高效液相色譜法維護(hù)

高效液相色譜操作及維護(hù)高效液相色譜儀(HPLC)目前常見的HPLC儀生產(chǎn)廠家國外有Waters公司、Agilent公司（原HP公司）、島津公司等，國內(nèi)有大連依利特公司、上海分析儀器廠、北京分析儀器廠等。

美國Agilent美國Waters美國戴安日本島津美國VARIAN

日本島津Waters高效液相色譜儀

日本島津高效液相色譜儀開機(jī)前的準(zhǔn)備工作1、將試驗(yàn)要求的流動(dòng)相配制好。2、流動(dòng)相要過濾脫氣。3、裝好試驗(yàn)要求的色譜柱。流動(dòng)相:溶劑的沸點(diǎn)和粘度低沸點(diǎn)的溶劑通常其粘度低，但它在泵中易形成氣泡而影響泵的精度，還因易蒸發(fā)而改變混合流動(dòng)相的組成。高沸點(diǎn)的溶劑通常會(huì)因其粘度而降低柱效。對(duì)于有締合傾向的溶劑（特別是水和乙腈，水和甲醇），它們的粘度隨組成的變化是不規(guī)律的。例如：水：乙腈（35：65），水：甲醇（50：50）時(shí)，其粘度最大。開機(jī)前的準(zhǔn)備工作流動(dòng)相要過濾:以除去其中的微粒物質(zhì)。濾膜：(0.45μm)①脂溶性濾膜（有機(jī)濾膜），②水溶性濾膜，③通用型濾膜(聚四氟乙烯能適用于所有溶劑)。HPLC級(jí)溶劑（色譜純）使用時(shí)不必再過濾了，因生產(chǎn)工藝中已用0.2μm的過濾裝置過濾過了。開機(jī)前的準(zhǔn)備工作脫氣：為了防止在泵中、流路中、及檢測(cè)器中產(chǎn)生氣泡，而影響泵不穩(wěn)定性（使流速不穩(wěn)）和增加檢測(cè)器的噪聲，流動(dòng)相必須脫氣?；旌狭鲃?dòng)相比純?nèi)軇└苋芙饪諝?，極易飽和形成氣泡，有水的流動(dòng)相特別明顯。脫氣方法：①氦氣脫氣，②真空脫氣（用真空過濾流動(dòng)相脫氣，在線脫氣機(jī)脫氣），③超聲脫氣，④加熱脫氣。以不使流動(dòng)相中混合物濃度發(fā)生變化為原則。貯液瓶貯液瓶是用來裝流動(dòng)相的容器，里面還含有一個(gè)不銹鋼燒結(jié)過濾器。泵進(jìn)液管路一般用聚四氟乙烯管。不銹鋼燒結(jié)過濾器套在進(jìn)液管路上，有兩個(gè)功能：一是防止微粒物質(zhì)進(jìn)入泵，二是作為進(jìn)液管路的重物，所以常被稱為“沉子”。貯液瓶如被污染了可能會(huì)阻塞過濾片，影響泵的性能(使流速不穩(wěn))，出雜峰或產(chǎn)生噪聲。反相色譜法

一般用非極性固定相（如C18、C8）；流動(dòng)相為極性強(qiáng)的水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機(jī)溶劑以調(diào)節(jié)保留時(shí)間。適用于分離非極性和極性較弱的化合物。RPC在現(xiàn)代液相色譜中應(yīng)用最為廣泛，據(jù)統(tǒng)計(jì)，它占整個(gè)HPLC應(yīng)用的80%左右。

