生物化學(xué)第二章 核酸的結(jié)構(gòu)

第二章核酸的結(jié)構(gòu)與能

StructureandFunctionofNucleicAcid第一節(jié)核酸的化學(xué)組成及一級(jí)結(jié)構(gòu)第二節(jié)DNA的空間結(jié)構(gòu)與功能第三節(jié)RNA的結(jié)構(gòu)與功能第四節(jié)核酸的理化性質(zhì)及應(yīng)用第五節(jié)核酸酶概述核酸(nucleicacid)

以核苷酸為單位組成的生物大分子攜帶和傳遞遺傳信息核酸的研究歷史和重要性1869年

Miescher從膿細(xì)胞的細(xì)胞核中分離出核素（nuclein），后稱核酸（nucleicacid）；1944

Avery

等成功進(jìn)行肺炎球菌轉(zhuǎn)化試驗(yàn)；1952年Hershey等的實(shí)驗(yàn)：

32P-DNA，35S-蛋白質(zhì)(外殼)，再用標(biāo)記的噬菌體去感染培養(yǎng)的大腸桿菌，證明DNA是遺傳物質(zhì)。蛋白質(zhì)(外殼)1953Watson和Crick建立了DNA結(jié)構(gòu)的雙螺旋模型，說明了基因的結(jié)構(gòu)、信息和功能三者間的關(guān)系，推動(dòng)了分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展。WatsonandCrick19531990s

1958

Crick提出遺傳信息傳遞的中心法則。

DNARNA蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯逆轉(zhuǎn)錄

70年代建立DNA重組技術(shù)，改變了分子生物學(xué)的面貌，并導(dǎo)致生物技術(shù)的興起。

80年代

RNA研究出現(xiàn)第二次高潮：ribozyme、反義RNA、“RNA世界”假說等等。

90年代以后

實(shí)施人類基因組計(jì)劃（HGP）,開辟了生命科學(xué)新紀(jì)元。生命科學(xué)進(jìn)入后基因時(shí)代：功能基因組學(xué)（functionalgenomics）

蛋白質(zhì)組學(xué)（proteomics）

結(jié)構(gòu)基因組學(xué)（structuralgenomics）

RNA組學(xué)（Rnomics）或核糖核酸組學(xué)（ribonomics）60年代

RNA研究取得大發(fā)展（操縱子學(xué)說，遺傳密碼，逆轉(zhuǎn)錄酶）。核酸的種類、分布種類

脫氧核糖核酸（DNA）：主要的遺傳物質(zhì)。核糖核酸（RNA）

tRNA

(15%)

mRNA

(3-5%)

rRNA

(80%)

其它RNA：如反義RNA等分布DNA原核生物真核生物擬核質(zhì)粒染色體（質(zhì)）細(xì)胞器：如線粒體、葉綠體等RNA：核內(nèi)（snRNA、hnRNA

）、胞質(zhì)(scRNA)、細(xì)胞器

病毒第一節(jié)核酸的化學(xué)組成及其一級(jí)結(jié)構(gòu)TheChemicalComponentandPrimaryStructureofNucleicAcid一、元素組成有C、H、O、N、P等一般不含元素SP元素的含量較多并且恒定，約占9～11%

二、核苷酸酸A鳥嘌呤GCTU（一）堿基1.種類：稀有堿基種類很多，大部分是上述堿基的甲基化產(chǎn)物。1）堿性

嘌呤堿基和嘧啶堿基都具有弱堿性。環(huán)內(nèi)氨基的pKa值約為9.5。堿性主要是環(huán)內(nèi)氨基的貢獻(xiàn)。堿基環(huán)外的氨基（存在于A、G和C）的堿性很弱，在生理pH條件下不能被質(zhì)子化。2.堿基的性質(zhì)：2）互變：酮式烯醇式氨基亞氨基3）紫外吸收：260nm220240260280300320nm481216胞嘧啶尿嘧啶胸腺嘧啶腺嘌呤鳥嘌呤消光系數(shù)波長(zhǎng)Ε×10-34）光聚合反應(yīng)

