結(jié)核分枝桿菌熒光定量pcr檢測方法的建立及應(yīng)用

----------結(jié)核分枝桿菌熒光定量PCR檢測方法的建立與應(yīng)用目的建立結(jié)核分枝桿菌的熒光定量PCR檢測方法,探討熒光PCR檢測痰標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌的應(yīng)用價值。方法根據(jù)結(jié)核分枝桿菌基因保守序列設(shè)計引物和探針，并構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品。對102例培養(yǎng)涂陽的結(jié)核痰液標(biāo)本和45例非結(jié)核感染者的痰標(biāo)本，應(yīng)用熒光定量PCR法、痰涂片抗酸染色法檢測結(jié)核分枝桿菌。結(jié)果熒光定量PCR、抗酸染色法檢測結(jié)核分枝桿菌的特異性分別為100%、30%。結(jié)論熒光定量PCR是一種快速、敏感性高、特異性強的結(jié)核分枝桿菌輔助診斷方法,具有重要的應(yīng)用價值?！娟P(guān)鍵詞】結(jié)核;分枝桿菌;抗酸染色;熒光定量PCREstablishmentandapplicationoffluorescencequantitativePCRfordetectionofMycobacteriumtuberculosis.ZHUYu-lan,WANGDian-peng,GAOZhao-xian,etal.InternationalTravel AgencyHealthCareCenter, ShenzhenEntryandExitInspectionandQuarantineBureau,Shenzhen518033,Guangdong,P.R.ChinaAbstract：Objective ToconstituteamethodfordetectionofMycobacteriumtuberculosisbyfluorescencequantitativePCRandevaluatetheapplicationvalueoffluorescencequantitativePCRindetectionofMycobacteriumtuberculosisinsputum. Methods Theprimersandprobeweredesignedandconstitute astandards.The suptumsamplesfrom102tuberculosispatientsand45non-tuberculosispatientsweredetectedbyfluorescencequantitativePCRandacid-faststain.Results The positive rates and specificity of fluorescence quantitative PCR, acid-faststain,were100%and30%respectively. Conclusion FluorescencequantitativePCRisarapidmethodfordiagnosisoftuberculosis,whichshowsahighspecificityandsensitivity.Itisausefultoolfordiagnosisoftuberculosisinthefuture.Key words：Tuberculosis; Mycobacterium tuberculosis; Acid-fast stain; quantitativePCR結(jié)核病是嚴(yán)重危及全球的公共衛(wèi)生問題之一，自1985急劇上升，據(jù)世界衛(wèi)生組織報道，目前全球有近1/3的人感染了結(jié)核桿菌，即20億人口感2000800～1000年約有300萬人死于結(jié)核病～3。結(jié)核病已成為導(dǎo)致全世界成人因傳染病而死亡的主要疾病之一。我國是全球22個結(jié)核病高發(fā)國家之一，活動性肺結(jié)核病人數(shù)居世界第二位。據(jù)2000年全國結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查估計，全國現(xiàn)有活動性肺結(jié)核病人450萬，其中傳染性肺結(jié)核病人150［4。結(jié)核病防治是我國乃至全球疾病防治的重要課題。目前，出入境人員體檢診斷傳染性肺結(jié)核的主要方法是通過胸部X片檢查，加上痰涂片抗酸染色鏡檢和PPDXPPD試驗的特異性不強，不能作為確診肺結(jié)核PCR檢測結(jié)核分枝桿菌敏感性達到100％，本研究以熒光PCR下。材料與方法材料確診肺結(jié)核病人培養(yǎng)涂陽的結(jié)核痰液標(biāo)本102份。