雙重或多重免疫組化標記

第六章雙重或多重免疫組化標記(p111)1精選ppt一、基本原理

雙重或多重標記是利用免疫學和細胞化學原理，在同一張切片上同時采用或先后采用不同顏色的熒光色素或酶促產(chǎn)物，或采用不同直徑大小顆粒膠體金來原位示蹤組織或細胞內(nèi)不同抗原大分子物質(zhì)的一項標記染色技術。2精選ppt由于此項技術可在同一張切片上同時顯示兩種或兩種以上不同抗原成分(定性、定位、定量)，因而使組織內(nèi)不同抗原成分相互間功能關系的觀察更加直觀，操作需遵循的原則和要求基本上與單標免疫組化方法雷同，但差異是流程長，脫片機率更高，前后重染色試劑間有交叉干擾等。3精選ppt4精選ppt5精選ppt二、技術類型（一）雙重或多重免疫熒光標記染色采用呈現(xiàn)不同顏色的熒光色素配伍，分別標記不同的抗體，再通過各自與同一切片上的相應抗原特異性結合而加以區(qū)別顯示所建立起來的雙重或多重免疫組化染色技術。6精選ppt

熒光素配伍：異硫氰酸熒光素(FITC）——翠綠色，常與羅丹明(RB200)或異硫氰酸四甲基羅丹明（TRITC）配伍，后者呈紅色。

方法敏感、特異，需選用各自特定的激發(fā)濾光片分別觀察或二次曝光顯影，樣本不能長期保存，組織結構背景不清晰。7精選ppt技術類型有直接法和間接法之分。前者特異、快速，后者敏感、多用。所用抗體試劑可為異種動物抗體，也可為同種動物抗體。異種動物抗體?；旌蠎?，操作步驟少，脫片率相對較低。8精選ppt同種動物抗體多分別應用，操作步驟加倍，脫片機率相對較高，前后重免疫熒光標記交叉重疊機會多，需用酸性洗脫或多聚甲醛蒸氣處理。9精選ppt

操作舉例：垂體腺瘤----ACTH與GH雙重免疫熒光標記染色（間接法）(1)石蠟切片，厚5μm，常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，入PBS(pH7.4,0.01mol/L)。10精選ppt(2)1％人血清白蛋白（HAS）孵育10min（亦可用10％正常羊血清代之），不洗。(3)抗ACTH血清（McAb）1:200，孵育30min37℃，濕盒。(4)0.05mol/LTBS(pH7.4,內(nèi)含1％Triten×100,下同)洗，10min×3。11精選ppt(5)羊抗鼠IgG-TRITC1:100，濕盒，室溫避光反應1h。(6)0.05mol/LTBS(pH7.4)洗，10min×3，(第一重ACTH-TRITC標記染色已完成)。12精選ppt(7)切片逐級酒精脫水，二甲苯透明，空氣干燥后，置于裝有多聚甲醛粉末的密閉容器內(nèi)，放在80℃烤箱或溫箱內(nèi)以甲醛蒸氣固定2～4h，使第一重染色中二抗的抗原結合部位失活。(8)切片以TBS洗，5min×413精選ppt(9)1％HSA（或10％正羊血清）孵育30min，室溫，濕盒，不洗。(10)抗GH血清(McAb)1:400，孵育30min，37℃，濕盒。(11)0.05mol/LTBS(pH7.4)洗，10min×314精選ppt(12)羊抗鼠IgG-FITC1:100,濕盒，室溫避光反應1h。(13)0.05mol/LTBS(pH7.4)洗，10min×3(第二重GH-FITC標記染色完成)。(14)緩沖甘油封片。15精選ppt(15)熒光顯微鏡下分別以546nm及490nm波長的激發(fā)光觀察切片組織內(nèi)TRITC及FITC所標示的ACTH及GH抗原（TRITC陽性細胞呈紅色，F(xiàn)ITC陽性細胞呈綠色）。16精選ppt(16)用彩色底片對切片同一部位用546nm及490nm波長激發(fā)光分別作兩次曝光，即可在同一張照片上顯示不同顏色標示的ACTH與GH兩種抗原。17精選pptTRITC-GAMIgG鼠抗人ACTH（IgG）TITC-GAMIgG鼠抗人GH（IgG）T游離FabTTTFGH抗原ACTH抗原FFab被滅活圖1同種動物抗體間接法（分步固定）雙重免疫熒光熒色原理18精選ppt（二）雙重或多重免疫酶標記染色以酶催化不同底物呈現(xiàn)不同顏色產(chǎn)物標示同一切片內(nèi)兩種或兩種以上抗原為理論基礎所建立起來的多重免疫標記染色方法。特點是光鏡下可以同時觀察和對比，樣品保存時間相對較長，一次曝光即可成像，故較雙重免疫熒光染色法更為常用。19精選ppt

