核酸檢測基礎(chǔ)技術(shù)

各類材料的DNA與RNA各類材料的DNA與RNA化學(xué)化工與生

教生物科學(xué)與技 用于核酸抽提的標 與預(yù)處 核酸抽提中需要去除的PCR抑制核酸純化的DNA提取的原理與方RNA提取的原理與方miRNA提取原理與方提取核 核酸提取標用于核酸抽提的臨床標本的處理和保核酸提取是臨床PCR檢驗最為關(guān)鍵的部臨床PCR檢驗操作中標標標 時間對擴增檢測結(jié)果的影響（過早或過晚可能會出現(xiàn) 結(jié)果標 部位的準備（適 標本的類型 采樣質(zhì)量的評價（評價方法：肉眼觀察、顯微鏡下觀察和化分析采樣標

容器中的防污染

無菌器材,防腐劑,抗凝劑無菌容器，防止混入操作者發(fā)，表皮等，如玻璃容器要高壓滅菌全痰唾液（全痰唾液（口腔/咽拭子?棉拭尿糞骨組（漿（漿DNA測定：可按照一般 標本處理程序，對測定影RN測定 ，指血液凝固后，在血漿中除去纖維蛋白分離出的淡黃色透指纖維蛋白已被除去血漿（Plasma）是血液的液體成分，血細胞懸浮于快提取RNA。破紅細加入3倍體積的破紅細冰浴收集白細收集白細痰痰痰屬于分泌物, 常用作為結(jié)核桿菌DNA測定標本 本進行初步處理，即用1mol/LNaOH或變性劑液化。如用于非結(jié)核桿菌如 支原體的PCR檢測痰標本只能室溫懸浮于生理鹽中，充分振蕩混勻，促使大塊粘狀下，上清離，得到的淀物即用核酸提。液化標本如不立即用于核酸提取,可保存于-70通用模簡單模（1）通用標本處理（UniversalsampleprocessingUSP）液4-6mol/L鹽酸胍50mmol/LTris-HCl,25mmol/L0.5%十二烷基肌酸鈉（Sarkosyl0.1~0.2mol/Lβ-巰基乙（2）0.05%Tween80（3）10%Chelex-100(0.03TritonX-100和0.3Tween

收集菌

DNA分離。加入5倍10%chelex-100，混勻，90℃溫育試劑：（1）裂解液:含終濃度0.1mol/LNaOH、50μg酶K和0.05%TritonX-唾液（口腔/唾液（口腔/咽拭子 沉淀用于DNA抽提。或利用Qiagen（天根）等公司開發(fā) 在使用PCR方法檢 病原體時,臨床標本一般棉拭子,可將棉拭子置于適量生理鹽水中,充分震蕩尿尿 預(yù)處理過程也很簡單，只需將5mL尿3000rpm離心10分鐘，收集細胞沉淀即糞糞增，糞便本身的眾多雜質(zhì)也會導(dǎo)致背景DNA的干,除去除去大顆粒雜↓↓↓收集收集菌↓↓洗滌菌洗滌菌↓↓↓收集收集純化的菌↓

