禽流感核酸檢考核結(jié)果匯報(bào)

2007年禽流感核酸檢測(cè)考核結(jié)果匯報(bào)12核酸檢測(cè)是禽流感檢測(cè)的一種重要手段

快速、靈敏、特異性高多種因素影響檢測(cè)的結(jié)果標(biāo)本的采集核酸的提取反應(yīng)體系的優(yōu)化，包括引物探針的設(shè)計(jì)，試劑的選擇熟練的操作

良好的實(shí)驗(yàn)室管理3

2005年以來(lái)中國(guó)大陸h5n1人禽流感確診病例實(shí)驗(yàn)室診斷

病例數(shù)病毒分離核酸檢測(cè)血清學(xué)檢測(cè)22++

3++2+1+1

+

42006年核酸考核：參考品制備和網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室評(píng)價(jià)檢測(cè)。制備標(biāo)準(zhǔn)品包括：病毒裂解液、體外轉(zhuǎn)錄rna、樣品包括不同檢測(cè)的靈敏度設(shè)灰色檢測(cè)區(qū)、統(tǒng)一配發(fā)核酸提取試劑和引物。2007年核酸考核：了解各省禽流感核酸檢測(cè)能力

考核標(biāo)本：病毒裂解液、不同時(shí)發(fā)放核酸提取試劑和引物

流感網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室核酸考核進(jìn)程07年考核目的

深入了解各省份禽流感核酸檢測(cè)能力的基本情況。了解各省禽流感核酸檢測(cè)工作中可能存在的實(shí)際問(wèn)題。了解核酸檢測(cè)工作的不足并確定下一步的工作重點(diǎn)。5組織形式

本次考核由中國(guó)cdc發(fā)文，國(guó)家流感中心執(zhí)行。本次考核定位為基礎(chǔ)水平考核，并附有情況調(diào)查表。本次考核標(biāo)本發(fā)放全國(guó)31個(gè)?。ㄗ灾螀^(qū)、直轄市）的流感網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室，考核時(shí)間為1個(gè)月。本次考核內(nèi)容為鑒定10份盲樣的型別及亞型。6考核標(biāo)本的設(shè)計(jì)考核標(biāo)本共10份盲樣，均為病毒裂解液。分別為禽流感h5n1標(biāo)本4份，h9n2標(biāo)本1份，h3n2和b型混合標(biāo)本1份，h1n1標(biāo)本1份，b型標(biāo)本1份，陰性標(biāo)本2份，病毒濃度均控制在易檢范圍之內(nèi)。h5n1標(biāo)本為病毒原液10-1-10-4的梯度稀釋?zhuān)源私Y(jié)果來(lái)判定核酸檢測(cè)的靈敏度是否合格；h3n2標(biāo)本混有b型，此項(xiàng)內(nèi)容考核結(jié)果判定；陰性標(biāo)本考核是否有交叉污染出現(xiàn)。7所用毒株名稱(chēng)：h1n1:a/jiangsuxinghua/33/2007h3n2:a/jiangsuguangling/316/2007b:by/fujianggulou/1774/2007h5n1：a/xinjiang/1/2006(h5n1)h9n2:a/chicken/foshan/48/98(h9n2)8標(biāo)本亞型amct值h5ct值n1

ct值h510-117.3216.2719.24h510-222.0020.9722.46h510-324.9023.8527.46h510-427.9027.6930.59h510-530.7430.5533.15h118.17h316.68h920.869考核標(biāo)本的定量結(jié)果10

考核標(biāo)本的制備1.穩(wěn)定性檢測(cè)：

冰盒內(nèi)室溫4天。

冰盒內(nèi)室溫4天，后-20度2周。2.可重復(fù)性驗(yàn)證：

不同儀器

不同操作人

不同標(biāo)本抽樣

運(yùn)輸和結(jié)果提交情況

本次考核標(biāo)本發(fā)放全國(guó)31個(gè)?。ㄗ灾螀^(qū)、直轄市），到截止日期為止除西藏外所有被考核實(shí)驗(yàn)室均提交了結(jié)果。

本次考核標(biāo)本在運(yùn)輸過(guò)程中均未出現(xiàn)問(wèn)題，接受標(biāo)本時(shí)均有干冰存在并無(wú)液體漏出。國(guó)家流感中心11考核結(jié)果22個(gè)省份結(jié)果正確，河北、遼寧、黑龍江、云南、貴州五省h3n2+b標(biāo)本由于實(shí)驗(yàn)思路不同未檢出b型，黑龍江未檢測(cè)出h3,用an2引物檢測(cè)出n2亞型。陜西沒(méi)有檢出h9只檢出了n2。寧夏、貴州兩省h5n1的10-4稀釋度標(biāo)本未檢出。廣西首次h5n1與h9n2均未檢出，第二次提交全部正確。陰性標(biāo)本均無(wú)問(wèn)題，沒(méi)有污染情況發(fā)生。國(guó)家流感中心12考核結(jié)果分析完整的標(biāo)注應(yīng)當(dāng)有樣品名，引物名，片斷大小，marker梯度等等。13考核結(jié)果分析：實(shí)驗(yàn)結(jié)果標(biāo)注不清