反相色譜柱以硅膠為基質(zhì)的液相色譜填料多為反相柱，正相柱不太多。①常用硅膠健合C18、C8等填料柱。②對(duì)硅膠做堿性脫活的反相柱（在高溫下硅烷化封閉硅羥基），（這類填料對(duì)堿性物質(zhì)如對(duì)胺有很小的吸附性）。③高穩(wěn)定性反相柱（這種柱可以經(jīng)過酸和堿的作用）。硅膠為基質(zhì)的一些缺點(diǎn)：①在堿性介質(zhì)中（pH＞8）不穩(wěn)定。②在孔隙中大分子擴(kuò)散困難，降低柱效。③硅膠表面上的剩余硅羥基有離子交換作用。反相色譜法中應(yīng)注意：盡量不使用乙酸鹽緩沖溶液，因?yàn)樗蛶ш栯x子的溶質(zhì)會(huì)形成非極性絡(luò)合物。不使用鹵化物，以免腐蝕液相色譜儀。對(duì)水的質(zhì)量要求很高。一般應(yīng)用新鮮的高純水。樂百氏也可以用。每次試驗(yàn)用水都應(yīng)更換新鮮的水，因水易變質(zhì)，不能長(zhǎng)時(shí)間不更換。正相色譜法采用極性固定相(如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相)；流動(dòng)相為相對(duì)非極性的疏水性溶劑(烷烴類如正已烷、環(huán)已烷），常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃、三氯甲烷等以調(diào)節(jié)組分的保留時(shí)間。常用于分離中等極性和極性較強(qiáng)的化合物(如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等）。常用的有硅膠柱。

反相HPLC

極性:固定相<流動(dòng)相固定相-極性弱流動(dòng)相(甲醇,乙腈等)-極性強(qiáng)極性大物質(zhì)先出峰正相HPLC

極性:固定相>流動(dòng)相固定相-極性強(qiáng)流動(dòng)相(己烷,庚烷)-極性弱極性小物質(zhì)先出峰正相色譜20%反相色譜80%正相色譜20%反相色譜80%主流固定相與流動(dòng)相物理性質(zhì)硅膠純度色譜柱尺寸顆粒形狀粒徑表面積孔徑鍵合類型碳覆蓋率封端化學(xué)性質(zhì)固定相-填充材料物理性質(zhì)硅膠純度色譜柱尺寸顆粒形狀粒徑表面積孔徑填料硅膠的純度與殘留金屬離子濃度固定相-填充材料鍵合類型碳覆蓋率封端化學(xué)性質(zhì)固定相-填充材料固定相-填充材料色譜柱常用的pH值:隨著柱填料的快速發(fā)展，反相色譜法的應(yīng)用范圍逐漸擴(kuò)大，現(xiàn)已應(yīng)用于某些無機(jī)樣品或易解離樣品的分析。為控制樣品在分析過程的解離，常用緩沖液控制流動(dòng)相的pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常為2.5~7.5（2~8），太高的pH值會(huì)使硅膠溶解，太低的pH值會(huì)使鍵合的烷基脫落。有報(bào)告新商品柱可在pH1.5~10范圍操作。色譜柱色譜柱開機(jī)順序：1、打開主機(jī)，檢測(cè)器，色譜工作站等電源開關(guān)。2、將配制好的流動(dòng)相放入流動(dòng)相通道內(nèi)，旋開排液（或灌液）旋鈕，將流動(dòng)相管路中存放的老溶劑替換掉。3、關(guān)上排液（或灌液）旋鈕，逐漸將流速升高。平衡至少30分鐘后準(zhǔn)備進(jìn)樣。替換掉管路中存放的老溶劑替換掉管路中存放的老溶劑進(jìn)樣前準(zhǔn)備——樣品過濾一次性注射器針式（頭）過濾器樣品瓶

六通閥/定量環(huán)進(jìn)樣器儀器：手動(dòng)進(jìn)樣器-六通閥/定量環(huán)

手動(dòng)進(jìn)樣器工作原理

裝填狀態(tài)樣品注入手動(dòng)進(jìn)樣器

液相色譜中，用定量環(huán)進(jìn)樣時(shí)，注射器的抽取量不得少于環(huán)容積的5倍。

儀器：檢測(cè)器UV/Vis雙燈，全波長(zhǎng)檢測(cè)ＤＡＤ檢測(cè)器流路儀器：檢測(cè)器-紫外反射鏡1＃反射鏡2＃氘燈光源透鏡濾光片（鈥玻璃/遮光）入射狹縫光柵分光器參比光電二極管數(shù)模轉(zhuǎn)換板樣品光電二極管數(shù)模轉(zhuǎn)換板流通池紫外檢測(cè)器工作原理Agilent1100可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器(G1314A)熒光檢測(cè)器蒸發(fā)光檢測(cè)器質(zhì)譜檢測(cè)器基本概念和術(shù)語