在DNA分子中，兩個(gè)相鄰胸腺嘧啶堿基，在紫外光照射下，可發(fā)生聚合反應(yīng)，破壞了正常復(fù)制或轉(zhuǎn)錄。

5）堿基環(huán)的親電取代反應(yīng)6）堿基環(huán)的親核加成反應(yīng)7）堿基環(huán)氮原子的烷基化反應(yīng)

8）環(huán)外氨基的反應(yīng)

9）環(huán)外氧的烷基化反應(yīng)（二）戊糖（四）核苷酸1.核苷(ribonucleoside)堿基和核糖（脫氧核糖）糖苷鍵N-9N-1C-1'（三）磷酸：NNNNOOHOHNH2HOCH2NNNH2OHOHOHOCH29111核苷：腺苷，鳥苷脫氧核苷：幾種稀有核苷假尿苷（）二氫尿嘧啶（DHU）AmCH3CH3H3Cm26GHH5HH2.核苷酸(ribonucleotide)核苷（脫氧核苷）磷酸磷酸酯鍵5C腺嘌呤核苷酸（AMP）Adenosine

monophosphate脫氧腺嘌呤核苷酸（dAMP）Deoxyadenosine

monophosphate鳥嘌呤核苷酸（GMP）胞嘧啶核苷酸（CMP）尿嘧啶核苷酸（UMP）脫氧鳥嘌呤核苷酸（dGMP）脫氧胞嘧啶核苷酸（dCMP）脫氧胸腺嘧啶核苷酸（dTMP)HOH

多磷酸核苷酸：NMP，NDP，NTPATPADPAMP環(huán)化核苷酸:cAMP，cGMPcAMP含核苷酸的生物活性物質(zhì)：

NAD+、NADP+、CoA-SH、FAD等都含有AMP肌苷酸及鳥苷酸(強(qiáng)力味精)IMP

GMP兩類核酸的基本成分核苷酸的連接

以3'，5'–磷酸二酯鍵連接三、核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)定義:核酸中核苷酸的排列順序，也稱為堿基序列。5′端3′端CGA多聚核苷酸的表示方式5′PdAPdCPdGPdTOH3′5′PAPCPGPUOH′

或5′ACGTGCGT3′5′ACGUAUGU3′

ACGTGCGTACGUAUGUDNA

RNAT5′3′OHU5′3′OHOHOHOHOH方向：？核酸分子的大小：寡核苷酸(oligonucleotide)<50多核苷酸（polynucleotide）>50第二節(jié)DNA的空間結(jié)構(gòu)與功能DimensionalStructureandFunctionofDNA一、DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)——雙螺旋結(jié)構(gòu)（一）DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的研究背景

20年代，Levene研究了核酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)并提出四核苷酸假說；

40年代末，Avery,Hershey和Chase的實(shí)驗(yàn)嚴(yán)密地證實(shí)了DNA就是遺傳物質(zhì)；

50年代初，Chargaff應(yīng)用紫外分光光度法結(jié)合紙層析等簡(jiǎn)單技術(shù)，對(duì)多種生物DNA作堿基定量分析，發(fā)現(xiàn)DNA堿基組成有如下規(guī)律：

不同生物來源的DNA四種堿基比例關(guān)系DNA來源腺嘌呤（A）胸腺嘧啶（T）鳥嘌呤（G）胞嘧啶（C）（A+T）/（G+C）大腸桿菌25.424.824.125.71.01小麥27.327.122.822.71.21鼠28.628.421.421.51.33豬：肝29.429.720.520.51.43胸腺30.028.920.420.7脾29.629.220.420.8酵母31.332.918.717.51.079(1)同一生物的不同組織的DNA堿基組成相同(2)同一種生物DNA堿基組成不隨生物體的年齡、營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)或者環(huán)境變化而改變；(3)幾乎所有的DNA：(A)=［T］，

