基于成份和遺傳多樣性的明黨參動態(tài)

基于成份和遺傳多樣性的明黨參動態(tài)質(zhì)量評價體系的構(gòu)建

研究計劃執(zhí)行情況概述項目基本按照原計劃執(zhí)行，內(nèi)容略有增加：1.高效液相色譜技術(shù)（HPLC）分析了不同產(chǎn)地、不同個體明黨參化學(xué)成分合成之間的差異，探索了遺傳背景變異和化學(xué)成分合成之間的關(guān)聯(lián)。2.擴增片段長度多愛性的方法（AFLP）研究了不同產(chǎn)地、不同個體明黨參遺傳背景之間的差異。3.考慮到明黨參分布位置復(fù)雜，影響明黨參化學(xué)成分積累的因素很多，擴大取樣多研究結(jié)果的準確性和示范性具有更好的幫助，所以課題額外應(yīng)用“中藥材產(chǎn)地適宜性分析地理信息系統(tǒng)”(TCMGIS)對明黨參ChangiumsmymioidesWolff.在全國的生態(tài)適宜區(qū)進行分析和預(yù)測，為以后研究的樣品選擇提供一定基礎(chǔ)。研究工作主要進展和所取得的成果一、HPLC分析不同產(chǎn)地，不同個體化學(xué)成分的含量差異二、AFLP分析不同產(chǎn)地，不同個體遺傳背景差異一、HPLC分析不同產(chǎn)地，不同個體化學(xué)成分的含量差異1.實驗材料：選擇明黨參主要種植地域江蘇句容和野生明黨參分布區(qū)域安徽丫山作為不同產(chǎn)地樣品，分析成分含量差異。同時在不同產(chǎn)地內(nèi)部隨機選擇不同植株作為不同個體分析化學(xué)成分含量差異。2.實驗方法：水溶性成分HPLC分析，供試液制備：精密稱取1.000g明黨參根粉末，加水5mL,浸泡2h后,超聲提取30min,濾過,得到供試品溶液。色譜條件:C18反向色譜柱(4.6mm×250mm,5μm),流動相乙腈-0.025%磷酸洗脫，洗脫梯度見表1。流速0.8mL·min-1，進樣量25μL。t/min乙腈/%0.025%磷酸水/%04961349663257580496表1HPLC梯度洗脫程序3.不同產(chǎn)地和個體的化學(xué)成分組成和含量差異色譜圖及計算結(jié)果如下：圖1江蘇句容植株1化學(xué)成分液相色譜圖圖2江蘇句容植株2化學(xué)成分液相色譜圖圖3江蘇句容植株3化學(xué)成分液相色譜圖圖4江蘇句容植株4化學(xué)成分液相色譜圖圖5江蘇句容植株5化學(xué)成分液相色譜圖圖6安徽丫山植株1化學(xué)成分液相色譜圖圖7安徽丫山植株2化學(xué)成分液相色譜圖圖8安徽丫山植株3化學(xué)成分液相色譜圖圖9安徽丫山植株4化學(xué)成分液相色譜圖圖10安徽丫山植株5化學(xué)成分液相色譜圖4.從中選擇5種共有化學(xué)成分進行含量（峰面積）差異分句容丫山植株1植株2植株3植株4植株5植株1植株3植株3植株4植株5峰數(shù)34282435233654263431成分16.1788.3777.03210.6954,4717.42110.49410.9446.8884.414成分221.46133.25728.51320.30836.49016.17418.58631.9279.32616.123成分320.59441.23325.25921.07943.64127.38520.45045.1309.35316.821成分428.47715.04713.45838.08618.32821.57570.03214.32120.23217.707成分559.51769.82651.54743.85273.15672.896117.42864.28511.68816.414

二、AFLP分析不同產(chǎn)地，不同個體遺傳背景差異

1.明黨參基因組DNA提取根據(jù)UniversalGenomicDNAExtractionKitVer.3.0（Takara公司產(chǎn)品）方法提取明黨參總DNA，用TE溶解DNA，待用。

2.DNA濃度與質(zhì)量測定用eppendorf的Biophotometer6131測定樣品DNA濃度(OD值)。以1.0%瓊脂糖凝膠檢測DNA主帶質(zhì)量：5μLDNA樣品+1μL10×上樣緩沖液，于5V/cm電壓下電泳80min，EB染色，紫外燈下觀察、拍照。所得DNA樣品的主譜帶清晰，無拖尾、降解現(xiàn)象。紫外分光光度計測定結(jié)果:A260/A280值在1.8左右，濃度在100～400ng/μL。圖11

