西安制造國家實(shí)驗(yàn)室申請(qǐng)

實(shí)驗(yàn)22食品氨基酸酸含量的測定實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)：10實(shí)驗(yàn)類型：綜合性實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)?zāi)康臑榱颂岣邔?shí)驗(yàn)課的教學(xué)效果，提高學(xué)生實(shí)驗(yàn)動(dòng)手能力、綜合實(shí)驗(yàn)?zāi)芰σ约皩?shí)際應(yīng)用能力，對(duì)“食品工程專業(yè)”學(xué)生，在原有實(shí)驗(yàn)課的基礎(chǔ)上，開設(shè)“食品氨基酸含量的測定”綜合大實(shí)驗(yàn)。測定氨基酸的方法有甲醛滴定、茚三酮比色、電位滴定、氣相、液相、薄層、離子交換色譜、自動(dòng)分析儀等；本實(shí)驗(yàn)分別使用甲醛滴定（單雙指示劑法）、茚三酮比色和電位滴定等方法測定了醬油中的氨基酸態(tài)氮的含量，即可得出醬油中總氨基酸的含量。通過本實(shí)驗(yàn)，強(qiáng)化學(xué)生動(dòng)手實(shí)踐的能力，為畢業(yè)后能夠更好的使理論知識(shí)應(yīng)用到實(shí)踐中作初步準(zhǔn)備。1.單指示劑甲醛滴定法實(shí)驗(yàn)原理：氨基酸具有酸、堿兩重性質(zhì)，因?yàn)榘被岷?COOH基，而-COOH基顯示酸性，又含有-NH2，-NH2則顯示堿性，由于-COOH基和-NH2的相互作用，使氨基酸成為中性的內(nèi)鹽，當(dāng)加入甲醛溶液時(shí)，-NH2與甲醛結(jié)合，其堿性消失，破壞內(nèi)鹽的存在，就可用堿來滴定-COOH基，以間接方法測定氨基酸的量，反應(yīng)式以三種形式存在。用堿完全中和-COOH基時(shí)的pH值為8.4~9.2。實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備：燒杯、堿式滴定管和滴定臺(tái)等試劑配制1.40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示劑，將甲醛用1NNaOH溶液中和（淡藍(lán)色）;2.0.1%百里酚酞乙醇溶液;3.0.100N

NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液;實(shí)驗(yàn)操作稱取一定量醬油樣品(約含20mg左右的氨基酸)→于燒杯中→加兩滴指示劑→用0.1NNaOH溶液滴定到淡藍(lán)色→加中性甲醛20mL→搖勻→靜置1分鐘→此時(shí)藍(lán)色應(yīng)消失→再用0.1NNaOH溶液滴定至淡藍(lán)色，記錄兩次滴定所消耗的堿液毫升數(shù)。

計(jì)算：氨基酸態(tài)氮=（N×V×0.014×100）/W×100%式中：N：NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液當(dāng)量濃渡；V：NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液消耗的總量(mL)；W：樣品溶液相當(dāng)樣品重量(g)；0.014：氮的毫克當(dāng)量；2.雙指示劑甲醛滴定法實(shí)驗(yàn)原理：與單色法相同，只是在此法中使用了兩種指示劑，從分析結(jié)果看，雙指示劑甲醛滴定法與亞硝酸氮?dú)馊萘糠ǎù朔ú僮鲝?fù)雜，但準(zhǔn)確，不作介紹）相近，單色滴定法稍偏低，主要因?yàn)閱沃甘緞┘兹┑味ǚㄊ且园被崛芤旱膒H值作為中性紅的終點(diǎn)，pH值為7.0，從理論計(jì)算看，雙色滴定法比單色滴定法準(zhǔn)確。實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備：同單指試劑滴定相同。試劑配制1.三種試劑同單指示劑法；2.0.1％中性紅(50％乙醇溶液)；實(shí)驗(yàn)操作取相同兩份醬油樣品→分別于100mL燒杯中→一份加中性紅2滴→用0.1NNaOH滴定終點(diǎn)（由紅變琥珀色），記錄用量；另一份加百里酚酞乙醇液3滴加中性甲醛20mL→搖勻→用0.1NNaOH

滴至淡藍(lán)色。

計(jì)算：氨基酸態(tài)氮=（N×（V2-V1）×0.014×100）/W×10V1：用中性紅為指示劑時(shí)，堿液所消耗的體積；V2：用百里酚酞乙醇液為指示劑時(shí)，標(biāo)液消耗量；0.014：氮的毫克當(dāng)量濃度；