正常人的痰液25份，葡萄球菌、肺炎鏈球菌、肺炎克雷伯球菌痰液標(biāo)本共計20份。引物與探針根據(jù)對NCBI數(shù)據(jù)庫結(jié)核桿菌基因序列分析，找出其保守序列，并且在此區(qū)域應(yīng)用Primer5.0和Primerexpress3.0軟件設(shè)計引物與探針，探針的5’端標(biāo)以熒光發(fā)射基團FAM標(biāo)記，靠近 3’端標(biāo)以熒光淬滅基團 TAMRA標(biāo)記 (表 1)。ForwardPrimer：5’TAGGCGTCGGTGACAAAGGe5；：5。儀器ABI公司的ABI7500熒光Real－timePCR儀。DNA痰液樣品的預(yù)處理吸取待測痰液200μl放入1.5ml的eppendo管中，加入5mol/LNaOH500μl，混勻，室溫中搖動20min。加入1mol/LNaH2PO4700μl，10000rmp離心5min。TE至102μl濃度為50mg/ml3℃消化30mi。DNA細胞復(fù)合裂解液置65℃水浴中，使其中的結(jié)晶溶解。將300μl結(jié)晶已溶解的細胞復(fù)合裂解液加入到上述預(yù)處理好的痰液樣品中2065℃水浴中反應(yīng)20min加入200μl5～616000rmp離心3min16000rmp離心3min，傾去上清。加入200μl70000rmp離心3min。吸去70％乙醇，倒置離心管于干凈的濾紙上，乙醇揮發(fā)完全，加入30μlDNA溶解液，快速漩渦震蕩1～2DNA完全溶解。標(biāo)準(zhǔn)品的制備DNA樣品2μl做為PCR反應(yīng)的模板，加入PCR反應(yīng)液23μl，PCR反應(yīng)液中含有10xPCRBuffer3μl、25mmol/LMgCl21.2μl10mmol/LdNTPs3μl、4U/μlTaqDNA聚合酶0.5μl及10pmol/L上、下游引物各，滅菌雙蒸水13.3μl。于PT-200PCR擴增儀進行如下循環(huán)：先94℃預(yù)變性4min；然后94℃℃?zhèn)€循環(huán)；最后72℃延伸10minPCR產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖電泳，凝膠回收試劑盒回收PCR電泳產(chǎn)物，與線性化后的pMD18-T載體（Invitrogen公司℃下連接12～16h，連接反應(yīng)體系中含有PCR凝膠回收產(chǎn)物5μlpMD18-T載體1μl和T4連接酶物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5ɑ，轉(zhuǎn)化后的細胞涂布于含有氨芐青霉素抗性的1.5％瓊脂固體LB12～16h，用滅菌牙簽挑取單克隆，接種于含50mg/ml氨芐青霉素的5ml液體LB培養(yǎng)基中，搖床371.6ml經(jīng)PCR初步鑒定，對陽性克隆進行測序分析，將篩選出的陽性菌株進一步擴增，抽提質(zhì)粒DNA4次，每次重復(fù)4管，取均值)，并進行10倍系列稀釋，得到濃度分別為108107106105copies／ml的4個標(biāo)準(zhǔn)品，即為陽性定量Taq-manPCR及反應(yīng)條件反應(yīng)液總體系為20μl，每份反應(yīng)液中含有2×Probe－PCRMasterMix)各0.5μl(10μmol/μl)0.2μl，滅菌水6.8μl，結(jié)核桿菌陽性DNA樣品2μl。反應(yīng)條件為:95℃15min(×1)，10s→60℃20s→72℃30s(×40)。按照上述反應(yīng)體系及反應(yīng)條件，隨著PCR坐標(biāo)、吸光值為縱坐標(biāo)的定量曲線和以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。瓊脂糖凝膠電泳，測序?qū)崟rPCR產(chǎn)物2％瓊脂糖凝膠電泳，電壓100V，時間1h。ABI3130基因分析儀序列分析。特異性實驗分別用陰性痰標(biāo)本提取物25份和金黃色葡萄球菌DNA提取物、肺炎鏈球菌DNA提取物、肺炎克雷伯桿菌DNA提取物共20份為對照模板進行Taq-man探針進行實時PCR檢測。檢測限實驗對陽性樣本以10倍梯度進行稀釋，共5個稀釋度，最大稀釋倍數(shù)為10萬倍，然后以各稀釋液為模板進行實時PCR檢測。重復(fù)性實驗對107標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)測定4組10倍倍比稀釋陽性DNA五次,分別統(tǒng)計其Ct值。靈敏度實驗對102例痰液標(biāo)本分別進行抗酸染色顯微鏡檢測和實時PCR檢測。