圖11明黨參基因組DNA電泳圖1：明黨參基因組DNA；M15000：DL15000

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3AFLP方法的建立

AFLP體系及程序參照Vos等方法并略有改動。3.1酶切反應(yīng)

DNA用EcorⅠ和MseⅠ（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）酶切，37℃3小時，65℃2小時。反應(yīng)體系：DNA200ng，10×Buffer2μL，MseⅠ0.3μL（10U·μL-1），EcorⅠ0.25μL（10U·μL-1），加ddH2O至總體積10μL。3.2連接反應(yīng)酶切產(chǎn)物在連接酶的催化下和接頭連接，16℃過夜。反應(yīng)體系：酶切產(chǎn)物5μL，Buffer1μL，MseⅠ接頭（50μmol·L-1，5′-GACGATGAGTCCTGAG-3′，5′-TACTCAGGACTCAT-3′）0.5μL，EcorⅠ接頭（5μmol·L-1，5′-CTCGTAGACTGCGTACC-3′，5′-AATTGGTACGCAGTC-3′）0.5μL，加ddH2O至總體積10μL。3.3預(yù)擴增反應(yīng)體系預(yù)擴增條件：94℃變性3min；94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min（26個循環(huán)）；72℃延伸5min。反應(yīng)體系：模板1μL，EcorⅠ（100ng·L-1，5′-GACTGCGTACCAATTC-3′）預(yù)擴引物0.3μL，MseⅠ（100ng·L-1，5′-GATGAGTCCTGAGTAA-3′）預(yù)擴引物0.3μL，Buffer2μL，dNTP（10mmol·L-1）0.4μL，MgCl2（25mmol·L-1）1.2μL，Tag酶（5u·μL-1）0.2μL，加ddH2O至總體積20μL。圖12預(yù)擴增電泳圖12：明黨參預(yù)擴產(chǎn)物；M2000：DL2000Marker

3.4優(yōu)化選擇性擴增反應(yīng)體系優(yōu)化選擇性擴增反應(yīng)條件，設(shè)立模板濃度梯度、酶離子濃度梯度、dNTP濃度梯度，擴增結(jié)果電泳檢測。選擇性擴增條件：94℃變性3min；94℃變性30s，65℃退火30s（每次循環(huán)下降0.7℃），72℃延伸1min（13個循環(huán)）；94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min（24個循環(huán)）；72℃延伸5min。反應(yīng)體系：EcorⅠ（100ng·L-1，5′-GACTGCGTACCAATTCNNN-3′）選擴引物0.25μL，MseⅠ（100ng·L-1，5′-GATGAGTCCTGAGTAANNN-3′）選擴引物0.25μL，Buffer2μL，Tag酶（5u·μL-1）0.2μL，加模板、酶離子、dNTP、ddH2O至總體積20μL。3.5聚丙烯酰胺凝膠電泳分析依次量取30%聚丙烯酰胺12mL、5╳TBE6mL、10%過硫酸胺125μL、TEMED90μL，于燒杯中快速混勻（注意不產(chǎn)生氣泡）后，注入已安置妥當?shù)牟ＡО逯g，插好梳子，膠充分凝結(jié)后待用。40W恒功率預(yù)電泳0.5h，在選擇性擴增產(chǎn)物中按5：3加入loadingbuffer（98%甲酰胺，10mmol/LEDTA，0.125%溴酚藍，0.125%二甲苯氰），95℃變性8min，取出后立即置于冰浴中以防復(fù)性。60W恒功率電泳約2.5h。3.6銀染檢測電泳后的銀染檢測程序參照Bas-sam等方法。將有凝膠的短玻璃板放在2L10%冰醋酸中，輕搖約30min，至二甲苯氰顏色褪去。用超純水沖洗3次，每次2min。放入2L銀染液中輕搖，注意避光，以免硝酸銀見光分解，染色30~40min。用超純水迅速沖洗玻璃板10sec，然后放入2L預(yù)冷的顯色液中，輕搖至條帶顯現(xiàn)。在背景尚未變深時用10%冰醋酸終止顯色，漂洗，室溫干燥。數(shù)碼相機拍攝銀染結(jié)果。聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測不同模板濃度、酶離子濃度、dNTP濃度對選擇性擴增反應(yīng)的影響。結(jié)果表明：以1μL稀釋10倍的預(yù)擴增產(chǎn)物作為模板、1.5mmol·L-1MgCl2、0.6mmol·L-1dNTP進行選擇性擴增反應(yīng)獲得DNA片段分子量范圍較廣（圖13）。圖13選擇性擴增產(chǎn)物聚丙烯酰胺凝膠電泳圖模板濃度梯度（1.0.1μL；2.0.2μL；3.0.5μL；4.1μL；5.2μL）；MgCl2濃度梯度（6.1.0mmol·L-1；7.1.2mmol·L-1；8.1.5mmol·L-1；9.1.8mmol·L-1；10.2.0mmol·L-1）；dNTP濃度梯度（1.0.1mmol·L-1；2.0.2mmol·L-1；3.0.4mmol·L-1；4.0.6mmol·L-1；5.0.8mmol·L-1）4.AFLP研究不同產(chǎn)的和植株明黨參遺傳背景差異