★常用標記酶與底物的配伍

單酶雙底物--HRP--DAB(棕色):4CN(藍色)AEC(紅色):4CN(藍色)AP-萘酚AS-MX-堅固紅(fastred紅色)-堅固藍(fastblue藍色)20精選ppt雙酶雙底物--HRP(DAB):AP(萘酚AS.MX-堅固藍)HRP(4CN):AP(萘酚AS.MX-堅固紅)（直接法、間接法、橋法均可使用，靈敏度以橋法中的復合物法最高，特異性則以直接法最佳）21精選ppt操作方法類同單酶標記，有直接法、間接法、復合物法之分。間接法與復合物法較常采用?！锊僮髋e例淋巴瘤輕鏈κ、λ的雙重酶標記（雙酶雙底物）22精選ppt(1)石蠟切片常規(guī)脫蠟進水（若用含汞固定液固定的組織則需用0.5%碘的乙醇溶液脫汞5min，乙醇濃度為70％，經(jīng)自來水洗后，以2.5%硫代硫到鈉浸洗1min，水洗)；(2)0.3%H2O2甲醇液浸泡切片30min,自來水洗，蒸餾水洗,入PBS(0.01mol/LpH7.2);23精選ppt(3)滴加正羊血清1:10，濕盒，室溫，10min，不洗；(4)加一抗(抗人κPcAb與抗人λMcAb的混合液)1:200，濕盒，37℃，45min或更長；(5)PBS液，5min×324精選ppt(6)加二抗(GARG＋GAMG混合液1:200)，溫盒，37℃，30min；(7)PBS洗，5min×3;(8)加酶抗酶抗體復合物(兔PAP＋鼠APAAP混合液1:100)，濕盒，37℃，30min；(9)PBS洗，5min×3；25精選ppt(10)過氧化物酶顯色反應：以DAB-H2O2液顯色7～10min(鏡下控制顯色程度)，PBS洗，5min×3；(11)鹼性磷酸酶顯色反應：以萘酚AS.MX及堅固藍(fastblue)顯色10～15min(鏡下控制顯色程度)，PBS洗、自來水洗；(12)緩沖甘油封片，光鏡下觀察26精選pptPPPAAAκλ圖2雙酶雙底物(復合物法)雙重酶標染色原理兔PAPGARIgG兔抗KAg鼠APAAPGAM.IgG鼠抗人27精選ppt注：若用同種動物抗血清分別進行標記染色時，尚需考慮在前后重染色之間是否設置“多聚甲醛蒸氣處理2-4h（封閉固定）或用pH2.2的甘氨酸---鹽酸溶液處理2h（酸洗脫）的操作步驟”，目的為了避免前后重免疫試劑間的交叉反應。可視預實驗結果來確定。

28精選ppt（三）雙重及多重免疫金標記(電鏡）電鏡下的雙重免疫標記染色不是靠顏色區(qū)分，而是靠標記物的不同電子密度或顆粒的不同大小來區(qū)別不同抗原，有別于光鏡下的雙重免疫標記方法。29精選ppt常用的方法多為雙重免疫金標記