(G)=［C］(4)不同生物來源的DNA堿基組成不同。Wilkins和Franklin的高質(zhì)量的X-衍射圖Watson,Crick

（1953）在Chargaff法則及Wilkins,Franklin的X線衍射工作基礎(chǔ)上提出DNA的雙螺旋（doublehelix）結(jié)構(gòu)模型。

2.0nm小溝大溝DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點(diǎn)：1.右手反平行雙螺旋；２.表面有大溝及小溝。螺旋一周包含10對(duì)堿基，螺距為3.4nm，直徑為2nm；３.磷酸和脫氧核糖骨架位于螺旋外側(cè)，堿基位于內(nèi)側(cè)。４.兩條鏈間存在堿基互補(bǔ)規(guī)律：

A與T或G與C配對(duì)５.螺旋的穩(wěn)定因素為氫鍵和堿基堆砌力。

逆向平行雙螺旋；內(nèi)有堿基配氫鍵；平行堿基堆積力；三個(gè)數(shù)字記心間。記憶：第一張DNA的照片（掃描隧道電鏡）DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)的意義揭示了DNA作為遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性特征確認(rèn)了堿基配對(duì)原則是遺傳信息傳遞和表達(dá)的分子基礎(chǔ)。DNA的種類A-DNA；B-DNA；B′-DNA；C-DNA；D-DNA；Z-DNA；（三）DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的多樣性（多態(tài)性）拓寬了人們的視野

真核生物染色體DNA是線型雙鏈DNA。

細(xì)胞器DNA、原核生物的染色體DNA、質(zhì)粒DNA都是環(huán)狀雙鏈補(bǔ)充知識(shí)：又稱H-DNA結(jié)構(gòu)：大溝中容納第三條鏈形成三股螺旋。三堿基體:T-A-T，C-G-C。作用：還不清楚。(一)三鏈DNA（triplehelixDNA）DNA分子內(nèi)的三鏈結(jié)構(gòu)多聚嘌呤多聚嘧啶DNA三鏈間的堿基配對(duì)T-A-TC-G-C(二)DNA不均一性1.DNA結(jié)構(gòu)的不均一性：

DNA分子中的四種堿基A，T，C，G非均勻分布。2.主要形式：

1）反向重復(fù)序列

2）富含A/T的序列反向重復(fù)序列(invertedrepeats)：又稱回文序列通常是作為一種特別信號(hào)富含A/T的序列：調(diào)節(jié)功能的DNA區(qū)段(三)嘌呤和嘧啶的排列順序?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)：5′GC3′與5′CG3′對(duì)雙螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響很大，前者的穩(wěn)定性遠(yuǎn)大于后者。二、DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)及其在染色質(zhì)中的組裝超螺旋結(jié)構(gòu)(superhelix

或supercoil)：

正超螺旋(positivesupercoil)盤繞方向與DNA雙螺旋方同相同負(fù)超螺旋(negativesupercoil)盤繞方向與DNA雙螺旋方向相反螺旋和超螺旋電話線螺旋超螺旋超螺旋的定量描敘White方程：L=T+WL（Linkingnnmber）：DNA中一條鏈繞另一條鏈的總次數(shù)。其特點(diǎn)是:(1)L是整數(shù)；(3)右手螺旋對(duì)L取正值。W（Writhingnumber）：超數(shù)旋數(shù)。其特點(diǎn)是：(1)可以是非整數(shù)；(2)是變量；(3)右手螺旋時(shí)，W取負(fù)值。T（Twistingnumber）：雙螺旋的圈數(shù)。其特點(diǎn)是：

(1)可以是非整數(shù)；

(2)是變量；

(3)右手螺旋時(shí)T為正值。超螺旋密度λ來表示：λ=（L-T）/T

在天然DNA中，λ約為-0.05DNA超螺旋結(jié)構(gòu)形成的意義:

使DNA形成高度致密狀態(tài)從而得以裝入核中；推動(dòng)DNA結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)化以滿足功能上的需要。（一）原核生物DNA的高級(jí)結(jié)構(gòu)在共價(jià)閉環(huán)雙螺旋基礎(chǔ)上進(jìn)一步扭轉(zhuǎn)盤曲,形成超螺旋(supercoil)體積進(jìn)一步壓縮。

原核雙鏈環(huán)狀DNA（dcDNA）病毒單鏈環(huán)狀DNA（scDNA）單鏈線性DNA（ssDNA）

細(xì)菌擬核（nucleoid

）的突環(huán)結(jié)構(gòu)RNA-蛋白質(zhì)核心突環(huán)由雙鏈DNA結(jié)合堿性蛋白質(zhì)組成平均一個(gè)突環(huán)含有約40kpDNA噬菌體T2結(jié)構(gòu)頭部頸圈尾部基板尾絲尖釘動(dòng)物病毒切面模式圖被膜（脂蛋白、碳水化合物）衣殼（蛋白質(zhì)）核酸突起（糖蛋白）病毒粒人基因組DNA3106

kbp。平均長(zhǎng)度為？怎樣存在于平均直徑為5μm的細(xì)胞核中?1.經(jīng)多級(jí)折疊形成1.4μm直徑，長(zhǎng)度小于5μm的染色體。2.染色體的基本結(jié)構(gòu)——核小體（二）真核生物DNA的空間結(jié)構(gòu)核小體的組成：DNA：約200bp組蛋白：H1H2A、H2BH3H4核小體(nucleosome)：

染色質(zhì)的基本組成單位，由DNA和組蛋白共同構(gòu)成。八聚體:H2A,H2B,H3,H4各兩分子雙螺旋DNA:繞其旋轉(zhuǎn)1.75圈,約含140bp核心顆粒H2BH2AH3H4a2a3a1a2a3a1a2a3a1a2a3a19L1L2aN第三章核酸H3H44helix-bundleH3H4H3’H4’4helix-bundleH4H2BH2AH4H2BH2AH3H4H2BH2AH3Diameter=110

Ao13H4H2BH2AH3Width=45Ao14DNA（2nm）核小體鏈（11nm）纖絲（30nm，每圈6個(gè)核小體）突環(huán)（150nm，每個(gè)突環(huán)大約75000bp）玫瑰花結(jié)（300nm，6個(gè)突環(huán)）螺旋圈（700nm，每圈30個(gè)玫瑰花）染色體（1400nm，

每個(gè)染色體含10個(gè)玫瑰花200bp）染色體四級(jí)組裝.mov三、DNA的功能1.基因（gene）：一段有功能的DNA片段，DNA分子的最小功能單位（交換單位）。攜帶遺傳信息2.基因組（genome）：某生物體（完整單倍體）所含全部遺傳物質(zhì)的總和。病毒SV405.1×103bp大腸桿菌5.7×106bp人3×109bp第三節(jié)

RNA的結(jié)構(gòu)與功能StructureandFunctionofRNARNA的種類、分布、功能細(xì)胞RNA通常都是線型單鏈病毒RNA有線型與環(huán)狀、雙鏈與單鏈種類繁多；分子量較小;單股鏈存在，可有局部二級(jí)結(jié)構(gòu)；含有尿嘧啶(uridin,U)而不含胸腺嘧啶稀有堿基較多；tRNA還具有明確的三級(jí)結(jié)構(gòu)；RNA的特點(diǎn)（與DNA相比）：一、信使RNA(messengerRNA)的結(jié)構(gòu)與功能特點(diǎn)：占細(xì)胞中總ＲＮＡ的１％－５％不均一分子有編碼序列與非編碼序列代謝活躍