很多省份標(biāo)注不夠規(guī)范。國(guó)家流感中心14考核結(jié)果分析國(guó)家流感中心15考核結(jié)果分析realtime結(jié)果應(yīng)該有兩個(gè)圖，一個(gè)應(yīng)包含陽(yáng)性曲線(xiàn)和域值線(xiàn)的情況并標(biāo)明所用引物和樣品名稱(chēng)，另一個(gè)應(yīng)包含機(jī)器顯示的ct值。16我們發(fā)放的禽流感引物和人季節(jié)性流感引物在同種亞型之間是可能存在交叉的，7號(hào)其實(shí)是h3n2標(biāo)本?？己私Y(jié)果分析：引物交叉情況說(shuō)明h9n2的n2引物與h3n2的交叉情況17考核結(jié)果分析：引物交叉情況說(shuō)明甲型鑒定引物的交叉情況18考核結(jié)果分析：鑒定的思路國(guó)家流感中心19考核結(jié)果分析：鑒定的思路國(guó)家流感中心20考核結(jié)果分析：鑒定的思路21考核結(jié)果分析：rt-pcr國(guó)家流感中心22考核結(jié)果分析：rt-pcr23考核結(jié)果分析：realtime結(jié)果

所提交的結(jié)果當(dāng)中25個(gè)省份做了realtime，其中18個(gè)省份結(jié)果較好主要存在的問(wèn)題：實(shí)驗(yàn)體系沒(méi)有對(duì)照。對(duì)儀器操作不夠熟悉。24考核結(jié)果分析：realtime結(jié)果25考核結(jié)果分析：realtime結(jié)果26下一步工作方向

進(jìn)一步完善和優(yōu)化鑒定引物。進(jìn)一步優(yōu)化反應(yīng)體系。優(yōu)化實(shí)驗(yàn)和結(jié)果判定方案。27實(shí)驗(yàn)室管理pcr儀器配置情況常用試劑及耗材供應(yīng)商情況

個(gè)人防護(hù)設(shè)備檢測(cè)標(biāo)本的內(nèi)容及檢測(cè)方法的應(yīng)用調(diào)查結(jié)果問(wèn)卷調(diào)查情況1.各省級(jí)cdcpcr儀器配置情況儀器設(shè)備非常好上海市、浙江省、廣東省（pcr儀三臺(tái)，real-timepcr儀兩臺(tái)）儀器設(shè)備較好黑龍江、安徽、江西、甘肅、寧夏回族自治區(qū)（兩種類(lèi)型的pcr儀各有兩臺(tái))儀器設(shè)備充足具備pcr儀、real-timepcr各一臺(tái)儀器名稱(chēng)n0臺(tái)1臺(tái)2臺(tái)3臺(tái)n％n％n％n％常規(guī)pcr儀realtimepcr儀3030103.30101733.356.7161353.343.330100表1各省級(jí)cdcpcr儀配置情況2.各省級(jí)cdc常用試劑及耗材供應(yīng)商情況流感中心推薦使用的試劑和耗材常用試劑（takara）promega、qiagen（常用）roche、sigma的試劑（發(fā)達(dá)省份）供應(yīng)商名稱(chēng)nn%rocheqiagensigmainvitrogenpromega其它30303030303063064148201006013.346.726.7表2各省級(jí)cdc常用試劑及耗材供應(yīng)商情況供應(yīng)商名稱(chēng)nn％axygengrienercostar其它303030302869493.3203013.3表3各省級(jí)cdc常用耗材供應(yīng)商情況3.個(gè)人防護(hù)設(shè)備各省級(jí)cdc個(gè)人防護(hù)設(shè)備基本齊全個(gè)別省級(jí)cdc缺少個(gè)別防護(hù)設(shè)備如有的cdc缺少n95口罩，有些省缺少面罩。個(gè)人防護(hù)設(shè)備nn％連體防護(hù)服護(hù)目鏡面罩防護(hù)鞋套n95口罩3030303030302925302910096.783.310096.7表4各省級(jí)cdc個(gè)人防護(hù)設(shè)備4.檢測(cè)標(biāo)本的內(nèi)容及檢測(cè)方法的應(yīng)用遼寧、上海、山東、湖南4個(gè)省級(jí)cdc除了對(duì)人類(lèi)標(biāo)本樣品進(jìn)行流感病毒檢測(cè)之外，還對(duì)動(dòng)物來(lái)源的樣品進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)對(duì)各省級(jí)cdc禽流感檢測(cè)方法應(yīng)用的調(diào)查可以反映出各省級(jí)cdc日常檢測(cè)工作的內(nèi)容。廣西壯族自治區(qū)cdc日常工作的內(nèi)容僅為快速流感檢測(cè)，而河北、上海、浙江、河南、廣東5個(gè)省級(jí)cdc除了調(diào)查表中提到的4個(gè)檢測(cè)方法的應(yīng)用外，還分別進(jìn)行不同類(lèi)別的檢測(cè)，如爆發(fā)疫情的檢測(cè)、人流感病毒亞型的鑒別、呼吸道病毒鑒別診斷、不明原因肺炎病例檢測(cè)、環(huán)境標(biāo)本檢測(cè)。檢測(cè)內(nèi)容/檢測(cè)方法的應(yīng)用nn％檢測(cè)內(nèi)容-檢測(cè)人類(lèi)標(biāo)本-檢測(cè)動(dòng)物標(biāo)本檢測(cè)方法應(yīng)用-禽流感疑似病例標(biāo)本檢測(cè)-有病禽接觸史病人的監(jiān)測(cè)-快速流感檢測(cè)-流感病毒亞型檢測(cè)-其它類(lèi)別的檢測(cè)3030303030303030429192826510013.396.763.393.386.716.7表5各省cdc檢測(cè)標(biāo)本內(nèi)容和檢測(cè)方法應(yīng)用5.實(shí)驗(yàn)室的管理通過(guò)對(duì)生物安全工作、實(shí)驗(yàn)分區(qū)、標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程以及實(shí)驗(yàn)相關(guān)信息記錄等4個(gè)方面考察各省cdc實(shí)驗(yàn)室管理的情況。調(diào)查方面nn％生物安全工作

