微生物學(xué)-第8章生長及其控制

第8章微生物的生長與環(huán)境條件第1節(jié)微生物的生長和測定方法第2節(jié)環(huán)境條件對微生物生長的影響第3節(jié)有害微生物的控制

微生物不論在自然條件下還是在人為條件下發(fā)生作用，都需要達到一定的數(shù)量才能實現(xiàn)。

微生物生長一般是指微生物個體數(shù)目的增加，即繁殖。參看教材162頁。

微生物死亡一般是指微生物細胞永久失去繁殖的能力。第1節(jié)微生物的生長和測定方法一、生長的定義和測定生方法（一）微生物生長的定義微生物的生長個體生長群體生長單位時間內(nèi)細胞數(shù)量或細胞質(zhì)量的的增加單個細胞的成分不可逆和按比例的增加（二）微生物生長的測定1.細胞總數(shù)的測定（1）顯微鏡直接計數(shù)法（2）比濁法2.活細菌數(shù)量的測定（1）平板菌落計數(shù)法澆注平板法（pourplate）涂布平板法（spreadplate）（2）最大概率法（mostprobablenumber,MPN）（3）濃縮法（濾膜法）3.細菌細胞生物量的測定（1）測定細胞干重法（2）DNA含量測定法：通過測定DNA的含量來推算細胞生物量（3）ATP含量測定法：通過測定ATP的含量來推算細胞生物量（4）代謝活性法：通過測定單位時間內(nèi)某種營養(yǎng)物質(zhì)的消耗量或某種代謝產(chǎn)物的生成量來推算細胞生物量二、細菌的群體生長——生長曲線

單細胞微生物的典型生長曲線1234（一）延滯期（lagphase）培養(yǎng)開始最初細胞數(shù)目沒有增加的一段時期。特點：生長速率常數(shù)為零，但合成代謝十分活躍。細胞形態(tài)變大或增長。細胞內(nèi)RNA（尤其是rRNA）含量增高。對外界不良條件反應(yīng)敏感。生長速率常數(shù)（R）：單位時間內(nèi)細胞數(shù)目或細胞量的變化。影響延滯期長短的主要因素（1）菌種生長快的菌比生長緩慢的菌延滯期短。（2）接種菌菌齡采用對數(shù)生長期的菌作為接種菌可縮短延滯期。（3）接種量適當提高接種量可縮短延滯期。（4）培養(yǎng)基成分營養(yǎng)豐富，與種子培養(yǎng)條件接近的培養(yǎng)基可縮短延滯期。（二）指數(shù)期（對數(shù)生長期）（exponentialphase）緊接延滯期后細胞數(shù)目以幾何級數(shù)增長的一段時期。特點：生長速率常數(shù)R最大，代時G最短。細胞進行平衡生長。酶系活躍，代謝旺盛。代時（G）：1個細胞分裂為2個所需要的時間。影響指數(shù)期微生物代時長短的主要因素：菌種原核比真核短，小的真核比大的真核短。2.營養(yǎng)成分3.營養(yǎng)物濃度生長限制因子（growth-limitedfacter）4.培養(yǎng)溫度（三）穩(wěn)定期（stationaryphase）是在對數(shù)生長之后細胞群體進入的生長與死亡處于動態(tài)平衡的一段時期。特點：生長速率常數(shù)R=0菌體產(chǎn)量達到最高某些細胞開始啟動一些特殊的代謝途徑:形成芽孢，形成貯存顆粒，形成次級代謝產(chǎn)物。穩(wěn)定期到來的原因：營養(yǎng)物質(zhì)的耗盡。營養(yǎng)物比例失調(diào)。有害代謝產(chǎn)物的積累。pH、氧化還原勢等條件越來越不適宜。（四）衰亡期（declinephase,deathphase）整個群體生長速率R為負值的時期。特點：個體死亡速度超過新生速度，R為負值。細胞形態(tài)發(fā)生多形化。細胞開始自溶。產(chǎn)生衰亡期的主要原因：環(huán)境對繼續(xù)生長越來越不利。三、細菌的二次生長、同步生長和連續(xù)培養(yǎng)（一）營養(yǎng)物質(zhì)濃度對生長的影響限制性營養(yǎng)物：對生長繁殖必需的營養(yǎng)物質(zhì)。限制性營養(yǎng)物濃度對微生物的生長速率和最大收獲量的影響：（二）二次生長（diauxicgrowth）當培養(yǎng)基中同時存在2種均能被微生物利用的主要營養(yǎng)物質(zhì)時，微生物將首先利用其中較易利用的營養(yǎng)物質(zhì)開始生長。當這種營養(yǎng)物質(zhì)被消耗完，進入穩(wěn)定期后，微生物經(jīng)過短暫的適應(yīng)，開始利用第2種營養(yǎng)物質(zhì)，再次開始新的對數(shù)生長，并進入新的穩(wěn)定期的現(xiàn)象稱為二次生長現(xiàn)象。（三）同步生長研究單細胞微生物的個體生長很困難。同步培養(yǎng)（synchronousculture）：

