醋酸纖維薄膜電泳 原理 步驟 詳細(xì)

李莉醋酸纖維薄膜電泳

Celluloseacetatemembraneelectrophoresis，CAME.講課內(nèi)容

醋酸纖維素

1

醋酸纖維薄膜的特點(diǎn)

2

影響電泳結(jié)果的因素

3

血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳

4.一、醋酸纖維素（Celluloseacetate）

是纖維素醋酸酯(acetateesterofcellulose)，由纖維素的羥基進(jìn)行乙?；笾频茫瑢⑺苡谟袡C(jī)溶劑涂抹成均勻的薄膜，待有機(jī)溶劑揮發(fā)后，即為白色不透明的醋酸纖維薄膜厚度：0.15mm.MagnificationofCelluloseAcetatefilter

.講課內(nèi)容

醋酸纖維素

1

醋酸纖維薄膜的特點(diǎn)

2

影響電泳結(jié)果的因素

3

血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳

4.二、醋酸纖維薄膜的特點(diǎn)

CharacteristicsofCelluloseAcetateMembrane

1.吸附作用小2.電滲(electroosmosis)作用小3.需加樣量少4.親水性較小

.血清蛋白質(zhì)各組分的相對分子重量及等電點(diǎn)

MolecularweightandisoelectricpointofserumproteinsserumproteinMW

pIAlb12

6624813000020000013000001500000

4.865.025.025.126.8～7.3

.Amidoblack10B.氨基黑10B染色洗脫法結(jié)果蛋白組分

平均值（%）

參考范圍

（%）Alb1265.593.126.169.0917.4057.45～71.731.76～4.484.04～8.286.79～11.3911.85～22.97.PonceauS.麗春紅S染色掃描法結(jié)果

蛋白組分

g/L

占蛋白百分?jǐn)?shù)（%）

Alb

35～5257～681

1.0～4.01.0～5.72

4.0～8.04.9～11.2

5.0～10.07.0～13

6.0～13.09.8～18.2.Schematicrepresentationofaproteinelectrophoresis

.幾種疾病的蛋白電泳變化

Abnormalserumproteinelectrophoresis病名

Alb

1

2

腎病肝硬化原發(fā)性肝癌多發(fā)性骨髓瘤慢性炎癥無丙種球蛋白癥雙白蛋白血癥↓↓↓↓↓↓↓

↑↓AFP

↑↑↑↓

↑

↑-橋

↑

↓↑↑↑↑↑↑↓↓

..-橋..雙白蛋白血癥.講課內(nèi)容

醋酸纖維素

1

醋酸纖維薄膜的特點(diǎn)

2

影響電泳結(jié)果的因素

3

血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳

4.三、影響電泳結(jié)果的因素

Factorsaffectingresults1.

電泳圖譜不齊①點(diǎn)樣時(shí)血清點(diǎn)加不均勻②薄膜局部干燥③電泳時(shí)供給薄膜的液量不均勻或過少④緩沖液變質(zhì)⑤電泳時(shí)薄膜位置不正,與電流方向不平行

.2.電泳圖譜分離不清①標(biāo)本加量過多②電流過低③薄膜結(jié)構(gòu)過分致密，透水性差④薄膜表面干燥.3.

電泳速度慢①電流過低②供給薄膜的液量不足③電泳時(shí)溫度過低④緩沖液離子強(qiáng)度過高⑤薄膜中雜質(zhì)多.4.

白蛋白（Albumin)區(qū)帶中間部分不著色，染色不足可能為染料使用過久或加血清(Serum)過多5.γ球蛋白(γ-globin)向反方向移動(dòng)主要因?yàn)殡姖B（electro-osmosis）現(xiàn)象可升高緩沖液液面或加大電流量加以改進(jìn)，并注意兩側(cè)電泳槽內(nèi)緩沖液液面是否在同一水平。.講課內(nèi)容

醋酸纖維素

1

醋酸纖維薄膜的特點(diǎn)

2

影響電泳結(jié)果的因素

3

血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳

4.血清蛋白質(zhì)醋酸纖維薄膜電泳

Separateserumproteinincelluloseacetatemembraneelectrophoresis

.[原理]CAME是以醋纖膜（CAM）作支持物的一種區(qū)帶電泳技術(shù)。將血清樣品點(diǎn)樣于醋纖膜上，在pH8.6的緩沖液中電泳時(shí)，血清蛋白質(zhì)均帶負(fù)電荷移向正極。由于血清中各蛋白組分等電點(diǎn)不同而致表面凈電荷量不等，加之分子大小和形狀各異，因而電泳遷移率不同，彼此得以分離。Ionshavedifferentmigrationratesdependingontheirtotalcharge,size,andshape,andcanthereforebeseparated.

.EQV=————6r

.[器材和試劑]1.器材（1）醋酸纖維薄膜（8×2mm）（2）點(diǎn)樣器（3）染色皿，漂洗器，鑷子（4）722型分光光度計(jì)（5）電泳儀：直流電源整流器，水平電泳槽2.試劑（1）巴比妥緩沖液（pH8.6I=0.06）（2）氨基黑10B染色液（3）漂洗液：95%乙醇、冰醋酸、H2O（4）洗脫液：0.4mol/LNaOH.[操作]1.將電泳槽置于水平平臺(tái)上。將緩沖液注入電泳槽中兩邊的電極槽緩沖液的高度要在同一點(diǎn)平面上2.在醋纖膜一端欲點(diǎn)樣處作好標(biāo)記，然后將薄膜放進(jìn)緩沖液中，濕潤速度按膜吸收緩沖液的快慢而定，應(yīng)讓其自然浸潤3.將充分浸透（指膜上沒有白色斑痕）的薄膜取出，用濾紙吸去膜上過多的緩沖液4.用加樣器蘸取血清（約5ul）,垂直印在CAM粗糙面上，待樣品全部滲入薄膜內(nèi)后，移開點(diǎn)樣器.醋酸纖維素薄膜規(guī)格及點(diǎn)樣位置示意圖.5．電泳(Electrophoresis)（1）加樣后，將薄膜條架于支架兩端，無光澤面朝下（點(diǎn)樣面），點(diǎn)樣側(cè)置于陰極端，膜兩側(cè)分別塔上紗布，紗布一端垂入緩沖液中。薄膜應(yīng)位正，平直無彎曲，加上槽蓋平衡5分鐘后通電電泳（2）正確連接電泳槽與整流器對應(yīng)的正負(fù)極。開啟電源通電。電壓10~15V/cm膜總寬。電泳40~60分鐘，泳動(dòng)距離約達(dá)3.5~4cm時(shí)即可斷電.醋酸纖維素薄膜電泳裝置示意圖.6.染色(Stain)電泳完畢后斷電，用鑷子取出薄膜條投入染液5~10分鐘，染色過程中不時(shí)輕輕晃動(dòng)染色皿，使染色充分7．漂洗(Wash)從染液中取出薄膜條并盡量瀝去染液，投入漂洗皿中反復(fù)漂洗，直至背景漂盡為止。此時(shí)清晰可見5條色帶，待干..8.定量(Quantify)（1）洗脫比色：將各蛋白質(zhì)區(qū)帶仔細(xì)剪下，分置各試管中，另從空白背景剪塊平均大小的膜條置于空白管中。各管加入0.4mol/lNaOH4ml,于37℃水浴20分鐘（不時(shí)振蕩），待顏色脫凈即用波長620nm比色，以空白管調(diào)零讀取各管吸光度。（2）計(jì)算吸光度總和（T）=A+α1+α