1.原核生物mRNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)（1）５′端：翻譯起始序列３′端：翻譯終止序列（2）信息區(qū)：多個(gè)基因串聯(lián)（多順反子）少量的間隔序列5′3′順反子A順反子B順反子C插入順序插入順序先導(dǎo)區(qū)末端順序

a.５′端：帽子b.３′端：尾結(jié)構(gòu)c.信息區(qū)：一個(gè)基因信息（單順反子）2.真核生物mRNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)AAAAAAA-OH5′

“帽子”PolyA3′

順反子Am7G-5′ppp（1）核內(nèi)不均一ＲＮＡ（heterogeneousnuclearRNA，hnRNA）

真核生物ＤＮＡ轉(zhuǎn)錄生成mRNA時(shí)的初級(jí)轉(zhuǎn)錄物即成熟mRNA的前體。（2）帽子結(jié)構(gòu)：NN+NNOOCH3CH2OPOPOPOCH2BOOOPHOOCH2HOOOBOOOOOO55m7GpppNm（3）３′端尾結(jié)構(gòu)

20-250個(gè)多聚腺苷酸（polyA）

AAAA……An參與mRNA核內(nèi)向胞質(zhì)的轉(zhuǎn)移維系mRNA的穩(wěn)定性翻譯起始的調(diào)控（4）帽子結(jié)構(gòu)和多聚A尾的功能3.mRNA的功能：傳送遺傳信息DNAmRNA蛋白轉(zhuǎn)錄翻譯細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞核DNA內(nèi)含子外顯子轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄后剪接轉(zhuǎn)運(yùn)mRNAhnRNA翻譯蛋白1.tRNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：含10%~20%稀有堿基

3′末端為—CCA-OH5′末端大多數(shù)為pG二、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA的結(jié)構(gòu)與功能研究最多的是tRNA。tRNA.swf2.tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)：三葉草型，四環(huán)五臂

（1）氨基酸臂：CCA-OH結(jié)構(gòu)，攜帶氨基酸（2）二氫尿嘧啶臂：DHU環(huán)（3）反密碼臂：反密碼子（4）額外臂：可變環(huán)，tRNA分類的標(biāo)志（5）TψC環(huán)臂：含稀有堿基TψC3.tRNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)---倒L型一端：CCA-OH一端：反密碼環(huán)拐角：TψC與5sRNA作用三、rRNA的結(jié)構(gòu)１.特點(diǎn)：①rRNA占細(xì)胞內(nèi)總RNA的60%②成熟rRNA為單鏈局部雙螺旋

③用沉降系數(shù)（S）表示大小18SrRNA2.rRNA的種類（根據(jù)沉降系數(shù)）真核生物5SrRNA5.8S

rRNA

28SrRNA18S

rRNA原核生物5SrRNA23SrRNA16S

rRNA70S80S50S30S60S40S31proteins23SRNA5SRNA21proteins16SRNA49proteins28SRNA5.8SRNA33proteins18SRNA3.保守序列：（1）16SrRNA的3′-端序列ACCUCCU，是mRNA的識(shí)別位點(diǎn)。（2）原核生物5srRNA/真核生物5.8srRNA的第43-47位的CGAAC識(shí)別tRNA中TΨC環(huán)。四、其他小分子RNA及RNA組學(xué)非mRNA小RNA(smallnon-messengerRNAs,snmRNAs)1.snmRNAs的種類：核內(nèi)小RNA、核仁小RNA、胞質(zhì)小RNA催化性小RNA、小片段干涉RNA

2.snmRNAs的功能：參與hnRNA和rRNA的加工和轉(zhuǎn)運(yùn)。研究細(xì)胞中snmRNAs的種類、結(jié)構(gòu)和功能。snmRNAs的表達(dá)具有時(shí)間和空間特異性。

3.RNA組學(xué)核酸的理化性質(zhì)ThePhysicalandChemicalCharactersofNucleicAcid第四節(jié)一、物理性質(zhì)1.性狀：RNA呈白色的粉末或結(jié)晶；