使某一群體中的所有個體細胞盡可能都處于同樣的細胞生長和分裂周期的培養(yǎng)方法。同步生長（synchronousgrowth）：某細胞群體中所有個體細胞處于分裂步調(diào)一致的生長狀態(tài)。獲得同步生長的方法1.機械分離法

膜洗脫法過濾法，區(qū)帶離心法，膜洗脫法2.誘導(dǎo)法溫度法，養(yǎng)料法，其他方法3.解除抑制法（四）微生物的連續(xù)培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)的目的長時間地保持微生物的對數(shù)生長狀態(tài)以提高經(jīng)濟效益。連續(xù)培養(yǎng)的方式恒濁器恒化器單級多級單級多級連續(xù)培養(yǎng)的利弊利：高效節(jié)約，自控，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定弊：菌種易退化，易污染，營養(yǎng)物利用率低于單批培養(yǎng)。4.連續(xù)培養(yǎng)時間是有限制的，一般可達數(shù)月或一兩年四、真菌的生長（一）絲狀真菌在固體培養(yǎng)基上的生長蘑菇圈（二）真菌在液體培養(yǎng)基中的生長1、延緩期菌種，菌齡，環(huán)境條件2、迅速生長期菌絲生長和分枝速率加快。3、衰退期菌絲細胞中開始出現(xiàn)較大的空泡和儲存物顆粒，老菌絲開始自溶，多數(shù)次生代謝產(chǎn)物也在本期內(nèi)合成。第2節(jié)環(huán)境條件對微生物生長的影響影響微生物生長的因素很多，但主要的因素有4個：水分、溫度、氧氣和pH值。一、水分對微生物生長的影響水活度水活度（wateractivity，aw）：它表示在天然或人工環(huán)境中，微生物可實際利用的自由水或游離水的含量。aw=PP0農(nóng)業(yè)土壤中的aw一般在0.9—1之間。生長最低aw細菌一般：0.90—0.98嗜鹽菌：0.75（約5.5MNaCl）酵母菌一般：0.87—0.91高滲酵母：0.61—0.65魯氏酵母：0.60霉菌一般：0.80—0.87耐旱菌：0.65—0.75雙孢旱霉：0.60親和性溶質(zhì)（compatiblesolutes）

生活在水活度低（滲透壓高）的環(huán)境中的微生物如何獲得水分？

靠提高細胞內(nèi)部溶質(zhì)的濃度：（1）泵入無機離子（2）合成或提高某種有機溶質(zhì)的濃度（直接合成或從環(huán)境中積累）。

用來調(diào)節(jié)細胞內(nèi)水活度或溶質(zhì)濃度的溶質(zhì)叫親和性溶質(zhì)（compatiblesolutes）。它必須不阻礙細胞內(nèi)其他生化過程。細胞內(nèi)親和性溶質(zhì)的濃度取決于外部溶質(zhì)濃度。每種生物合成或積累調(diào)劑溶質(zhì)的最大量是由每種生物的基因決定的一種特性。這決定了不同的生物對水活度的不同耐受性。微生物的親和性溶質(zhì)微生物積累的主要溶質(zhì)生長最低aw細菌甜菜堿，脯氨酸（G+）0.97-0.90淡水藍藻蔗糖，海藻糖0.98海水藍藻α-葡萄糖基甘油0.92鹽湖藍藻甜菜堿0.90-0.75嗜鹽厭氧甜菜堿，ectoine，海藻糖0.90-0.75光合細菌極端嗜鹽古菌KCl