色譜圖(chromatogram)——樣品流經(jīng)色譜柱和檢測(cè)器，所得到的信號(hào)-時(shí)間曲線，又稱色譜流出曲線(elutionprofile)?；€(baseline)——經(jīng)流動(dòng)相沖洗，柱與流動(dòng)相達(dá)到平衡后，檢測(cè)器測(cè)出一段時(shí)間的流出曲線。一般應(yīng)平行于時(shí)間軸。噪音(noise)——基線信號(hào)的波動(dòng)。通常因電源接觸不良或瞬時(shí)過載、檢測(cè)器不穩(wěn)定、流動(dòng)相含有氣泡或色譜柱被污染所致。漂移(drift)——基線隨時(shí)間的緩緩變化。主要由于操作條件如電壓、溫度、流動(dòng)相及流量的不穩(wěn)定所引起，柱內(nèi)的污染物或固定相不斷被洗脫下來也會(huì)產(chǎn)生漂移基本概念和術(shù)語色譜峰(peak)——組分流經(jīng)檢測(cè)器時(shí)響應(yīng)的連續(xù)信號(hào)產(chǎn)生的曲線。流出曲線上的突起部分。正常色譜峰近似于對(duì)稱形正態(tài)分布曲線（高斯Gauss曲線）。不對(duì)稱色譜峰有兩種：前延峰(leadingpeak)和拖尾峰(tailingpeak)。前者少見。峰底—基線上峰的起點(diǎn)至終點(diǎn)的距離。峰高(peakheight，h)—峰的最高點(diǎn)至峰底的距離。

基本概念和術(shù)語峰寬（peakwidth，W)—峰兩側(cè)拐點(diǎn)處所作兩條切線與基線的兩個(gè)交點(diǎn)間的距離。W＝4σ半峰寬（peakwidthathalf-height，W1/2)—峰高一半處的峰寬。W1/2＝2.355σ峰面積(peakarea，A)—峰與峰底所包圍的面積。保留時(shí)間(retentiontime，tR)——從進(jìn)樣開始到某個(gè)組分在柱后出現(xiàn)濃度極大值的時(shí)間?；靖拍詈托g(shù)語理論塔板數(shù)(theoreticalplatenumber，N)——用于定量表示色譜柱的分離效率（簡(jiǎn)稱柱效）。分離度(resolution，R)——相鄰兩峰的保留時(shí)間之差與平均峰寬的比值。也叫分辨率，表示相鄰兩峰的分離程度。R≥1.5稱為完全分離?！吨袊幍洹芬?guī)定R應(yīng)大于1.5。理論塔板數(shù)(N)分離度(R)基本概念和術(shù)語拖尾因子(tailingfactor，T)——用以衡量色譜峰的對(duì)稱性。也稱為對(duì)稱因子(symmetryfactor)或不對(duì)稱因子(asymmetryfactor)。《中國藥典》規(guī)定T應(yīng)為0.95~1.05。T＜0.95為前延峰，T＞1.05為拖尾峰。定性或定量通過與對(duì)照品保留時(shí)間的一致性來進(jìn)行定性。定量常用:a:外標(biāo)法b:內(nèi)標(biāo)法液相色譜分離定量常用的基本公式a:外標(biāo)法

