檢測的意義有助于疾病的診斷3【ANA分類】抗DNA（dsDNA,ssDNA)抗組蛋白（Histone)抗非組蛋白（Nonhistone,ExtractableNuclearAntigen,ENA）抗核仁（Nucleolus）【ANA分類】抗DNA（dsDNA,ssDNA)4幾種ENA的由來及同義詞Sm：病人名：SmithRNP:u1RNP或nRNPNuclearRibonucleoproteinSSA:ROSjogren’ssyndromeASSB:La,Ha,Sjogren’ssyndromeBJo-1:病人JohnScL-70:Scleroderma幾種ENA的由來及同義詞Sm：病人名：Smith5【ANA由來】中性粒細胞DNP(DNA-Histone)+抗DNP+補體均質(zhì)體LE細胞LE細胞：并非SLE特有，PM、SD、RA、SS等結(jié)締組織病，藥物過敏，慢活肝等亦可陽性。抗DNP取代LE細胞的檢測+【ANA由來】中性粒細胞DNP(DNA-Histone)6ANA的篩選：間接免疫熒光法++抗原抗體（血清）抗原—抗體第二抗體ANA的篩選：間接免疫熒光法++抗原抗體（血清）抗原—抗體第7ANA的篩選：間接免疫熒光法ANA的篩選：間接免疫熒光法8實驗原理：生物薄膜載片上的IgA、IgG、IgM類特異性抗體可以與抗核抗原反應；隨后，結(jié)合抗體可與標記熒光的二抗進行反應，并可在熒光顯微鏡下觀察。實驗原理：生物薄膜載片上的IgA、IgG、IgM類特異性抗體9抗原人特異性抗體FITC標記的抗人抗體FITC

FITC載片實驗原理：抗原人特異性抗體FITC標記的抗人抗體FITCFITC載片10生物薄片馬賽克TM技術(shù)生物薄片馬賽克TM技術(shù)11【實驗步驟】【實驗步驟】12實驗步驟一：準備檢查加樣板是否反應區(qū)親水而周邊疏水？如果不是，可用濕紙巾擦拭，必要時可使用家用洗滌劑，再用水徹底沖洗。需要消毒時，可于3％的SekuseptExtra（漢高公司）中浸泡1小時。只有當載片平衡到室溫后方可打開袋子。不要觸及生物薄片。按照要求用記號筆對玻片進行標記。實驗步驟一：準備檢查加樣板是否反應區(qū)親水而周邊疏水？如果不是13實驗步驟二：樣品準備1:100稀釋血清標本。每次實驗均需加入陽性和陰性對照。對照血清使用前必須混勻。實驗步驟二：樣品準備1:100稀釋血清標本。每次實驗均需加入14實驗步驟三：加樣在加樣板的每個反應區(qū)加入稀釋血清，避免產(chǎn)生氣泡。滴加完所有待測標本后才開始溫育。使用聚苯乙烯加樣板。加樣體積:25μl/反應區(qū)(5x5mm)12345樣品1樣品2樣品3陽性對照陰性對照實驗步驟三：加樣在加樣板的每個反應區(qū)加入稀釋血清，避免產(chǎn)生氣15實驗步驟四：孵育將載片蓋在加樣板對應的凹槽里，反應即開始。確保每個標本均能夠與生物薄片相接觸，而標本之間不相互接觸。室溫（18-25℃）溫育30分鐘。實驗步驟四：孵育將載片蓋在加樣板對應的凹槽里，反應即開始。確16實驗步驟五：沖洗用燒杯盛PBS-Tween緩沖液，流水沖洗載片，然后立即放入裝有PBS-Tween緩沖液的小杯中浸洗至少5分鐘。實驗步驟五：沖洗用燒杯盛PBS-Tween緩沖液，流水沖洗17實驗步驟六：加樣