0.75和一些細菌ectoine:四氫嘧啶羧酸

微生物的親和性溶質(zhì)微生物積累的主要溶質(zhì)生長最低aw海洋藻類甘露醇，各種糖苷，0.92脯氨酸，二甲基巰基丙酸杜氏藻甘油0.75(嗜鹽綠藻)耐干旱酵母甘油0.83-0.62耐旱絲狀真菌甘油0.72-0.61杜氏藻:Dunaliella微生物中幾種主要的有機親和性溶質(zhì)甜菜堿海藻糖蔗糖甘油甘露醇二甲基巰基丙酸二、溫度對微生物生長的影響微生物生長的三個溫度常數(shù)——溫度三基點最低生長溫度（minimumtemperature）

最適生長溫度（optimumtemperature）

最高生長溫度（maximumtemperature）

三基點對于每種微生物一般是其特有的，但又不完全固定，它們能被其他的環(huán)境因子輕微地改變，尤其是生長的培養(yǎng)基質(zhì)對基本溫度的影響大。

最低生長溫度：在此溫度下，生長不會發(fā)生。細胞膜不能保持流動狀態(tài)，影響營養(yǎng)物質(zhì)的運輸和質(zhì)子動力的形成。最高生長溫度：超過這一溫度，不可能生長。高溫使一些分子失活，細胞膜破裂。最適生長溫度：生長最快。微生物生長的溫度范圍根據(jù)微生物的最適溫度可將它們劃分為4大群：（1）嗜冷菌（psychrophiles）Topt≤15℃

永久寒冷的地區(qū)。（2）嗜溫菌（mesophiles）Topt≤45℃

溫血動物，熱帶與溫帶土壤、水域。（3）嗜熱菌（thermophiles）

很熱的環(huán)境中：堆肥。Topt＞45℃（4）超嗜熱菌（hyperthermophiles）Topt＞80℃

極端熱的環(huán)境：火山口，硫磺熱泉，自燃煤堆。溫度與典型的嗜冷菌、嗜溫菌、嗜熱菌及兩種不同的超嗜熱菌的生長速率之間的關(guān)系，不同生物最適生長溫度已在圖上表示出來。3.嗜冷菌冷適應(yīng)的分子機理（1）酶在冷的條件下能發(fā)揮最佳功能：低溫酶含有大量的α螺旋而β折疊的數(shù)量較少；含有極性氨基酸較嗜溫菌和嗜熱菌多，疏水性氨基酸比它們少；酶蛋白含有極低水平的弱相互作用的化學(xué)鍵，并各個結(jié)構(gòu)域之間的相互作用也比較弱。（2）膜中含有較高濃度的不飽和脂肪酸，含有多個雙鍵的不飽和脂肪酸。4.嗜熱菌熱適應(yīng)的分子機理酶和其他蛋白質(zhì)對熱的穩(wěn)定性更高，在高溫有最好的功能（增加鹽橋、大量的疏水內(nèi)核）。

細胞內(nèi)特殊的溶質(zhì)（環(huán)2,3-二磷酸甘油）。細胞內(nèi)存在大量的分子伴侶。膜中含飽和脂肪酸、植烷和醚形成的單層膜。

三、氧氣對微生物生長的影響1.按照微生物與氧的關(guān)系，可將它們分為2大類：好氧微生物（aerobes）厭氧微生物（anaerobes）

二大類又可進一步分為5類：專性好氧（obligateorstrictaerobes）兼性厭氧（facultativeanaerobes）微好氧（microaerophilicbacteria）耐氧菌（aerotolerantanaerobes）專性厭氧菌（obligateanaerobes）好氧厭氧5類細菌在含有巰基乙醇的培養(yǎng)基中的生長和分布。