含量（CX）=CR×AX/AR

CX為供試品濃度AX為供試品峰面積CR為對(duì)照品濃度AR為對(duì)照品峰面積液相色譜分離定量常用的基本公式b:內(nèi)標(biāo)法

校正因子（f）=

AS×CR/CS×AR

含量（CX）=f×

AX×CS/ASAX為供試品峰面積CX為供試品濃度

AR為對(duì)照品峰面積

CR為對(duì)照品濃度

AS為內(nèi)標(biāo)峰面積CS為內(nèi)標(biāo)濃度對(duì)儀器的一般要求

:除另有規(guī)定外，柱溫為室溫，檢測(cè)器為紫外吸收檢測(cè)器。正文中各品種項(xiàng)下規(guī)定的條件除固定相種類、流動(dòng)相組分、檢測(cè)器類型不得任意改變外，其余如色譜柱內(nèi)徑、長(zhǎng)度、固定相牌號(hào)、載體粒度、流動(dòng)相流速、混合流動(dòng)相各組分的比例、柱溫、進(jìn)樣量、檢測(cè)器的靈敏度等，均可適當(dāng)改變，以適應(yīng)具體品種并達(dá)到系統(tǒng)適用性試驗(yàn)的要求。報(bào)告書書寫內(nèi)容：檢品名稱：******片批號(hào)：200702016檢驗(yàn)項(xiàng)目：中國藥典2005年版二部附錄ⅤD標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定：含******應(yīng)為標(biāo)示量的90.0%～110.0%儀器編號(hào)：YQ.H.測(cè)定日期：室溫：℃色譜柱編號(hào)：色譜柱規(guī)格：4.6mm×250mm色譜柱：固定相C18柱溫：25℃檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)：260nm流動(dòng)相：水—乙腈（60∶40）流速：1ml/min進(jìn)樣量：20μl報(bào)告書書寫內(nèi)容：理論板數(shù)規(guī)定值：按******峰計(jì)算不低于1000測(cè)定值：分離度規(guī)定值：大于1.5測(cè)定值：對(duì)照品名稱：******對(duì)照品批號(hào)：123-200701對(duì)照品來源：中國藥品生物制品檢定所報(bào)告書書寫內(nèi)容：試驗(yàn)方法試驗(yàn)計(jì)算試驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)結(jié)論HPLC日常維護(hù)－總結(jié)定期檢查溶劑過濾器查看過濾器是否變色．臨時(shí)取下過濾器，檢查柱前壓力是否正常．清潔溶劑過濾器將堵塞的溶劑過濾器從瓶頭組件中拿下。先用水沖洗殘留之溶劑，然后將過濾器放在裝有濃硝酸（35％）的燒杯里浸一小時(shí)，不要使用超聲波清洗。用二次蒸餾水徹底沖洗過濾器。建議不使用超聲波清洗機(jī)清洗。將過濾器重新裝好。定期檢查溶劑過濾器建議定期清洗溶劑過濾器及溶劑瓶，每三個(gè)月至少清洗一次。注意：不要使用沒有安裝溶劑過濾器的系統(tǒng)．可能會(huì)嚴(yán)重堵塞系統(tǒng).日常維護(hù)流動(dòng)相應(yīng)經(jīng)過0.45um或更小孔徑的濾器過濾，如果使用濾膜，注意有機(jī)膜與水膜的區(qū)別(聚四氟乙烯能適用于所有溶劑)注意不同檢測(cè)器流通池耐壓?jiǎn)栴}，盡量避免使用pH>9.5的流動(dòng)相，以防腐蝕流通池石英窗，避免使用可能析晶的流動(dòng)相，防止流通池堵塞使用PEEK（polyetheretherketone）管路和接頭需要注意什么問題？如果經(jīng)常需要改變流路或更換不同品牌的色譜柱，使用PEEK材料制成的管路和接頭會(huì)非常方便。PEEK管路容易連接；PEEK接頭不僅無需工具，手?jǐn)Q即可固定，而且容易調(diào)節(jié)錐箍之外的管路長(zhǎng)度，方便與不同品牌或規(guī)格的色譜柱相連接。

使用此類材料的管路需要注意的是：PEEK對(duì)鹵代烷烴和四氫呋喃的兼容性不好。雖然未觀察到上述溶劑溶解PEEK材料的明顯跡象，但PEEK遇到上述溶劑會(huì)變脆。

使用PEEK管路和接頭需要注意什么問題？另一個(gè)需要考慮的因素是壓力限。不銹鋼管可耐受6000psi的壓力，但PEEK管只能耐受近4000psi（但多數(shù)HPLC應(yīng)用系統(tǒng)壓力不會(huì)超過3000psi）。使用PEEK接頭時(shí)則無需擔(dān)心接頭耐溶劑性能，因?yàn)榻宇^幾乎或很少與溶劑直接接觸。但手?jǐn)Q固定的PEEK接頭壓力限低于不銹鋼管，因而壓力高時(shí)，可能會(huì)使接頭在管路上滑動(dòng)而產(chǎn)生死體積或漏液。如何預(yù)防液相泵的故障:

要保持泵的良好操作性能,必須維護(hù)系統(tǒng)的清潔,保證溶劑和試劑的質(zhì)量,對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行過濾和脫氣.下面列出預(yù)防泵故障的幾項(xiàng)措施:

1)用高質(zhì)量試劑和HPLC級(jí)溶劑；

2）過濾流動(dòng)相和溶劑；

3）脫氣；

4）每天開始使用時(shí)放空排氣，工作結(jié)束后從泵中洗去緩沖液；

5）不讓水或腐蝕性溶劑滯留泵中；高效液相色譜中

常遇見的問題及處理方法

基線噪音大可能由那些原因引起

可能原因是：泵壓不穩(wěn)，流動(dòng)池有氣泡，流動(dòng)池被污染，對(duì)紫外檢測(cè)器可將流動(dòng)池移走即可確認(rèn)。色譜柱污染，系統(tǒng)管路污染。燈能量不足，光學(xué)系統(tǒng)老化或污染，參數(shù)設(shè)計(jì)不合理。外界因素影響，如電源，溫度和濕度，震動(dòng)，等。峰面積重現(xiàn)性不好1.首先觀察壓力是否穩(wěn)定，以及觀察峰面積變化是否有規(guī)律。若壓力不穩(wěn)定，請(qǐng)檢查造成壓力不穩(wěn)定的因素，如：漏液，排液時(shí)間不足夠，鹽濃度過高導(dǎo)致鹽析，主動(dòng)閥比例閥內(nèi)漏，等。

2.若壓力穩(wěn)定但峰面積呈無規(guī)律變化，請(qǐng)檢查樣品是否足夠，確認(rèn)樣品的穩(wěn)定性，必要時(shí)重新配制。檢查進(jìn)樣閥是否漏液。等。

3.若壓力穩(wěn)定且峰面積呈規(guī)律變化，多數(shù)為色譜柱未平衡好。保留時(shí)間不穩(wěn)定1.

首先觀察保留時(shí)間是否有規(guī)律的變化，并同時(shí)觀察壓力是否穩(wěn)定，若壓力穩(wěn)定而保留時(shí)間呈有規(guī)律變化，多數(shù)是色譜柱未平衡好，特別是含有的流動(dòng)相，需較長(zhǎng)的時(shí)間去平衡。2.若壓力穩(wěn)定而保留時(shí)間無規(guī)律變化，請(qǐng)檢查溶劑過濾頭及真空腔是否有堵塞。再平衡色譜柱足夠時(shí)間，如仍然不佳，可更換一色譜柱。3.若壓力不穩(wěn)定，請(qǐng)檢查造成壓力不穩(wěn)定的因素，如：漏液，排液時(shí)間不足夠，鹽濃度過高導(dǎo)致鹽析，主動(dòng)閥比例閥內(nèi)漏，等。一、保留時(shí)間縮短

1.流速增加2.樣品超載3.鍵合相流失4.流動(dòng)相組成變化5.溫度增加1.檢查泵,重新設(shè)定流速2.降低樣品量3.流動(dòng)相PH值保持在3～7.5

檢查柱的方向4.防止流動(dòng)相蒸發(fā)或沉淀5.柱恒溫二、保留時(shí)間延長(zhǎng)

1.流速下降2.硅膠柱上活性點(diǎn)變化3.鍵合相流失4.流動(dòng)相組成變化5.溫度降低1.管路泄漏,更換泵密封圈,排除泵內(nèi)氣泡2.用流動(dòng)相改性劑,如加三乙胺,或采用堿至鈍化柱3.流動(dòng)相PH值保持在3～7.5檢查柱的方向4.防止流動(dòng)相蒸發(fā)或沉淀5.柱恒溫三

、出現(xiàn)肩峰或分叉

1.樣品體積過大2.樣品溶劑過強(qiáng)3.柱塌陷或形成短路通道4.柱內(nèi)燒結(jié)不銹鋼失效5.進(jìn)樣器損壞1.用流動(dòng)相配樣,總的樣品體積小于第一峰的15%2.采用較弱的樣品溶劑3.更換色譜柱,采用較弱腐蝕性條件4.更換燒結(jié)不銹鋼,加在線過濾器,過濾樣品5.更換進(jìn)樣器轉(zhuǎn)子四、鬼峰

1.進(jìn)樣閥殘余峰2.樣品中未知物3.柱未平衡4.三氟乙酸(TFA)氧化(肽譜)5.水污染(反相)1.每次用后用強(qiáng)溶劑清洗閥,改進(jìn)閥和樣品的清洗2.處理樣品3.重新平衡柱,用流動(dòng)相作樣品溶劑

(尤其是離子對(duì)色譜)4.每天新配,用抗氧化劑5.通過變化