DNA則為疏松的纖維狀固體。2.溶解性：不溶有機(jī)溶劑，其鈉鹽易溶于水。

在0.14mol/L的NaCl溶液中DNA蛋白溶解度最低，RNA蛋白溶解度較大。3.粘性：DNA大于RNA。DNA粘度與分子形狀有關(guān)：

線形分子>不規(guī)則線團(tuán)分子>球形分子（1)DNA或RNA的定量OD260=1.0相當(dāng)于50μg/ml雙鏈DNA40μg/ml單鏈DNA（或RNA）20μg/ml寡核苷酸(2)判斷核酸樣品的純度DNA純品:OD260/OD280=1.8RNA純品:OD260/OD280=2.04.紫外吸收：260nm；2202402602800.10.20.30.4波長(zhǎng)（nm）光吸收123二、化學(xué)性質(zhì)：1.較強(qiáng)的酸性；2.核酸的兩性解離性及等電點(diǎn)由于核酸分子中的磷酸是一個(gè)中等強(qiáng)度的酸，而堿性（氨基）是一個(gè)弱堿，所以核酸的等電點(diǎn)比較低。

DNA的等電點(diǎn)為4～4.5

RNA的等電點(diǎn)為2～2.5

3．核酸的水解（1）酸或堿水解

在0.1mol/LNaOH溶液中，RNA幾乎可以完全水解，DNA在同樣條件下則不受影響。（2）酶水解DNA水解酶（DNases）RNA水解酶（RNases）核酸外切酶和核酸內(nèi)切酶二、DNA的變性(denaturation)1.定義：在某些理化因素作用下，DNA雙鏈解開成兩條單鏈的過程，一級(jí)結(jié)構(gòu)仍保持完好。加熱部分雙螺旋解開無規(guī)則線團(tuán)鏈內(nèi)堿基配對(duì)2.變性后其它理化性質(zhì)變化：OD260增高 粘度下降生物活性喪失浮力密度升高 比旋度下降3.熱變性解鏈曲線：Tm影響Tm值大小因素：（1）與分子中的G+C比例相關(guān)圖

Tm=69.3+0.41(G+C)%；Tm=4(G+C)+2(A+T)（2）與核酸分子的長(zhǎng)度相關(guān)（3）核酸純度、溶液離子強(qiáng)度、酸堿度等溶液的離子強(qiáng)度較低時(shí)，Tm值較低，DNA制劑不應(yīng)保存在離子強(qiáng)度過低的溶液中。圖三、DNA的復(fù)性與分子雜交DNA復(fù)性(renaturation)在適當(dāng)條件下，變性DNA的兩條互補(bǔ)鏈可恢復(fù)天然的雙螺旋構(gòu)象，這一現(xiàn)象稱為復(fù)性。退火(annealing)

熱變性的DNA經(jīng)緩慢冷卻后復(fù)性。低色效應(yīng)（hypochromiceffect）減色效應(yīng)2.影響DNA復(fù)性的因素（1）溫度和時(shí)間：（2）DNA復(fù)雜程度/濃度（3）陽離子濃度

3.DNA的變性和復(fù)性原理的應(yīng)用：核酸雜交與探針技術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction，PCR)不同來源的核酸經(jīng)變性和復(fù)性的過程，其中一些不同來源的核苷酸單鏈由于存在局部堿基互補(bǔ)片段，而在復(fù)性時(shí)形成雜化雙鏈（heteroduplex），此過程稱分子雜交。（1）核酸分子雜交(hybridization)

（2）核酸分子雜交的應(yīng)用1）研究DNA分子中某一種基因的位置2）定兩種核酸分子間的序列相似性3）檢測(cè)某些專一序列在待檢樣品中存在與否4）是基因芯片技術(shù)的基礎(chǔ)探針(Probe)定義：是標(biāo)記有放射性同位素如32P、35S或生物素標(biāo)記的一小段核苷酸單鏈，稱為探針。十?dāng)?shù)個(gè)至數(shù)百個(gè)。應(yīng)用：疾病的診斷。加熱退火Southern印跡法DNA分子片段限制性酶切割瓊脂糖電泳轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜與放射性標(biāo)記DNA探針雜交放射自顯影凝膠濾膜補(bǔ)充：核酸的分離純化、測(cè)定一、