-生物安全水平

bsl-2bsl-3-生物安全說(shuō)明或sop-實(shí)驗(yàn)人員定期培訓(xùn)

-員工上崗資格認(rèn)證

-指定人員負(fù)責(zé)生物安全3030303030302553030303083.316.7100100100100表6各省cdc實(shí)驗(yàn)室管理情況調(diào)查方面nn％實(shí)驗(yàn)分區(qū)

-樣品處理和檢測(cè)有獨(dú)立實(shí)驗(yàn)室

-樣品接收有獨(dú)立房間或指定區(qū)域

-體系配制有獨(dú)立房間或指定區(qū)域

-核酸提取有獨(dú)立房間或指定區(qū)域-pcr產(chǎn)物檢測(cè)有獨(dú)立房間或指定區(qū)域有如下操作規(guī)程

-病毒rna提取

-rt-pcr檢測(cè)-核酸電泳檢測(cè)

-核酸電泳

-污染控制303030303030303030301429303030303030302983.316.710010010010010010010096.7調(diào)查方面nn％實(shí)驗(yàn)相關(guān)信息記錄

-檢測(cè)日期

-樣品編號(hào)

-試劑貨號(hào)

-試劑保質(zhì)日期

-實(shí)驗(yàn)操作人員簽名

-共同檢測(cè)人員簽名不同標(biāo)本保存溫度得當(dāng)

-原始樣品

-病毒核酸

-cdna-pcr產(chǎn)物303030303030303030303030302930303030302910010010096.7100100100100100100存在個(gè)別的問(wèn)題1pcr儀器設(shè)備不全2檢測(cè)方法應(yīng)用內(nèi)容少3實(shí)驗(yàn)室分區(qū)不明確從這次問(wèn)卷調(diào)查的結(jié)果看，各個(gè)省級(jí)cdc網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室的總體水平良好，但是仍有一些問(wèn)題存在。調(diào)查總結(jié)本次問(wèn)卷的調(diào)查的目的在于對(duì)各省級(jí)cdc流感/禽流感檢測(cè)網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室的儀器配置，試劑和耗材的使用、個(gè)人防護(hù)設(shè)備、檢測(cè)工作內(nèi)容及應(yīng)用，以及實(shí)驗(yàn)室的管理等方面進(jìn)行了解和促進(jìn)。作為流感/禽流感檢測(cè)的網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)不僅需要良好的是實(shí)驗(yàn)儀器及防護(hù)設(shè)備的配置，來(lái)保證日常工作快速、安全的運(yùn)轉(zhuǎn)，同時(shí)也需要在實(shí)驗(yàn)室的管理上進(jìn)行提高，從而使得檢測(cè)結(jié)果的高標(biāo)準(zhǔn)和可重復(fù)性。nic推薦one-steppcr引物更新目的基因原使用引物新推薦引物引物序列甲型amflua-m-f65flua-m-r400m336bpflua-m-f173flua-m-r382am209bpflua-m-f30flua-m-r2645’-ttctaaccgaggtcgaaacg-3’5’-acaaagcgtctacgctgcag-3’h5h5ha-f920h5ha-r1138h5ha-f248h5-r6475’-gtgacgaattcatcaatgtrccg-3’5’-ctctggtttagtgttgatgtyccaa-3’n1an1-f550an1-r1164an1-f580an1-r9185’-tgaagtacaatggcataataacwgacac-3’5’-ccactgcatatatatcctatttgatactcc-3’注：原推薦引物仍可使用內(nèi)參rnp（ribonucleasep：核糖核酸酶）序列44基因引物和探針序列rnprnp-forward

rnp-reverse5’-agatttggacctgcgagcg-3’5’-gagcggctgtctccacaagt-3’rnp-probe5’-ttctgacctgaaggctctgcgcg-3’samplencpcrnp