將20μl熒光標記的抗人球蛋白（熒光二抗）加入潔凈加樣板的每個反應區(qū)。完全加完所有的二抗后，方可繼續(xù)溫育（最多可加50個載片）。建議使用連續(xù)加樣器。加樣前應使用加樣器混勻。為節(jié)約時間，可在第一步溫育的同時滴加酶結(jié)合物至另一個加樣板的反應區(qū)中。實驗步驟六：加樣將20μl熒光標記的抗人球蛋白（熒光二抗）18實驗步驟七：孵育從PBS-Tween清洗緩沖液中取出一張載片，5秒鐘內(nèi)用吸水紙擦一下背面和邊緣后，立即將載片覆有生物薄片的一面朝下，蓋在加樣板的凹槽里。注意：為防止破壞基質(zhì)，不要擦拭反應區(qū)的間隙。檢查生物薄片是否與液滴接觸良好，然后繼續(xù)下一張。從現(xiàn)在開始，注意避免陽光直射載片。室溫溫育30分鐘。實驗步驟七：孵育從PBS-Tween清洗緩沖液中取出一張19實驗步驟八：沖洗用燒杯盛PBS-Tween緩沖液，流水沖洗載片，然后立即放入裝有PBS-Tween緩沖液的小杯中浸洗至少5分鐘?？稍诿?50ml磷酸鹽緩沖液中加10滴(150μl)伊文氏藍進行復染。實驗步驟八：沖洗用燒杯盛PBS-Tween緩沖液，流水沖洗載20實驗步驟九：封片在蓋玻片上滴加甘油/PBS。封片體積:10μl/反應區(qū)(5x5mm)從PBS-Tween清洗緩沖液中取出一張載片，用紙擦干背面和四邊，注意不要擦拭反應區(qū)間隙。將載片的生物薄片朝下置于準備好的蓋玻片上，立即檢查蓋玻片是否放入載片的凹槽里，如有必要，需調(diào)整位置，正確放置。然后再進行下一個載片的操作。實驗步驟九：封片在蓋玻片上滴加甘油/PBS。21實驗步驟十：結(jié)果判斷熒光顯微鏡下觀察熒光。實驗步驟十：結(jié)果判斷熒光顯微鏡下觀察熒光。22結(jié)果判讀：熒光顯微鏡下觀察

細胞核發(fā)黃綠色熒光為陽性染色細胞，不發(fā)熒光為陰性。抗原片中出現(xiàn)陽性染色細胞為ANA陽性，否則為陰性。陽性待檢血清可作進一步稀釋后測定效價。結(jié)果判讀：熒光顯微鏡下觀察23【均質(zhì)型】

細胞核呈均勻一致的熒光

【均質(zhì)型】

細胞核呈均勻一致的熒光

24【核仁型】

核仁部分呈現(xiàn)熒光【核仁型】

核仁部分呈現(xiàn)熒光25【斑點型】(顆粒型)

細胞核內(nèi)呈現(xiàn)斑點狀熒光【斑點型】(顆粒型)

細胞核內(nèi)呈現(xiàn)斑點狀熒光26【胞漿型】【胞漿型】27【著絲點型】【著絲點型】28

混合型：存在兩種以上的類型

混合型：存在兩種以上的類型

混合型：存在兩種以上的類型

混合型：存在兩種以上的類型29ANA結(jié)果判斷1：100陰性陰性，標本中未檢測到抗核抗體1：100陽性微量對于核均質(zhì)性、著絲點、核點型等熒光模式，提示某種風濕性疾病或其他疾病1：320陽性陽性提示某種風濕病或其他疾病滴度定義：與相同稀釋倍數(shù)的陰性血清相比，能觀察到特異性熒光反應的最高稀釋度ANA結(jié)果判斷1：100陰性陰性，標本中未檢測到抗核抗體130【臨床意義】總的ANA檢測在臨床診斷與鑒別診斷中是一個極為重要的篩選試驗。絕大多數(shù)自身免疫性疾病均可呈陽性。ANA陽性者進一步檢測各亞類ANA抗體對明確診斷、臨床分型、病情觀察、預后及治療評價有重要意義。未經(jīng)治療的、活動性SLE的陽性率為80%－100%。藥物性狼瘡100%、全身硬皮病、混合性結(jié)綈組織病、狼瘡性肝炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化等。干燥綜合癥（SS）、類風關、橋本甲狀腺炎等。【臨床意義】31活動性SLE