脫

脫 裂

抽 生理鹽水洗兩次,然后將其搗碎或切碎，加入生理鹽水后鹽水將組織洗一次,切成寬度小于1cm的小片,加入適量的石蠟切片用于核酸提取,需先用辛烷或二甲苯脫蠟,再用 內(nèi)源性的:免疫球蛋白、蛋白酶、血紅素及其代在標本中加入肝素酶I1-3U/μg核酸(于5mMTrispH7.5,1mMCaCl2,40URNase25℃21%(V/V)血液可完全抑制Taq酶活NaOH處理可中和臨床標本中的TaqDNA聚合酶抑制劑，但加入0.6%(wt/vol)牛 TaqDNA聚合酶的抑制效應(yīng)，既使在2%（vol/vol）血液存BSA也可增加TaqDNA和肉類標本中抑制物的抵抗能力分別提高10和20?單鏈DNA結(jié)合 核酸分離純化技術(shù)于二十世紀五十年代，在處理、提取及乙醇沉淀等步驟。一般核酸提取試劑促使靶核酸從細胞內(nèi)釋出核酸的DNARNA和核苷酸都是極性化合物在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱堿性溶液中天然狀態(tài)的DNA是以脫氧核 白(DNP)形式存在于細胞核中DNP和RNP（核 白）在鹽溶液中的溶解度受鹽濃度的影響而不同。 主要試1M化鈉溶液，氯常用的方法是用1M氯化鈉抽提,得到的DNP粘液與含有少量辛醇的 也可用0.15MNaCL液反復(fù)洗滌細胞破碎液除去RNP,再以提取脫氧核糖蛋白,再按氯仿---異醇法除去蛋白主要試劑：苯用苯酚處理勻漿液時,由于蛋白與DNA聯(lián)結(jié)鍵已斷,蛋白利用核酸不溶于醇的性質(zhì)，用乙醇沉淀DNA。此時DNA 用于DNA用于DNAChelex100：在低離子強度、堿性及煮沸的條件下，可以使細胞xDNA分離。用于DNA用于DNA基帶負DEAE帶正電DNA可以在0.1～1.4mol/L的相當(dāng)大的鹽濃度范圍內(nèi)仍與DEAE合,當(dāng)?shù)望}溶液平衡純化柱后,即可加樣,用利用裂解液促使細胞破碎，使細胞中的把吸附在特定載體上的核酸洗脫下來RNARNA提取的RNA提取所用器皿的處RNA提取所用溶液的準RNA提取中RNaseRNA提取的臨床標本及 環(huán)境中,存在大量對RNA具有強烈用N，Rs高。如何避免RNase對標本的污染及防止RNase對提取RNARNA經(jīng)高壓滅菌 使用的塑料制品如試管,離心管等基上無RNase,可以不經(jīng)預(yù)處理，直接用 RNA 180℃干烤8小時以上,或用0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)的水溶液浸泡用于RNA的燒杯,試管和其它用品。DEPC是RNase的強烈抑制劑。灌滿DEPC的器皿于37℃下放置后高壓蒸汽下15分鐘。上述處理可除去器皿上痕量的RNARNA對于RNA提取所需溶液的配制,必須用高壓滅菌的水和RNA研究的化學(xué)試劑配制溶液,用干烤過的藥匙稱取試劑,將溶液裝入無RNase的玻璃器皿。可能的話,溶液均應(yīng)用的Tris試劑以無RNase的溶液。RNA提取中RNaseRNA提取中RNase在準備用于RNA純化的實驗材料和溶液時,以及在涉及RNA的整個提取操作過程中,都應(yīng)戴手異異酸胍結(jié)合氯仿-酚抽提Trizol方法胍鹽提取結(jié)合玻璃粉、二氧化硅等異硫酸胍結(jié)合氯仿-酚抽提法異硫酸胍結(jié)合氯仿-酚抽提法異硫酸胍是一種強有力的蛋白質(zhì)變性劑， 富富 顆↓↓↓棄上清，加500μl裂解液（含異硫酸胍、-β巰基乙醇等）↓↓↓↓↓↓↓↓Trizol一步法提取Trizol一步法提取Trizo能完全抑制To酸胍、βRsR酶）。To能保持N回收RNATRIzol提取TRIzol提取樣本預(yù)組織樣再加少量液氮，再研磨，如此三次，按50-100mg組織/mlTrizol加入Trizol，2勻漿：組織樣品按50-100mg/mlTrizolTrizol，用電動勻漿器充分勻漿2細胞可直接收集、裂解，每1mlTrizol可裂解5×106動物、植物或酵母 ↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓胍鹽結(jié)合玻璃粉提取Ambion公司的mirVanamiRNAIsolationKit是最早上市 miRNAmiRNARNAisoforsmallRNA（Takara公司TrizoLC）RRtN和5RRrz完全mN。核酸提取的產(chǎn)率：可在A260核酸純度：可通過提取物A260/A280比率判RNA的RIN值：通過Agilent2100 測 分光光度（紫外吸收）法檢測DNA質(zhì)度。純的DNA溶液其OD260/OD280應(yīng)為1.8，OD260/OD280大于1.9時，表明有RNA污染；小于1.6時表明有