注意事項(xiàng)1.單色指示劑甲醛滴定法，用堿完全中和—COOH基時(shí)的pH為8.5~9.5；2.測定時(shí)樣品的顏色較深，應(yīng)加活性炭脫色之后再滴定；3.茚三酮比色法實(shí)驗(yàn)原理：氨基酸在堿性溶液中能與茚三酮作用生成藍(lán)紫色化合物（除脯氨酸外均有此反應(yīng)），可以用吸光光度法測定。反應(yīng)式如下：藍(lán)紫色化合物亮黃色化合物水合茚三酮還原茚三酮該藍(lán)紫色化合物的顏色深淺與氨基酸含量成正比，其最大吸收波長為570nm，故據(jù)此可以測定樣品中氨基酸含量。實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備容量瓶、燒杯、水浴鍋、分光光度計(jì)等試劑配制磷酸緩沖液（pH8.04）制備方法如下：⑴稱磷酸二氫鉀4.5350g。定容500mL；⑵稱Na2HPO4·12H2O11.9380g分別溶解定容500mL；⑶取磷酸二氫鉀10ml與磷酸氫二鈉190ml混合即為pH8.04緩沖液；2.2%茚三酮溶液：稱茚三酮1g→溶于35mL熱水→加入40mg氯化亞錫（SnCl2·H2O）攪拌過濾（作防腐劑）→于冷暗處過夜→定容50mL氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液

稱干燥氨基酸（如異亮氨酸0.2000g）→溶解定容100mL→搖勻→吸10mL于另外100mL容量瓶,定容100mL，即得200μg/mL標(biāo)液

實(shí)驗(yàn)操作1.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：

取7個(gè)25mL容量瓶，吸取標(biāo)液0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0mL于7個(gè)25mL容量瓶，加水補(bǔ)充至容積為4mL，然后加茚三酮和緩沖液各1mL，于水浴加熱15分鐘，冷卻后定容25mL，靜置15分鐘，在570nm下測消光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2.樣品測定：

取醬油樣5~10mL→于燒杯中→加50mL水和活性碳約5g→加熱過濾→用30~40mL熱水洗滌活性炭→吸澄清樣液1~4ml→加茚三酮和緩沖液各1mL水浴加熱15分鐘，冷卻定容，靜置15分鐘于570nm下測定消光值，按下式計(jì)算氨基酸含量。氨基酸含量（毫克/100克）=C/（W×1000）×100

C：從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得得氨基酸的量（μg）；

W：測定得樣品溶液相當(dāng)于樣品的量（g）；

注意事項(xiàng)茚三酮受陽光、溫度、濕度、空氣等影響易被氧化呈淡紅或深紅色，使用前要進(jìn)行純化，方法如下：

取10g茚三酮容于40mL熱水中，加1g活性炭，搖勻靜置30分鐘，過濾，將濾液放入冰箱中過夜，即出現(xiàn)藍(lán)色結(jié)晶，過濾，用2mL冷水洗滌結(jié)晶，置干燥皿中干燥，裝瓶備用。

3.電位滴定法實(shí)驗(yàn)原理：根據(jù)氨基酸的兩性作用，加入甲醛以固定氨基的堿性，使羧基顯示出酸性，將酸度計(jì)的玻璃電極及甘汞電極（或復(fù)合電極）插入被測液中構(gòu)成電池，用堿液滴定，根據(jù)酸度計(jì)指示的pH值判斷和控制滴定終點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備：酸度計(jì)，磁力攪拌器，燒杯（250mL），微量滴定管

試劑配制pH=6.18標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液；20%中性甲醛溶液；0.05mol/L左右的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液；

實(shí)驗(yàn)操作1.樣品處理

準(zhǔn)確吸取醬油5.00mL于100mL容量瓶中，加水定容?；靹蚝笪《ㄈ菀?0.00mL，置于250mL燒杯中，加水60mL，放入磁力轉(zhuǎn)子，開動(dòng)磁力攪拌器使轉(zhuǎn)速適當(dāng)。用pH=6.18的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液校正好酸度計(jì)，然后將電極清洗干凈，再插入到上述醬油液中，用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至酸度計(jì)指示pH8.2，記下消耗的NaOH溶液體積。2.氨基酸的滴定在上述滴定至pH=8.2的溶液中準(zhǔn)確加入10.00mL的中性甲醛溶液，再用0.05mol/LNaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至pH=9.2，記下消耗的NaOH溶液體積，供計(jì)算氨基酸態(tài)氮含量用。3.空白滴定

吸取80mL蒸餾水于250mL的燒杯中，用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至pH=8.2，然后加入10.00mL中性甲醛溶液，再用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至pH=9.2，記下加入甲醛后消耗的NaOH溶液體積。

計(jì)算ρ=[(V1-V2)×C×0.0141]／5×(V3／100)

式中：ρ：樣品中氨基酸態(tài)氮的含量，g/100mL；

V1：醬油稀釋液加入甲醛后滴定至pH=9.2所用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；

V2：試劑空白滴定加入甲醛后滴定至pH=9.2所用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積mL；

V3：樣品稀釋液取用量，mL；

C：NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L；

0.014：1.000mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液相當(dāng)?shù)?/p>