結(jié)果定量曲線各個稀釋度標(biāo)準(zhǔn)陽性株在第一個循環(huán)結(jié)束后測到一個基礎(chǔ)吸光值，接下來一直到第20個循環(huán)結(jié)束時都沒有明顯變化。從第23個循環(huán)(Ct36個循環(huán)前后達到峰值，隨后進入平臺期，一直到反應(yīng)結(jié)束。陰性對照未出現(xiàn)擴增曲線（圖。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果痰液DNA進行驗證實驗，對所獲取的PCR產(chǎn)物進行測序，序列分析顯示該產(chǎn)物為TB核酸序列。特異性實驗葡萄球菌等呼吸道易感菌的DNA提取物為對照模板進行Taq-man探針進行實時PCR未檢測到無熒光信號。檢測限實驗10Taq-man探針進行實時PCR檢測，熒光信號隨樣本濃度下降而下降，線性范圍為10～107copies/ll重復(fù)性實驗重復(fù)測定410Ct平均值分別是，標(biāo)準(zhǔn)差分別是，變異系數(shù)分別是3.94.3%、1.66.9%，隨著標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的降低，Ct值增大，標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)也呈逐漸增大的趨勢。2.6靈敏度實驗對確診肺結(jié)核病人102例痰液標(biāo)本分別進行直接涂片染色法和實時PCR檢測結(jié)果對比。直接涂片染色法檢測靈敏度為30％。熒光PCR檢測靈敏度為100％。討論肺結(jié)核的實驗室快速診斷對出入境人員傳染性肺結(jié)核的發(fā)現(xiàn)有重要的意義，目前，肺結(jié)核的實驗室診斷方法主要有細菌學(xué)檢查、免疫學(xué)檢查和分子生物學(xué)檢查。細菌學(xué)檢查是目前傳染性肺結(jié)核診斷的金標(biāo)準(zhǔn)145～8BACTEC是采用放射性同位素技術(shù)對結(jié)核菌進行自動檢測的儀器，使培養(yǎng)分枝桿菌可以把培養(yǎng)時間大大縮短，需9～14d。分枝桿菌生長指示管）使用熒光計量技術(shù)檢測分枝桿菌的生長，無污染，陽性率高15,1是快速培養(yǎng)的主流。實驗室檢測結(jié)核分枝桿菌是臨床結(jié)核病診斷的主要依據(jù)方法為直接涂片法和培養(yǎng)法20，但直接涂片法存在特異性差、靈敏度低和不能鑒別抗酸菌驗中102例標(biāo)本實時PCR陽性102例(102%)，而直接涂片法只有30例(30%)。實時PCR法與抗酸染色法比較符合率為100PCRPCRPCR檢測原理為TaqMan探針法，是在反應(yīng)體系中加入一個熒光標(biāo)記探針，探針的5′端標(biāo)以熒光發(fā)射基團FAM，3′端標(biāo)以熒光猝滅基團TAMRAPCR過程中，利用Taq酶的5′→3′外切核酸PCR采用閉管操作，克服了常規(guī)PCR的污染問題，使其具有很高的特異性。實時PCR技術(shù)盡管有少數(shù)假陽性的結(jié)果，但其與常規(guī)細菌學(xué)方法互補使用可提高陽性檢出率，仍不失為靈敏度高、特異性強的結(jié)核病輔助診斷的有效方法之一。本研究結(jié)果顯(30%5×103)～(1×104PCR檢測法陽性率明顯高于抗酸染色法和改良羅氏培養(yǎng)法，且特異性為100%，這和熒光定量PCR的原理和它所采用的一系列新技術(shù)密切相關(guān)。尤其是結(jié)核病患者經(jīng)藥物治療或體內(nèi)出現(xiàn)了細胞壁缺損的L型細菌導(dǎo)致分離培養(yǎng)結(jié)果呈陰性時，此方PCR可以做到相對定量，且定量結(jié)果可以指導(dǎo)臨床用藥和療效評估。實時PCR檢測結(jié)核抗酸桿菌DNA每毫或)培養(yǎng)陽性的標(biāo)本實時PCR檢測為陰性。實時PCR是臨床上廣泛應(yīng)用的一種基因定量檢測供了有力參考6?！緟⒖嘉墨I】LethderWerfMW.PrevalenceoftubercμLousinfectionandincidenceoftubercμLosis:are-assessmentoftheStyblorμLe［J］.BμLlWorldHealthOrgan,2008,86(1):20～26.［2o，n，nt.ddetectionofmμLosisinPeruvianchildrenbyuseofaheminestedIS6110polymerasechainreactionassay［J］.ClinInfectDis,2003,36:16～23.［3］NegiSS，BasirSF，GuptaS.Comparisonoftheconventionaldiagnosticmodalities，BACTECcμLture