氧的毒性形式的產(chǎn)生和消除

羥自由基（OH·）

超氧化物（O2-）

單一態(tài)氧（‥O2）

過氧化氫（H2O2）在呼吸過程中O2還原成H2O中產(chǎn)生的不可逆副產(chǎn)物氧的毒性形式：（1）過氧化氫（hydrogenperoxide，H2O2）O2氧化黃素蛋白無一例外地要產(chǎn)生一種有毒的化合物——H2O2O2+e-+H+H2O2

FPH2O2+H2O22H2O+O2CatalaseH2O2+NADH+H+2H2O+NAD+Peroxidase過氧化氫酶過氧化物酶（2）超氧化物（superoxide，O2-）由H2O2的氧化作用以及其他酶（黃素蛋白，Q，鐵硫蛋白）催化的氧化作用或加氧作用產(chǎn)生。

2O2-

+2H+O2+H2O2超氧化物岐化酶（SOD）2H2O22H2O+O2過氧化氫酶（catalase）

O2+e-O2-

FP，F(xiàn)eS,Q等（3）羥自由基（hydroylradical，OH·）由離子輻射產(chǎn)生，少量的羥自由基可由于細胞內(nèi)H2O2的積累而產(chǎn)生：

H2O2+e-+H+H2O+OH·

OH·+e-+H+

H2O（4）單一態(tài)氧（singletoxygen，‥O2）

能量很高，外圍電子高度活化。產(chǎn)生方式：光化學(xué)反應(yīng)（細胞含光敏色素P）：P+hvP*P*+O2‥O2

生物化學(xué)反應(yīng)：各種過氧化物酶。

類胡蘿卜素能淬滅單一態(tài)氧。四、pH值對微生物生長的影響

每一種生物都有一生長的pH值范圍，一般有相當固定的最佳pH值。

絕大多數(shù)自然環(huán)境的pH值在5——9之間。

只有少數(shù)生物能在低于2或高于10的pH中生長。真菌最適pH≤5細菌最適pH一般為中性6.0—7.5放線菌最適pH7.0—8.0專性嗜酸菌（obligateacidophilicbacteria）在pH2.0—4.0生長，但不能在中性條件下生長。專性嗜酸菌的細胞膜在中性pH時溶解，細胞裂解死亡。專性嗜酸菌包括：硫桿菌屬（Thiobacillus），硫化葉菌（Sulfolobus），嗜熱支原體（Thermoplasm）等。嗜堿微生物（alkaliphilicmicroorganisms）

生長最適pH10—11，在中性條件下不生長。嗜堿微生物包括：細菌：芽孢桿菌，外硫紅螺菌（Ectothiorhodospira）放線菌：鏈霉菌，棒狀桿菌藍細菌古細菌真菌參閱《土壤與環(huán)境微生物學(xué)》第20章必須記住：這里講的pH值是指外部pH值，細胞內(nèi)的pH值一般都是保持中性左右的。在極端嗜酸或極端嗜堿菌中，細胞內(nèi)的pH值可能比中性偏移1—1.5pH單位。大多數(shù)微生物的最適pH是在6—8之間，它們叫嗜中性微生物，細胞質(zhì)pH保持中性或與中性非常接近。質(zhì)子是一種唯一不帶電子的陽離子，它在溶液里能迅速地與水結(jié)合成水合氫離子。水合氫離子和OH-對營養(yǎng)物質(zhì)的溶解度和離解狀態(tài)、細胞表面電荷平衡和細胞的膠體性質(zhì)等方面均會產(chǎn)生重大影響。pH值或氫離子濃度對微生物的作用表現(xiàn)在：（1）影響細胞質(zhì)膜對離子和養(yǎng)料的吸收和膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性；（2）影響酶的活性；（3）改變環(huán)境中養(yǎng)料的可給性或有害物質(zhì)的毒性。緩沖劑（Buffers）培養(yǎng)基中常需要加緩沖劑來維持pH的相對穩(wěn)定。緩沖劑的有效pH范圍很窄。不同的pH范圍需要不同的緩沖劑。磷酸鹽（常用KH2PO4）是接近中性的pH（6-7.5）范圍的極好的緩沖劑第3節(jié)有害微生物的控制一、幾個基本概念控制害菌的措施殺滅抑制滅菌——徹底殺滅（一切微生物）消毒——部分殺滅（僅殺滅病原菌）防腐——抑制霉腐微生物化療——抑制宿主體內(nèi)的病原菌sterilizationdisinfectionantisepsischemotherapy二、物理滅菌因素的代表——高溫