（95-100%）非活動性SLE

（80-100%）藥物誘導的紅斑狼瘡 （100%）混合結(jié)締組織病 （100%）類風濕關節(jié)炎 （20-40%）其他風濕性疾病 （20-50%）進行性系統(tǒng)硬化癥 （85-95%）多肌炎、皮肌炎 （30-50%）干燥綜合征 （70-80%）慢性活動性肝炎 （30-40%）潰瘍性結(jié)腸炎 （26%）活動性SLE （95-1032ThankYou!ThankYou!33docin/sanshengshiyuandoc88/sanshenglu

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檢測抗核抗體（ANA）制作人：XXX20XX-XX-XX間接免疫熒光法

檢測抗核抗體（ANA）制作人：XXX35抗核抗體【自身抗體】：指抗自身組織、器官、細胞及其成分的抗體【ANA】：指抗細胞核成分（DNA，RNA，蛋白質(zhì)和酶）的抗體。ANA存在一個譜ANA新概念：抗核酸（Nucleicacid）和核蛋白（Nucleoprotein）抗體的總稱某些核抗原成分在核仁和胞漿內(nèi)比核質(zhì)內(nèi)更豐富抗核抗體【自身抗體】：指抗自身組織、器官、細胞及其成分的抗體36ANA檢測的意義有助于疾病的診斷如抗Sm是SLE標記抗體；抗ScL-70是SD的標記抗體；抗Jo-1是PM/DM的標記抗體；觀察疾病活動度和治療反應研究發(fā)病機理ANA檢測的意義有助于疾病的診斷37【ANA分類】抗DNA（dsDNA,ssDNA)抗組蛋白（Histone)抗非組蛋白（Nonhistone,ExtractableNuclearAntigen,ENA）抗核仁（Nucleolus）【ANA分類】抗DNA（dsDNA,ssDNA)38幾種ENA的由來及同義詞Sm：病人名：SmithRNP:u1RNP或nRNPNuclearRibonucleoproteinSSA:ROSjogren’ssyndromeASSB:La,Ha,Sjogren’ssyndromeBJo-1:病人JohnScL-70:Scleroderma幾種ENA的由來及同義詞Sm：病人名：Smith39【ANA由來】中性粒細胞DNP(DNA-Histone)+抗DNP+補體均質(zhì)體LE細胞LE細胞：并非SLE特有，PM、SD、RA、SS等結(jié)締組織病，藥物過敏，慢活肝等亦可陽性?？笵NP取代LE細胞的檢測+【ANA由來】中性粒細胞DNP(DNA-Histone)40ANA的篩選：間接免疫熒光法++抗原抗體（血清）抗原—抗體第二抗體ANA的篩選：間接免疫熒光法++抗原抗體（血清）抗原—抗體第41ANA的篩選：間接免疫熒光法ANA的篩選：間接免疫熒光法42實驗原理：生物薄膜載片上的IgA、IgG、IgM類特異性抗體可以與抗核抗原反應；隨后，結(jié)合抗體可與標記熒光的二抗進行反應，并可在熒光顯微鏡下觀察。實驗原理：生物薄膜載片上的IgA、IgG、IgM類特異性抗體43抗原人特異性抗體FITC標記的抗人抗體FITC

FITC載片實驗原理：抗原人特異性抗體FITC標記的抗人抗體FITCFITC載片44生物薄片馬賽克TM技術(shù)生物薄片馬賽克TM技術(shù)45【實驗步驟】【實驗步驟】46實驗步驟一：準備檢查加樣板是否反應區(qū)親水而周邊疏水？如果不是，可用濕紙巾擦拭，必要時可使用家用洗滌劑，再用水徹底沖洗。需要消毒時，可于3％的SekuseptExtra（漢高公司）中浸泡1小時。只有當載片平衡到室溫后方可打開袋子。不要觸及生物薄片。按照要求用記號筆對玻片進行標記。實驗步驟一：準備檢查加樣板是否反應區(qū)親水而周邊疏水？如果不是47實驗步驟二：樣品準備1:100稀釋血清標本。每次實驗均需加入陽性和陰性對照。對照血清使用前必須混勻。實驗步驟二：樣品準備1:100稀釋血清標本。每次實驗均需加入48實驗步驟三：加樣在加樣板的每個反應區(qū)加入稀釋血清，避免產(chǎn)生氣泡。滴加完所有待測標本后才開始溫育。使用聚苯乙烯加樣板。加樣體積:25μl/反應區(qū)(5x5mm)12345樣品1樣品2樣品3陽性對照陰性對照實驗步驟三：加樣在加樣板的每個反應區(qū)加入稀釋血清，避免產(chǎn)生氣49實驗步驟四：孵育將載片蓋在加樣板對應的凹槽里，反應即開始。確保每個標本均能夠與生物薄片相接觸，而標本之間不相互接觸。室溫（18-25℃）溫育30分鐘。實驗步驟四：孵育將載片蓋在加樣板對應的凹槽里，反應即開始。確50實驗步驟五：沖洗用燒杯盛PBS-Tween緩沖液，流水沖洗載片，然后立即放入裝有PBS-Tween緩沖液的小杯中浸洗至少5分鐘。實驗步驟五：沖洗用燒杯盛PBS-Tween緩沖液，流水沖洗51實驗步驟六：加樣