AFLP研究結(jié)果表明遺傳背景差異上不同產(chǎn)地的明黨參顯著大于相同產(chǎn)地不同植株之間。遺傳距離和化學(xué)成分合成之間具有一定的相關(guān)性。

句容1句容2句容3句容4句容5丫山1丫山2丫山3丫山4丫山5句容1

0.00860.00630.01100.00820.01440.01860.01760.01370.0182句容20.0086

0.00790.00830.00920.01390.01370.01960.01340.0127句容30.00630.0079

0.00640.00810.00970.01240.01620.00850.0115句容40.01100.00830.0064

0.00730.01460.01280.00790.01180.0147句容50.00820.00920.00810.0073

0.01820.01190.01680.00730.0147丫山10.01440.01390.00970.01460.0182

0.00920.00970.00430.0052丫山20.01860.01370.01240.01280.01190.0092

0.00830.00790.0068丫山30.01760.01960.01620.00790.01680.00970.0083

0.00870.0067丫山40.01370.01340.00850.01180.00730.00430.00790.0087

0.0084丫山50.01820.01270.01150.01470.01470.00520.00680.00670.0084

目前國內(nèi)學(xué)者對明黨參的研究大多集中于分類學(xué)、生物學(xué)特性、藥用及化學(xué)成分、系統(tǒng)進化的研究。迄今為止，有關(guān)明黨參遺傳背景的研究十分缺乏，僅有零星報道。進行植物遺傳多樣性研究的分子標記方法很多，其中AFLP技術(shù)效果最佳。AFLP操作過程繁瑣，而不同的研究材料有著不同的特性，所以在進行明黨參遺傳多樣性的AFLP標記分析時，建立最佳的反應(yīng)體系是必不可少的基礎(chǔ)性工作。在PCR擴增反應(yīng)中，Mg2+終濃度不僅影響TaqDNA聚合酶的活性，還能與dNTP、模板及引物結(jié)合，從而影響模板的解鏈溫度、引物與模板的結(jié)合效率以及產(chǎn)物的特異性。dNTP是AFLP反應(yīng)的原料，dNTP濃度過高，導(dǎo)致擴增反應(yīng)中模板與引物的錯配，使擴增出現(xiàn)非特異性，濃度過低又會影響擴增效率。因此，對于dNTP的最適用量也是需要經(jīng)過對比分析才能確定的。所以本研究重點對Mg2+終濃度、dNTP濃度、模板用量進行了梯度對照，篩選到了最佳用量配比。擴增產(chǎn)物必須與完善的凝膠檢測手段結(jié)合，才會產(chǎn)生理想的AFLP指紋，選用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)合銀染檢測的方法具較強實用性，是一般實驗室可以考慮的方案。本文通過對AFLP分析過程選擇性擴增反應(yīng)體系的優(yōu)化，確定了適宜明黨參PCR擴增以及變性聚丙烯酰胺凝膠電泳-銀染檢測分析的最佳反應(yīng)條件，獲得了理想的指紋圖譜，為研究明黨參遺傳多樣性及其種質(zhì)資源保護等提供了良好的技術(shù)保障。。存在的問題、縱深研究的建議及其他需要說明的情況建議以部分常用大宗藥用植物為模式加強藥用植物化學(xué)成分尤其是有效成分積累與遺傳背景以及環(huán)境因子之間的關(guān)系研究，探索藥用植物有效成分積累的規(guī)律，為藥用植物的有效利用提供一定的理論基礎(chǔ)。論文、出版專著目錄1.基于TCMGIS的明黨參產(chǎn)地適宜性研究，安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，已接受（接收函見附件）2.IdentificationofDifferentiallyExpressedGenesInvolvedintheEarlyBoltingofAngelicasinensis(Oliv.)