高溫，輻射，超聲波，微波，激光，靜高壓。過濾。（一）高溫滅菌的種類高溫滅菌干熱滅菌濕熱滅菌灼燒烘箱內(nèi)熱空氣滅菌法常壓加壓：常規(guī)加壓滅菌，連續(xù)加壓滅菌巴氏消毒法煮沸消毒法間歇滅菌法1、干熱滅菌（dryheatsteriliazayion）

灼燒（燒紅）——接種環(huán)、針烘箱（150-170℃，1-2h）——干燥培養(yǎng)皿、移液管等玻璃器皿2、濕熱滅菌（moistheatsterilization）

用100℃以上的加壓蒸汽進行滅菌。（1）常規(guī)加壓蒸氣滅菌法（normalautoclaving）121℃（1kg/cm2）15-20min115℃（0.7kg/cm2）30-35min（2）連續(xù)加壓蒸氣滅菌（continuousautoclaving）

僅用于大型發(fā)酵廠的大批培養(yǎng)基滅菌。讓培養(yǎng)基在管道的流動過程中快速升溫（135—140℃）、維持（5—15s）和冷卻，然后流進發(fā)酵罐。（3）間歇滅菌（fractionalsterilization,tyndallization）

適用于不耐熱的培養(yǎng)基的滅菌。80—100℃，15—60min。37℃保溫過夜。重復(fù)3天（4）巴氏消毒法（pasteurization）

專用于液態(tài)風(fēng)味食品或調(diào)料。60—63℃30minLTH72℃15sHTST（5）煮沸消毒法100℃數(shù)分鐘。（二）影響加壓蒸氣滅菌效果的因素1、滅菌物體含菌量含菌量越高，需要的滅菌時間越長。2、滅菌鍋內(nèi)空氣排除程度3、滅菌對象的pH值pH＜6.0時，微生物易死pH60.-8.0時，不易死亡4、滅菌對象的體積（三）高溫對培養(yǎng)基成分的有害影響及其防止1、有害影響形成沉淀破壞營養(yǎng)改變pH2、防止方法分別滅菌低壓間歇滅菌過濾除菌其他方法三、化學(xué)殺菌劑、消毒劑和治療劑化學(xué)因素表面消毒劑化學(xué)治療劑液體氣體抗代謝藥物：黃胺抗生素生物藥物素（一）表面消毒劑（二）化學(xué)治療劑化學(xué)治療（chemotherapy）：是應(yīng)用對寄生生物有專門作用的化學(xué)合成藥物，這種藥物能夠殺死寄生物或抑制寄生物在機體內(nèi)增殖，而對宿主沒有或很小毒性?；瘜W(xué)治療劑（chemotherapeutant）：用于化學(xué)治療的化學(xué)物質(zhì)。包括化學(xué)合成的藥物，抗生素等。自學(xué)教材188頁抗生素（antibiotics）1、定義抗生素是一類由微生物或其他生物生命活動過程中合成的次級代謝產(chǎn)物或其人工衍生物，它們在很低濃度時就能抑制或干擾它種生物的生命活動。2、產(chǎn)抗生素的生物種類大多數(shù)抗生素是三種主要的微生物：細菌、放線菌和絲狀真菌的次級代謝產(chǎn)物。只有少數(shù)抗生素是較高級的真菌、藻類和植物所產(chǎn)生，而且這些抗生素都普遍具有較低的抗菌活性和較低的專一性。放線菌產(chǎn)生了數(shù)量最多、品種最多的抗生素。細菌產(chǎn)生的抗生素大多為多肽類。粘細菌研究較少，但已經(jīng)顯示出產(chǎn)生抗生素的頻率很高?！犊股亍鄬W(xué)科研究入門》[美]GiancarloLancini編，王以光譯，人民衛(wèi)生出版社，1998環(huán)絲氨酸萬古霉素桿菌肽青霉素頭孢菌素單環(huán)內(nèi)酰胺碳青霉素喹諾酮參看BROCK11版中譯本1012頁3、細菌抗生素的作用部位（靶位）多粘菌素DNA解旋酶（1）青霉素——主要抗G+青霉素G：對G+菌有強效，對G-菌效果差一點，對酸敏感，對青霉素酶敏感。6-APA紅霉素erythromicin