將20μl熒光標記的抗人球蛋白（熒光二抗）加入潔凈加樣板的每個反應區(qū)。完全加完所有的二抗后，方可繼續(xù)溫育（最多可加50個載片）。建議使用連續(xù)加樣器。加樣前應使用加樣器混勻。為節(jié)約時間，可在第一步溫育的同時滴加酶結(jié)合物至另一個加樣板的反應區(qū)中。實驗步驟六：加樣將20μl熒光標記的抗人球蛋白（熒光二抗）52實驗步驟七：孵育從PBS-Tween清洗緩沖液中取出一張載片，5秒鐘內(nèi)用吸水紙擦一下背面和邊緣后，立即將載片覆有生物薄片的一面朝下，蓋在加樣板的凹槽里。注意：為防止破壞基質(zhì)，不要擦拭反應區(qū)的間隙。檢查生物薄片是否與液滴接觸良好，然后繼續(xù)下一張。從現(xiàn)在開始，注意避免陽光直射載片。室溫溫育30分鐘。實驗步驟七：孵育從PBS-Tween清洗緩沖液中取出一張53實驗步驟八：沖洗用燒杯盛PBS-Tween緩沖液，流水沖洗載片，然后立即放入裝有PBS-Tween緩沖液的小杯中浸洗至少5分鐘?？稍诿?50ml磷酸鹽緩沖液中加10滴(150μl)伊文氏藍進行復染。實驗步驟八：沖洗用燒杯盛PBS-Tween緩沖液，流水沖洗載54實驗步驟九：封片在蓋玻片上滴加甘油/PBS。封片體積:10μl/反應區(qū)(5x5mm)從PBS-Tween清洗緩沖液中取出一張載片，用紙擦干背面和四邊，注意不要擦拭反應區(qū)間隙。將載片的生物薄片朝下置于準備好的蓋玻片上，立即檢查蓋玻片是否放入載片的凹槽里，如有必要，需調(diào)整位置，正確放置。然后再進行下一個載片的操作。實驗步驟九：封片在蓋玻片上滴加甘油/PBS。55實驗步驟十：結(jié)果判斷熒光顯微鏡下觀察熒光。實驗步驟十：結(jié)果判斷熒光顯微鏡下觀察熒光。56結(jié)果判讀：熒光顯微鏡下觀察

細胞核發(fā)黃綠色熒光為陽性染色細胞，不發(fā)熒光為陰性?？乖谐霈F(xiàn)陽性染色細胞為ANA陽性，否則為陰性。陽性待檢血清可作進一步稀釋后測定效價。結(jié)果判讀：熒光顯微鏡下觀察57【均質(zhì)型】

細胞核呈均勻一致的熒光

【均質(zhì)型】

細胞核呈均勻一致的熒光

58【核仁型】

核仁部分呈現(xiàn)熒光【核仁型】

核仁部分呈現(xiàn)熒光59【斑點型】(顆粒型)

細胞核內(nèi)呈現(xiàn)斑點狀熒光【斑點型】(顆粒型)

細胞核內(nèi)呈現(xiàn)斑點狀熒光60【胞漿型】【胞漿型】61【著絲點型】【著絲點型】62

混合型：存在兩種以上的類型

混合型：存在兩種以上的類型

混合型：存在兩種以上的類型

混合型：存在兩種以上的類型63ANA結(jié)果判斷1：100陰性陰性，標本中未檢測到抗核抗體1：100陽性微