分離核酸的一般原則1.兩個(gè)原則：①保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性；②排除其它分子的污染。2.要求①

樣品中不應(yīng)存在對(duì)酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和過高濃度的金屬離子；②其它生物大分子的污染應(yīng)降低到最低程度；③排除其它核酸分子的污染。3.注意事項(xiàng)①盡量簡(jiǎn)化操作步驟，縮短提取過程，以減少各種有害因素對(duì)核酸的破壞；②減少化學(xué)物質(zhì)對(duì)核酸的降解，為避免過酸、過堿對(duì)核酸鏈中磷酸二酯鍵的破壞，操作多在pH4～10條件下進(jìn)行；③防止核酸的生物降解。④

減少物理因素對(duì)核酸的降解，物理降解因素主要是機(jī)械剪切力，其次是高溫。

二、核酸分離純化的一般步驟破碎細(xì)胞→去除蛋白質(zhì)、多糖、脂類等生物大分子→→沉淀核酸→去除鹽類、有機(jī)溶劑等雜質(zhì)→純化干燥→溶解。三、核酸的測(cè)定方法1.紫外吸收法即可由下式計(jì)算樣品中的核酸含量：C=Mr×A260/ε×L其中：C為核酸的含量（mg/mL），Mr為相對(duì)分子質(zhì)量，A260為核酸溶液的吸光度，ε為摩爾消光系數(shù)（即1升溶液中含1摩爾核酸的光吸收值，L為比色杯的內(nèi)徑（cm）2.

定糖法

RNA的測(cè)定：.可在670-680nm波長(zhǎng)下進(jìn)行比色測(cè)定。

DNA的測(cè)定：.可在595-620nm波長(zhǎng)下進(jìn)行比色測(cè)定。核糖和脫氧核糖OHOH2COHOHOH12OHOH2COHOH12β-D-2-核糖β-D-2-脫氧核糖O核糖+H+糠醛甲基間苯二酚FeCl3綠色產(chǎn)物Δ脫氧核糖+H+

Δω-羥基-γ-酮戊醛二苯胺藍(lán)色產(chǎn)物RNA和DNA定性、定量測(cè)定3.

定磷法

RNA和DNA中都含有磷酸，可以進(jìn)行磷的測(cè)定。純的核酸中含磷量在9.5%左右，因此，測(cè)出核酸中的磷含量就可計(jì)算核酸的含量。測(cè)定時(shí)先將核酸用強(qiáng)酸消化成無機(jī)磷酸，后者與定磷試劑中的鉬酸反應(yīng)生成磷鉬酸，在經(jīng)過還原作用而生成藍(lán)色的復(fù)合物，最后在650-660nm進(jìn)行比色測(cè)定。4.核酸的凝膠電泳凝膠電泳是當(dāng)前核酸研究中最常用的方法，有瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳。前者常用于DNA的分離分析，后者用于RNA的分離分析。第五節(jié)

核酸酶

Nuclease1.依據(jù)底物不同分類：DNA酶(deoxyribonuclease,DNase)：RNA酶(ribonuclease,RNase)：2.依據(jù)切割部位不同：核酸內(nèi)切酶：限制性核酸內(nèi)切酶核酸外切酶：5′→3′或3′→5′核酸外切酶一、定義：核酸酶是指所有可以水解核酸的酶。二、分類5′AGCTTCAGGATA

3′

|||||||||||3′TCGAAGTCCTAGCGAC5′?核酸外切酶活性

GGATCCCCTAGG53CTGCAGGACGTC53CCCGGGGGGCCC53BamHIPstISmaIG3

5GATCCCCTAG53G5335CTGCA3

5GG3AC