（2）紅霉素——主要抗G+是最常用的大環(huán)內(nèi)脂類抗生素，由紅霉素鏈霉菌（Streptomycinerythraeus）產(chǎn)生。與核糖體50S亞基作用，抑制蛋白質(zhì)的合成。對軍團菌尤其有效。（3）鏈霉素——抗G—菌為主，也抗結(jié)核分枝桿菌。鏈霉素，卡那霉素（kanamycin），慶大霉素（gentamycin），新霉素（neomycin）等都是氨基苷類抗生素。過去臨床上常用來抗G-細菌，現(xiàn)在一般作為保留藥物，只有當其他抗生素?zé)o效時才起用。鏈霉素與細菌30S亞基反應(yīng)，抑制細菌蛋白質(zhì)的合成。鏈霉素streptomycin與30S亞基反應(yīng)，抑制蛋白質(zhì)的合成。慶大霉素Gentamicin慶大霉素由紫紅小單胞菌Micromonosporapurpurea

產(chǎn)生?？笹+和G-。抑制蛋白質(zhì)合成，作用于核糖體30S亞基。（4）萬古霉素——抗G+和G-。萬古霉素（ycin）由東方鏈霉菌Streptomycinorientalis產(chǎn)生。阻斷新生肽聚糖單位的聚合，抑制細菌細胞壁的合成。（5）頭孢霉素——抗G+和G-。

頭孢霉素（Cephalosporins）從真菌頂頭孢霉（Cephalosporiumacremonium）中發(fā)現(xiàn)?？咕V廣，一般需注射。7-氨基頭孢霉素烷酸第一代頭孢對G+菌療效好。（6）廣譜抗生素——氯霉素，四環(huán)素，金霉素，土霉素氯霉素Chloramphenicol氯霉素（Chloramphenicol）：最早由委內(nèi)瑞拉鏈霉菌Streptomycinvenezuelae生產(chǎn)，現(xiàn)由化學(xué)合成。毒性大，蛋白質(zhì)合成抑制劑，能干擾50S核糖體亞基的功能。只在不得已時應(yīng)用。四環(huán)素（Tetracycline）：由鏈霉菌產(chǎn)生，或由半合成而來。主要是抑菌，是一種蛋白質(zhì)合成抑制劑，能干擾30S核糖體亞基的功能。高劑量會產(chǎn)生惡心、腹瀉、小兒黃牙，并對肝腎造成損害。4、抗真菌的抗生素膜功能：多烯類（兩性霉素B，制霉菌素）與麥角甾醇結(jié)合影響膜的完整性細胞壁合成：多氧菌素抑制幾丁質(zhì)的合成，棘白菌素阻止葡聚糖合成麥角甾醇的合成：唑類和烯丙胺類阻止麥角甾醇的合成微管形成：灰黃霉素可阻止有絲分裂過程中微管的聚集核酸的合成：5-氟胞嘧啶可抑制核酸合成兩性霉素B(amphotericinB)制霉菌素(nystatin)作用機制：與細胞膜上麥角甾醇結(jié)合，破壞細胞膜的結(jié)構(gòu)，影響細胞膜的透性，使細胞裂解。療效與副作用相當。僅用于危及生命的感染。咪康唑(micoazole