優(yōu)點：高電子密度，分辨率高，抗原定位精確，顆粒大小可人工控制，標記試劑易制備。

缺點：試劑質(zhì)量要求高，非特異吸附干擾大(背景)30精選ppt類型有直接法、間接法（異種動物抗體或同種動物抗體）----雙面染色，分步固定。標記用的膠體金顆粒，直徑多采用5nm,15nm組合，標記不同類別抗體(特異性一抗---直接法，間接抗體---間接法)。31精選ppt應用直接法進行多標，簡便、快速、準確、效果佳，尤多用于細胞表面抗原的雙重或多重標記。缺點：敏感性較低，金標抗體純度要求高。32精選ppt金標抗體雙重抗原標記常用間接法顯示，且多采用異種動物抗體混合同步操作。優(yōu)點：敏感性提高，操作步驟減少缺點：標記二抗質(zhì)量要求高，背景染色深。可通過采用固相吸附或過量二抗封閉，或用多聚甲醛蒸氣處理，使二抗的游離抗原結合部位（Fab段）滅活加以克服。33精選ppt

*舉例：垂體組織生長激素(GH)和促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)雙重免疫電鏡染色(間接法)----分步固定。(1)取新鮮垂體腺瘤組織1mm3，蒸餾水洗，不經(jīng)餓酸固定，常規(guī)酒精脫水，用Lowicrylk4M包埋，超薄切片厚40nm，置無支持膜的鎳網(wǎng)上；34精選ppt(2)以0.05mol/LTBS(pH7.4含1％TritonX-100，下同)，浸洗5min；(3)加入1％HSA5min；不洗；(4)以兔抗ACTH血清(1:200)孵育，4℃，20h，室溫下2h，TBS洗，用上述一抗重復孵育1次，TBS噴射沖洗，然后浸洗10min，3次，TBS(pH8.2)浸洗5min；35精選ppt(5)0.02mol/LTBS(pH8.2)浸洗5min；(6)1％HSA孵育5min，不洗；再以5nm膠體金標記的羊抗兔，IgG孵育10min；0.02mol/LTBS(pH8.2)噴射沖洗，0.05mol/LTBS(pH7.4)沖洗及浸洗，時間同前；36精選ppt(7)蒸餾水浸洗后，空氣中干燥；(8)置盛有多聚甲醛粉末的密閉容器內(nèi)，80℃溫箱中以多聚甲醛蒸氣處理1h，冷卻取出，入蒸餾水，換洗2次。37精選ppt(9)再按(4)----(8)步驟作第二重抗原染色，這次一抗用鼠抗GH單克隆抗體(1:400)；二抗用15nm膠體金標記的羊抗鼠IgG，在二抗孵育并清洗后，入2％的戊二醛及3％多聚甲醛的TBS(pH7.4)溶液中固定30min，經(jīng)蒸餾水換洗3次，再以1％醋酸鈾和構櫞酸鉛作常規(guī)電子密度的染色。38精選ppt(10)電鏡觀察結果：見ACTH細胞和GH細胞的分泌顆粒分別被5nm和15nm的膠體金顆粒所顯示，除很少量背景染色外，標記位置精確，無交叉重疊與彌散現(xiàn)象。39精選ppt（四）其它雙重標記法

1.免疫熒光法與免疫酶法聯(lián)合應用(先酶標

后熒光)；

2.免疫熒光法與免疫金銀法聯(lián)合應用(先免疫金銀標記后熒光標記)；

3.免疫酶法與免疫金法聯(lián)合應用(20nm,紅

色），此法忌用銀液放大，易吸附干擾；

4.免疫金銀法與免疫酶法聯(lián)合應用(對比明

顯)。

40精選ppt三、注意事項

1.標記染色的順序確定需視組織標記抗原的性質(zhì)，量少、脆弱先標記，量多、耐受后標記